Summary
Her presenterer vi prekliniske screening av anticancer coumarins 3D kultur og sebrafisk.
Abstract
I vitro og i vivo pre-klinisk screening av romanen terapeutiske agenter er et viktig verktøy i kreft stoffet funnet. Selv om menneskets kreftcelle linjer svarer terapeutiske forbindelser i 2D (dimensjonal) monolayer cellekulturer, ble 3D kultur systemer utviklet for å forstå effekten av legemidler i mer fysiologisk relevante modeller. De siste årene, ble et paradigmeskifte observert i pre-klinisk forskning å validere styrken på nye molekyler i 3D kultur systemer, mer presist mimicking svulst microenvironment. Disse systemene karakterisere sykdom staten i en mer fysiologisk relevante måte og bidra til å få bedre mekanistisk innsikt og forståelse av farmakologiske styrken på et bestemt molekyl. Videre med den nåværende trenden i å forbedre i vivo kreft modeller, sebrafisk har dukket opp som en viktig virveldyr modell å vurdere i vivo tumor formasjon og studere effekten av terapeutisk agenter. Her vi undersøkt terapeutiske effekten av hydroxycoumarin OT48 alene eller i kombinasjon med BH3 mimetics i lunge kreft cellen linje A549 ved hjelp av tre forskjellige 3D kultur systemer inkludert kolonien formasjon analyser (CFA), formet formasjon analysen (SFA) og i vivo sebrafisk xenografts.
Introduction
Kreft skyldes mobilnettet mutasjoner og som en konsekvens biokjemiske signalveier avbrutt utløser ukontrollert celledeling og motstand mot celledød. Svulster forstyrre fysiologiske funksjoner av fordøyelsessystemet, nervøs, sirkulasjons-systemer og deretter tilgrensende vev1. Til tross for omfattende forskningsinnsats er kreft den vanligste livstruende sykdommen i verden2. Precision medisin har blitt anerkjent som grunnlaget for fremtidige cancer therapeutics. Nye molekylær enheter er testet rutinemessig i kombinasjon med eksisterende rusmidler for å forbedre kliniske utfallet.
Imidlertid er en betydelig begrensningene knyttet til utviklingen av nye effektiv målrettet terapi svikt i brukte analyser for å simulere nøyaktig biologiske utfallet av narkotika eksponering3. Kreft stoffet funnet avhengig fortsatt hovedsakelig teste effekten av terapeutisk agenter i kreftcelle linjer kulturperler i 2D monolayer kulturer, som er vanskelig å validere i kliniske studier4. Derfor er det en økende interesse å utvikle bedre kreft modeller som bedre etterligner de opprinnelige funksjonene svulster i vivo5. De siste årene resulterte en økende interesse i 3D kultur modeller i utviklingen av bedre metoder for å produsere 3D svulst modeller5.
Her presenterer vi en tilnærming med tre ulike 3D celle kultur teknikker tillater for å forbedre forståelsen av styrken på hydroxycoumarin OT486 i kombinasjon med BH3 mimetics før mer i dybden i vivo analyser. Våre metoden består av kombinerer kolonien og SFAs med en i vivo svulst formasjonstestet basert på en sebrafisk modell å validere effekten av kombinasjonen av OT48 og BH3 mimetics i lungekreft cellene og overvåke kreft progresjon i en levende organisme.
Kolonien formasjon analyser brukes rutinemessig til å vurdere effekten av anticancer agenter for både solid samt blodkreft kreft. Analysen bestemmer muligheten for en celle spredning på ubestemt tid og danne kolonier7. Effekten av en anticancer agent på kolonien danner evnen til cellene bestemmes av redusering av siffer og/eller størrelsen på koloniene.
Spheroids representerer i vitro svulst modeller og tjene som en rimelig screening plattform for anticancer agenter. Spheroids er aggregater celleområde vokser i suspensjon eller innebygd i en 3D matrise. Denne tilnærmingen er mye brukt for narkotikarelaterte screening og studier av tumor vekst, spredning og immun samhandling8.
Å fullt ut forstå egenskapene til et nytt legemiddel, er det viktig å utføre eksperimenter i vivo på gnagere. Men er denne konvensjonelle metoden dyrt og tidkrevende. De siste årene ble sebrafisk (Danio rerio) en utbredt studert laboratorium organisme som er billigere og raskere å heve. Svulster utviklet i sebrafisk representerer en 3D celle kultur tilnærming, men i innstillingen i vivo for virveldyrenes9.
Sammen bruker vi her tre forskjellige 3D kultur tilnærminger inkludert CFAs, SFAs og sebrafisk i vivo tumor formasjon for å demonstrere anticancer kapasiteten til hydroxycoumarin OT48 i en lunge kreft A549 celle modell i kombinasjon med BH3 mimetics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kolonien formasjon analyser
- Kultur A549 celler i en konsentrasjon av 20.000 celler/cm2 i 15 mL RPMI1640 celle kultur medium med 10% FBS (Fetal Bovine Serum) og 1% antibiotika i en 75 cm2 bolle i en CO2 inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
- På dagen for eksperimentet, bestemme cellen konsentrasjonen ved hjelp av en hemocytometer. Samle 50 000 celler med sentrifugering 400 x g i 7 min i et 1,5 mL microcentrifuge rør og å suspendere celler i 100 µL av 1 x sterilt PBS (fosfat bufret saltvann) i 1,5 mL rør.
- Dispensere 1.1 mL halvfaste methylcellulose-baserte medium (MCBM) i 15 mL rør med en multipipette. Forberede en tube for hvert vilkår.
- Legge til 110 µL av FBS 1.1 mL MCBM bruker P200 brønnene.
- Frø celler på 1000 celler/mL. Samle 2,4 µL av cellen suspensjon fra lager løsning (50 000 celler i 100 µL av 1 x PBS) bruker P2 brønnene og legge til 1.1 mL av MCBM med 10% FBS.
- Legger til cellene, vortex rør for 1 min, holde dem vertikalt med høyeste hastighet til blandingen MCBM og celler.
- Legge til test forbindelser (OT48 alene eller i kombinasjon med A1210477). Forberede en separat rør som en kontroll for løsemiddelet brukes (her dimethyl sulfoxide (DMSO)). Avhengig av konsentrasjonen av forbindelser og volumet lagt for hver betingelse, inneholder løsemiddel kontrollen den høyeste konsentrasjonen av løsemiddelet brukes for fortynninger av testen sammensatte, for å vurdere for bivirkninger forårsaket av løsemiddelet.
- Vortex rør i 1 minutt.
- For hver analysen, legge 1 mL av blandingen med P1000 brønnene midten godt av en 12-vel celle kultur plate.
- Fylle tomme brønner med 1 mL steril vann eller 1 x PBS å stabilisere fuktighet.
- Inkuber kultur plater i 10 dager i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
- Etter 10 dager med inkubering, Legg 200 µL av en Flerbordsturnering (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide) lager løsning (5 mg/mL) hver brønn å nå en siste konsentrasjon av 1 mg/mL.
- Inkuber 10 min i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2. Levedyktig kolonier vil slå fiolett.
- Fange bildet med et digitalt kamera med hvit bakgrunn platen (LAS hvit dia brett). Bruk følgende innstillinger: metoden digitalisere; Eksponering type, precision; Eksponeringstid, manuell, en andre; Følsomhet/oppløsning, høy oppløsning. Lagre bildet i tiff-format.
- Kvantifisere levedyktig kolonier ved hjelp av ImageJ programvare. Velg meny "bilde | Type | 8 bit". Velg meny "Juster | Terskelen". Angi terskelen som styrer og holder konstant for alle forhold; Velg meny "analyser | Analysere partikler". Lagre og analysere med en statistikk programvare for grafisk fremstilling.
2. formet formasjon analysen
- Kultur A549 celler i en konsentrasjon av 20.000 celler/cm2 i 75 cm2 flasker med 15 mL RPMI 1640 medium med 10% FBS og 1% antibiotika.
- På dagen for eksperimentet, forberede en 96 vel U-bunnplaten.
- Plate 10.000 celler i en brønn som allerede inneholder sammensatte interesse (her 50 µM av OT48) og/eller 20 µM i A1210477. Juster endelige volumet til 100 µL av celle kultur medium. Antall celler som danner uniform spheroids med en intakt ytre grense anses tilstrekkelig til skjemaet spheroids.
- Inkuber for 3 dager i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
- Etter 3 dager med inkubering, ta bilder av spheroids med lys mikroskop med 4 x forstørrelse.
3. sebrafisk Xenograft analysen
Merk: Denne tekniske tilnærmingen er visualisert som en skjematisk (figur 1).
-
Utarbeidelse av lager reagenser
- Forberede 1 L 30 x Danieaus løsning: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (ingen3)2og 150 mM HEPES. Justere pH i bufferen til 7,6 bruker en pH-meter.
- Forberede 1% (50 x) tricaine løsning: oppløse 20 mg av ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) i 2 mL destillert vann.
- Forberede 1% fenol Red-PBS løsning: Legg 2 µL av fenol Red natrium salt løsning 198 µL sterilisert PBS løsning i et 1,5 µL rør.
- Forberede 3% methylcellulose: legge til 3 g av methylcellulose 100 mL 1 x Danieaus løsning.
-
Sebrafisk eggproduksjon og inkubasjon
- Egen en kvinnelig og en mannlig sebrafisk i en partisjon tank fylt med UV-sterilisert og filtrert vann på 28,5 ° C i mørket. Etter 24 timer av separasjon, bland fisk av begge kjønn å starte parring. Overføre befruktede egg fra parring tanken til en Petriskål inneholder 5 mL av fersk Danieau løsning.
- Vask egg tre ganger med 5 mL Danieau's. For å vaske, nøye Sug opp eggene med en pipette og overføring til 5 mL av frisk løsning. Inkuber 8 h på 28,5 ° C.
- Etter 8 timer med inkubering i Danieaus løsning, endre til Danieaus løsning som inneholder 0,03% 1-fenyl-2-thiourea (PTU) å hemme pigmentering. Sortere ut ugjennomsiktige egg (5mas eller inneholder uutviklet embryo) for å hindre forurensning.
-
Fosteret dechorionation
- 24 h legge befruktning (hpf), dechorionate sebrafisk embryo med skarpe tang. Inkuber klekking embryo i Danieaus løsning med 0,03% PTU på 28,5 ° C til 48 hpf.
-
Sammensatte behandlet celle forberedelse
- Frø A549 celler på 20.000 celler/cm2 i 25 cm2 kultur flasker. Etter 24 timer til såing, legger forbindelser (her OT48 på 50 µM og og/eller A1210477 på 20 µM) 24 h i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2. Definere behandling tid for hver sammensatte å opprettholde levedyktigheten til cellene, men å begå dem mot celledød. Denne gangen punkt må angis individuelt basert på celle levedyktighet, morfologi og molekylære markører.
- 2 h før slutten av behandlingen, beis celler med 4 µM av fluorescerende cellen bane fargestoff CM-Dil på 37 ° C og 5% CO2. Etter 2 timer med inkubering, trypsinize celler med 0,05% trypsin-EDTA, og fortynne 106 celler i 50 µL av fenol Red-PBS løsning før injeksjon.
-
Mikro-injeksjon av kreftceller for xenograft-formasjonen
- Bedøve sebrafisk i en 0.02% tricaine løsning for 5 min til de slå seg ned på en agar plate.
- Trekke en 1.0 mm (utenfor diameter (OD) glass kapillær) ved en brønnene avtrekker (Program innstillinger: P: 300, varme: 260, trekke: 60, VEL: 50, og tid: 200). Kutt i microcapillary med en sprøyte å produsere en skarp kant. Last microcapillaries med 20 µL av cellen/fenol Red-PBS løsning. Sette injeksjon press og tid til å dispensere 2 nL per injeksjon.
- Injisere 100-200 celler i plommesekken av sprøytebruk 6 til 10 nL via 3 til 5 injeksjoner. Etter injeksjon, tillate fisk å gjenopprette for 10 til 30 min i 5 mL av fersk Danieau løsning som inneholder PTU løsning. Forsendelse fisk i 24-vel plater med 1 mL av Danieaus løsning som inneholder PTU løsning er og ruge 72 h på 28,5 ° C.
- Etter 72 timer med inkubering, bedøve fisk i en 0.02% tricaine løsning og nakkens på et glass lysbilde med en dråpe 3% methylcellulose. Ta 5 x bilder av fluorescens mikroskopi på en bølgelengde på 620 til 750 nm.
- Kvantifisere størrelsen på fluorescerende svulster ImageJ programvare. Velg meny "analyser | Mål". Lagre verdier tilsvarer fluorescerende signalet og analysere med en statistikk programvare for grafisk fremstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2, lungekreft celle linje A549 ble sådd i MCBM til skjemaet kolonier etter behandling med OT48 alene eller i kombinasjon med BH3 mimetic A1210477 i de angitte konsentrasjonene. Resultatene viste at kombinasjonen betydelig redusert antall, størrelse og samlet areal på koloniene etter 10 dager med inkubering.
I Figur 3A549 celler ble behandlet med OT48 alene eller i kombinasjon med BH3 mimetic A1210477 og fikk skjemaet spheroids av U-Bunn platen teknikken. Etter 3 dager med inkubering, ble bilder av spheroids tatt. Kvantifisering av spheroids ble gjort ved hjelp av Image J og 3D bilder ble generert.
I Figur 4, ble A459 celler behandlet med OT48 alene eller i kombinasjon med BH3 mimetic A1210477 24 h og injisert i sebrafisk eggeplomme sac. Etter 72 h, kvantifisering av fluorescerende svulster samsvarer hemmende potensialet av sammensatt.
Figur 1: skjematisk diagram av prosessen til sebrafisk xenograft analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: synergistisk hemming av A549 kolonien dannelsen av hydroxycoumarin OT48 og BH-3 mimetic A1210477. (A) bilder av A549 kolonien formasjon analysen behandlet med 50 µM av OT48 og/eller 20 µM i A1210477. (B-D) Kvantifisering av antall, gjennomsnittlig størrelse og samlet areal på kolonier. Eksperimenter ble realisert i tre eksemplarer. Legge hoc analyser ble utført. Statistisk betydninger ble evaluert på p-verdier under 0,05 og representert av forklaringen nedenfor: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; legge hoc analyserer Dunnett; Sidak). Alle histogrammer representerer den gjennomsnittlig ± SD minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: effekten av OT48 og/eller A1210477 på kapasiteten til A549 celler til skjemaet spheroids. Bilder av A549 svulst spheroids etter 3 dager.
Figur 4: Hemming av A549 svulst masse dannelsen av et sammensatt. (A) bilder viser den hemmende effekten av OT48 eller A1210477 på svulst danner kapasitet CM-Dil-farget A549 celler. (B) kvantifisering av tumor formasjon. Legge hoc analyser ble utført. Statistisk betydninger ble evaluert på p-verdier under 0,05 og representert av forklaringen nedenfor: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; legge hoc analyserer Dunnett; Sidak). Alle histogrammer representerer den gjennomsnittlig ± SD minst ti uavhengig eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utbredelsen av kolonien dannelse med MCBM, avhenger av hvilken celle. Vanligvis for ikke-tilhenger celler, er antall koloniene mye høyere sammenlignet tilhenger celler. Vi observerte at A549 celler dannet 30 til 40 kolonier etter 10 dager. Tidligere har vi rapportert for ulike leukemi celler at antall koloniene er mellom 200 til 2509. Resultatene viste at OT48 alene ikke produserer en betydelig reduksjon av antall kolonier alene. Men i kombinasjon med BH3 ble mimetic A1210477 koloni danner evne til A549 celler synergi redusert. Tidligere rapporterte vi at en annen hydroxycoumarin derivater OT52 også synergized med BH3 mimetics å hemme kolonien danner evne til A549 celler. Den foreslåtte seeding konsentrasjonen varierer fra 1 x 103 1,5 x 103. CFA bruker MethoCult er en verdifull teknikk som rutinemessig brukes for å måle tumorigenesis i ulike kreftcelle linjer, men har noen begrensninger. Ofte utvinning av levedyktig kolonier etter eksperimentet er upraktisk, og cellene vokser ikke godt gang isolert fra MCBM og sådd i RPMI1640 medium. Likevel er det en godt akseptert pre-klinisk teknikk for å bedre forstå mekanismen av kreft i et 3D-miljø. 3D vekst betingelsene representere nøyaktig det naturlige miljøet på tumor formasjon i omgivelser i vivo . Men denne metoden er treg, arbeidskraft intensiv og ikke egnet for høy gjennomstrømning screening10.
SFAs utføres med tilhenger celler og vunnet bred popularitet i kreft stoffet funnet som de viser fysiologiske trekk som økt celle overlevelse, svulst morfologi og en hypoxic kjerne som er mer representativt for en i vivo -situasjonen 11,12. Den totale størrelsen, tekstur og integriteten til spheroids ved U-Bunn platen teknikken kan variere mellom linjer. Videre kan Start konsentrasjonen av celler som brukes til skjemaet spheroids også påvirke den generelle utviklingen. Resultatene viste at OT48 i kombinasjon med BH3 mimeticA1210477 hemmet spheroid integritet og redusert spheroid danner evne til A549 celler. Tidligere rapportert vi hemming av A549 spheroids av en hydroxycoumarin derivat i kombinasjon med BH3 mimetics9. Store fordelene med denne teknikken er reproduserbarhet og kostnader effektiviteten. Andre teknikker som flytende overlegg teknikken brukes rutinemessig å utvikle 3D spheroids av kreftceller. I denne teknikken vokse cellene på en ikke-tilhenger celle kultur parabol. Cellen klumper samles og plasseres i suspensjon kultur til skjemaet spheroids. Men er en av de store begrensningene forbundet med denne teknikken overføring av cellen klumper til suspensjon kultur, som ikke er godt tolerert av ulike linjer. For å øke gjennomstrømningen av sammensatte screening Fallsikringsblokken 3D kultur, utvikler noen selskaper bestemt underlag, lav vedlegg analysen tallerkener og stillaser forbedre dannelsen av 3D strukturer13. Med ytterligere tekniske fremskritt, vil utvikling av mer representativt 3D svulst modell gi en bedre forståelse av farmakologi i romanen forbindelser for en gitt type kreft.
Sebrafisk xenografts regnes som de mest kostnadseffektive dyr analyser rutinemessig brukes for anticancer narkotika utvikling9,14. Vi optimalisert sebrafisk i vivo systemet med ulike typer solid og Hematologisk kreft og pasient-avledet celler. Det er mange fordeler med å bruke sebrafisk for narkotikarelaterte screening. I prinsippet narkotika kan legges direkte inn i vannet og trenger ikke å være injisert. Dessuten, denne tilnærmingen gir også informasjon om de ADME (absorpsjon, distribusjon, metabolisme og ekskresjon) av et medikament kandidat. Men en av de store begrensningene av denne teknikken er noen molekyler er ikke vannløselige og derfor ikke umiddelbart passer undersøkes av denne metoden. For å overkomme denne begrensningen, ble kreftceller behandlet med forbindelser ex vivo sprøytes inn sebrafisk på et stadium der celler er opptatt, likevel opprettholde levedyktighet. Resultatene viste at A549 cellene behandlet med OT-48 eller med BH3 mimetic A1210477 alene ikke sterkt redusere svulsten danner evne til A549 celler sammenlignet med en kombinasjon av OT48 og A1210477. Denne observasjonen ytterligere bekreftet vår i vitro CFA der kombinasjonen viste signifikant anti-kreft effekt i forhold til enkelte behandlinger. Helt, denne teknikken kan bidra til rask screening av narkotika i preklinisk omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forskning ved SNU støttes av National Research Foundation (NRF) ved MEST av Korea for svulst Microenvironment Global Core Research Center (GCRC) stipend, [bevilgning nummer 2011-0030001]; ved Seoul National University Research Grant og hjernen Korea (BK21) pluss programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
