Summary
Aqui, apresentamos o rastreio pré-clínico de cumarinas anticâncer usando zebrafish e cultura 3D.
Abstract
Rastreio pré-clínico in vitro e em vivo de novos agentes terapêuticos são uma ferramenta essencial na descoberta da droga de cancro. Apesar de linhas de células cancerosas humanas respondem aos compostos terapêuticos em culturas de células 2D monocamada (dimensional), sistemas de cultura 3D foram desenvolvidos para compreender a eficácia de drogas em modelos mais fisiologicamente relevantes. Nos últimos anos, observou-se uma mudança de paradigma na pesquisa pré-clínica para validar a potência de novas moléculas nos sistemas de cultura 3D, mais precisamente, imitando o microambiente do tumor. Estes sistemas caracterizam o estado de doença de uma forma mais fisiologicamente relevante e ajudam a obter melhor visão mecanicista e compreensão da potência farmacológica de uma determinada molécula. Além disso, com a tendência atual na melhoria na vivo modelos de câncer, o zebrafish tem emergido como um importante modelo de vertebrados para avaliar a formação de tumor na vivo e estudar o efeito de agentes terapêuticos. Aqui, nós investigamos o efeito terapêutico de Hidroxicumarina OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimetics em linhagem de células de câncer de pulmão A549 usando três sistemas diferentes de cultura 3D, incluindo ensaios de formação de Colônia (CFA), ensaio de formação de esferoide (SFA) e na vivo xenografts zebrafish.
Introduction
Câncer é causada por mutações celulares e consequentemente sinalização de caminhos bioquímicos são rompidos, provocando a divisão celular descontrolada e resistência à morte celular. Tumores interferem com as funções fisiológicas do aparelho digestivo, nervoso, circulatório e posteriormente vizinhas tecidos1. Apesar dos esforços de pesquisa extensiva, cancro continua a ser a doença fatal mais prevalente no mundo2. Medicina de precisão tem sido reconhecida como o fundamento da terapêutica do câncer futuro. Novas entidades moleculares são testadas rotineiramente em combinação com drogas existentes para melhorar os resultados clínicos.
No entanto, uma das significativas limitações associadas com o desenvolvimento de novas terapias alvo eficientes é o fracasso dos ensaios comumente usados para simular o resultado biológico exato da droga exposição3. Descoberta de drogas câncer ainda principalmente se baseia em testar a eficácia de agentes terapêuticos em células cancerosas no culto em culturas 2D monocamada, que são difíceis de validar em ensaios clínicos4. Portanto, há um interesse crescente para desenvolver modelos de câncer melhor que melhor imitam as características nativas de tumores em vivo5. Nos últimos anos, um crescente interesse em modelos 3D cultura resultou no desenvolvimento de metodologias melhoradas para produzir tumor 3D modelos5.
Aqui, apresentamos uma abordagem com três técnicas de cultura celular 3D diferentes permitindo melhorar o entendimento da potência da Hidroxicumarina OT486 em combinação com BH3 mimetics anterior mais em profundidade no vivo ensaios. Nosso método consiste em combinar colônia e SFAs com um in vivo tumor formação teste baseado em um modelo de zebrafish de validar a eficácia da combinação de OT48 e BH3 mimetics em células de câncer de pulmão e monitorar a progressão do câncer na vida organismo.
Ensaios de formação de colônia são rotineiramente usados para avaliar a eficácia de agentes anticancerígenos para cânceres sólidos tanto hematopoiéticas. O ensaio determina a capacidade de uma célula para proliferar indefinidamente e formam colônias7. O efeito de um agente anticâncer sobre a capacidade das células formadoras é determinado pela diminuição do número e/ou tamanho das colônias.
Esferoides representam modelos de tumor em vitro e servem como uma plataforma de triagem de baixo custo para agentes anticancerígenos. Esferoides são agregados de células crescendo em suspensão ou incorporado em uma matriz 3D. Esta abordagem é amplamente utilizada para triagem de drogas e estudos de tumor crescimento, proliferação e imune interação8.
Para compreender as propriedades de um novo fármaco, é essencial para realizar experimentos na vivo em roedores. No entanto, esse método convencional é caro e demorado. Nos últimos anos, o peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um organismo de laboratório amplamente estudados que é mais barato e mais rápido para levantar. Tumores desenvolvem na abordagem de cultura de células no zebrafish representam um 3D, mas dentro do ambiente na vivo de um vertebrado9.
No total, aqui usamos três abordagens diferentes cultura 3D, incluindo APC, SFAs e zebrafish na vivo formação de tumor para demonstrar a capacidade anticancerígena de Hidroxicumarina OT48 em um modelo de célula do pulmão câncer A549 em combinação com mimetics BH3.
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Protocol
1. colônia formação ensaios
- Células de cultura A549 em uma concentração de 20.000 células/cm2 em 15 mL de RPMI1640 celular cultura suplementado com 10% FBS (soro Fetal bovino) e 1% antibióticos num balão de2 75 cm numa incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% de CO2.
- No dia do experimento, determine a concentração de células usando um hemocytometer. Coletar 50.000 células por centrifugação a 400 x g durante 7 min em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e ressuspender as células em 100 µ l de 1 x PBS estéril (fosfato Buffered Saline) em tubos de 1,5 mL.
- Dispense a 1,1 mL de meio de baseada em metilcelulose semi-sólidos (MCBM) em tubos de 15 mL com um multipipette. Prepare um tubo para cada condição.
- Adicione 110 µ l de FBS a 1,1 mL de MCBM utilizando uma micropipeta P200.
- Células de sementes a 1.000 células/mL. Coletar 2.4 µ l de suspensão de células a partir da solução estoque (50.000 células em 100 µ l de PBS 1x) com uma micropipeta de P2 e adicionar a 1,1 mL de MCBM suplementado com 10% FBS.
- Depois de adicionar as células, vórtice os tubos por 1 min, segurando-os verticalmente na velocidade máxima a mistura MCBM e células bem.
- Adicione compostos de teste (OT48 sozinho ou em combinação com A1210477). Prepare um tubo separado como um controle para o solvente utilizado (aqui dimetilsulfóxido (DMSO)). Dependendo da concentração de compostos e o volume adicionado para cada condição, o solvente controle incluirá a maior concentração de solvente utilizado para as diluições de composto, o teste para avaliar os efeitos adversos causados pelo solvente.
- Tubos de vórtice para 1 minuto.
- Para cada ensaio, adicione 1 mL da mistura com uma micropipeta P1000 ao centro de uma placa de cultura de células de 12-bem.
- Preencha o vazios poços com 1 mL de água estéril ou 1X PBS para estabilizar a umidade.
- Incube as placas de cultura por 10 dias em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
- Após 10 dias de incubação, adicione 200 µ l de uma solução-mãe MTT (brometo de methylthiazolyldiphenyl-tetrazólio) (5 mg/mL) a cada poço para atingir uma concentração final de 1 mg/mL.
- Incube 10 min em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Vão virar colônias viáveis violeta.
- Capture a imagem usando uma câmera digital, usando a placa de fundo branco (bandeja de LAS diâmetro branco). Use as seguintes configurações: método, digitalizar; Tipo de exposição, precisão; Tempo de exposição, manual, 1 segundo; Sensibilidade/resolução, alta resolução. Salve a imagem no formato tiff.
- Quantificar as colónias viáveis usando software ImageJ. Seleccionar o menu "imagem | Tipo | 8 bits". Seleccionar o menu "ajuste | Limite". Definir o limiar para controlar e manter constante para todas as condições; Seleccionar o menu "Analyze | Analise as partículas". Salvar os dados e analisar com um software de estatísticas para a representação gráfica.
2. spheroid formação ensaio
- Células de cultura A549 em uma concentração de 20.000 células/cm2 frascos de 75 cm2 com 15 mL de RPMI 1640 suplementado com antibióticos FBS e 1% de 10%.
- No dia do experimento, preparar um 96 bem U-parte inferior da placa.
- Placa de 10.000 células em um poço que já contém o composto de interesse (aqui 50 µM de OT48) e/ou 20 µ m de A1210477. Ajuste o volume final de 100 µ l de meio de cultura celular. O número de células que formam os esferoides uniformes com um limite exterior intacto é considerado adequado para esferoides de formulário.
- Incube durante 3 dias na incubadora a 37 ° C e em 5% CO2.
- Após 3 dias de incubação, capture imagens dos esferoides usando um microscópio com ampliação de 4x.
3. Zebrafish xenoenxertos ensaio
Nota: Esta abordagem técnica é visualizada como um esquema (Figura 1).
-
Preparação de reagentes de estoque
- Preparar 1 L de solução do Danieau de 30x: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM de MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2e 150 mM HEPES. Ajuste o pH do buffer usando um medidor de pH de 7,6.
- Preparar a solução a 1% (50 x) tricaina: dissolver 20 mg de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (tricaina) em 2 mL de água destilada.
- Prepare-se 1% solução de vermelho de fenol-PBS: adicionar 2 µ l da solução de sal de sódio fenol vermelho a 198 µ l de solução de PBS esterilizada em um tubo de 1,5 µ l.
- Prepare-se 3% metilcelulose: Adicionar 3 g de metilcelulose a 100 mL de solução do Danieau de 1x.
-
Incubação e produção de ovos de Zebrafish
- Separe um feminino e um masculino zebrafish em um tanque de partição preenchido com água da torneira filtrada e UV-esterilizados a 28,5 ° C, no escuro. Após 24h de separação, misture peixes de ambos os sexos para iniciar o acasalamento. Transferi ovos fertilizados do tanque de acasalamento para uma placa de Petri contendo 5 mL de solução de Danieau fresco.
- Lave os ovos três vezes com 5 mL de solução de Danieau. Para a lavagem, Aspire cuidadosamente com os ovos com uma pipeta e transferência para 5 mL de solução fresca. Incubar durante 8 h a 28,5 ° C.
- Após 8 h de incubação em solução do Danieau, altere a solução do Danieau contendo 0,03% 1-fenil-2-tioureia (PTU) para inibir a pigmentação. Classificar ovos opaco (não fertilizados ou contendo embriões subdesenvolvidos) para evitar a contaminação.
-
Dechorionation embrião
- 24h pós fertilização (hpf), dechorionate zebrafish embriões utilizando Pinças afiadas. Incubar os embriões para incubação em solução do Danieau com 0,03% PTU a 28,5 ° C até 48 hpf.
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Preparação da pilha de composto-tratados
- Células de A549 semente a 20.000 células/cm2 em frascos de cultura 25 cm2 . Após 24h de semeadura, adicionar compostos (aqui OT48 em 50 µM e e/ou A1210477 a 20 µM) por 24 h na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Configurar o tempo de tratamento para cada composto para manter a viabilidade das células mas para cometê-los para a morte celular. Desta vez ponto precisa ser configurado individualmente com base na viabilidade celular, morfologia e marcadores moleculares.
- 2 h antes do final do tratamento, mancha de células com 4 µM de rastreador celular fluorescente tingem CM-Dil em 37 ° C e 5% de CO2. Após 2 h de incubação, trypsinize células com 0,05% do trypsin-EDTA e diluir 106 células em 50 µ l de solução de vermelho de fenol-PBS antes da injeção.
-
Microinjeção de células cancerosas para formação de enxerto heterólogo
- Anestesia o zebrafish em uma solução de metanosulfonato de 0,02% por 5 min até eles se acalmarem em uma placa de ágar.
- Puxe um 1.0 mm (fora o capilar de vidro de diâmetro (OD)) por um puxador de micropipeta (configurações do programa: p: 300, calor: 260, puxar: 60, VEL: 50 e o tempo: 200). Corte a conta com uma seringa para produzir uma borda afiada. Carregar microcapilares com 20 µ l de célula/vermelho de fenol-solução de PBS. Definir pressão de injeção e tempo para dispensar 2 nL por injecção.
- Injetar o saco vitelino por injetar 6 a 10 células de 100 – 200 nL através de injeções de 3 a 5. Após a injeção, permitir que peixes recuperar-se de 10 a 30 min em 5 mL de solução de Danieau fresco contendo solução PTU. Expedição peixe em placas de 24 poços com 1 mL de solução de Danieau contendo solução PTU é e incube por 72 h a 28,5 ° C.
- Após 72 h de incubação, anestesiar o peixe em uma solução de metanosulfonato de 0,02% e imobilizar em um slide de vidro com uma queda de 3% de metilcelulose. Tirar 5 fotos de x por microscopia de fluorescência no comprimento de onda de 620 a 750 nm.
- Quantificar o tamanho de tumores fluorescentes pelo software ImageJ. Seleccionar o menu "Analyze | Medida". Salvar os valores correspondentes ao sinal fluorescente e analisar com um software de estatísticas para a representação gráfica.
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Representative Results
Na Figura 2, câncer de pulmão de células linha A549 foi semeada em MCBM que formam colônias após o tratamento com OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimética A1210477 nas concentrações indicadas. Os resultados mostraram que a combinação significativamente reduzido número, tamanho e área de superfície total das colônias após 10 dias de incubação.
Na Figura 3, A549 células foram tratadas com OT48 sozinho ou em combinação com A1210477 mimética BH3 em foram autorizadas a esferoides formulário através da técnica de placa U-inferior. Após 3 dias de incubação, foram tiradas fotos de esferoides. Quantificação dos esferoides foi feita usando o Image J e 3D imagens foram geradas.
Na Figura 4, as células A459 foram tratadas com OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimética A1210477 para 24h e injetadas no saco vitelino zebrafish. Depois de 72 h, quantificação de tumores fluorescentes correlaciona o potencial inibitório do composto.
Figura 1: diagrama esquemático do processo geral do ensaio de enxerto heterólogo do zebrafish. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: formação de colônia inibição sinérgica de A549 por Hidroxicumarina OT48 e BH-3 A1210477 mimética. (A) imagens de um ensaio de formação de colônia A549 tratados com 50 µM de OT48 e/ou 20 µ m de A1210477. (B-D) Quantificação do número, tamanho médio e área de superfície total das colônias. Experimentos foram realizados em triplicata. Foram realizadas análises post hoc . Significados estatísticos foram avaliados em p-valores abaixo de 0,05 e representados pela seguinte legenda: * p ≤0.05, * * p ≤0.01, * * * p ≤0.001, * * * p ≤0.0001; post hoc analisa Dunnett; Sidak). Todos os histogramas representam a média ± DP pelo menos três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: efeito da OT48 e/ou A1210477 sobre a capacidade de A549 células de esferoides formulário. Imagens de esferoides de tumor A549 após 3 dias.
Figura 4: inibição da formação de tumor A549 em massa por um composto. Imagens do (A) estão mostrando o efeito inibitório do OT48 e/ou A1210477 do tumor, formando a capacidade das células A549 CM-Dil-manchado. (B) a quantificação da formação de tumor. Foram realizadas análises post hoc . Significados estatísticos foram avaliados em p-valores abaixo de 0,05 e representados pela seguinte legenda: * p ≤0.05, * * p ≤0.01, * * * p ≤0.001, * * * p ≤0.0001; post hoc analisa Dunnett; Sidak). Todos os histogramas representam a média ± DP de pelo menos dez experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As taxas de formação de colônia obtidos com MCBM depende do tipo de célula. Geralmente, para as células não-aderentes, o número de colônias é muito mais alto em comparação com células aderentes. Observamos que as células A549 formaram colônias de 30 a 40 após 10 dias. Anteriormente informamos para as células de leucemia diferente que o número de colônias é entre 200 a 2509. Nossos resultados mostraram que OT48 sozinho não produziu uma diminuição significativa do número de colônias sozinhos. No entanto, em combinação com BH3 mimética A1210477 colônia forma capacidade de células A549 sinergicamente foi reduzida. Anteriormente, informou que outro derivado de Hidroxicumarina OT52 também sinergia com BH3 mimetics para inibir a capacidade de formação de colônia de células A549. A concentração de semeadura sugerida pode variar de 1 x 103 a 1,5 x 103. CFA usando MethoCult é uma valiosa técnica rotineiramente usada para medir a tumorigênese em várias linhas de células de câncer, mas tem algumas limitações. Muitas vezes a recuperação das colônias viáveis após o experimento é inconveniente, e as células não crescem bem uma vez isolada do MCBM e semeado em meio RPMI1640. No entanto, é uma técnica bem aceita pré-clínicos para entender melhor o mecanismo de progressão de câncer em um ambiente 3D. As condições de crescimento 3D representam fielmente o ambiente natural da formação de tumor em uma configuração na vivo . No entanto, este método é lento, mão de obra intensiva e não é adequado para alto throughput screening10.
SFAs são realizados com células aderentes e ganhou grande popularidade na descoberta de drogas câncer como eles apresentam traços fisiológicos, como aumento da célula de sobrevivência, morfologia do tumor e um núcleo de hipóxico mais representativos de uma situação na vivo 11,12. O tamanho total, textura e integridade de esferoides obtidos pela técnica de placa U-fundo podem variar entre linhas celulares. Além disso, a concentração inicial de células usado para esferoides de forma também pode influenciar o seu desenvolvimento global. Nossos resultados mostraram que OT48 em combinação com mimeticA1210477 BH3 inibida integridade esferoide e reduzido esferoide formando a capacidade das células A549. Anteriormente, informou a inibição de esferoides A549 por outro derivado de Hidroxicumarina em combinação com BH3 mimetics9. Principais vantagens desta técnica são a eficácia de reprodutibilidade e custo. Outras técnicas, como a técnica de sobreposição de líquido também rotineiramente são usadas para desenvolver esferoides 3D de células cancerosas. Nesta técnica as células crescem em um prato de cultura de células não-aderentes. As touceiras de célula, em seguida, são coletadas e colocadas em suspensão de cultura de esferoides de forma. No entanto, uma das principais limitações associadas com esta técnica é a transferência de grupos de célula para a cultura de suspensão, que não é bem tolerado por várias linhas de célula. Para aumentar a produtividade do composto de rastreio tal sistema cultura 3D, algumas empresas estão desenvolvendo substratos específicos, placas de fixação baixo ensaio e melhorar a formação de estruturas 3D13de andaimes. Com ainda mais avanços técnicos, desenvolvimento de um modelo mais representativo do tumor 3D permitirá uma melhor compreensão da farmacologia de novos compostos para um determinado tipo de câncer.
Zebrafish xenografts são considerados como os mais cost-effective ensaios animais rotineiramente utilizados para o desenvolvimento de drogas anticâncer9,14. Nós aperfeiçoamos o zebrafish na vivo sistema com vários tipos de câncer hematológico e sólidos, bem como com células derivadas de paciente. Há uma série de vantagens de usar o zebrafish para despistagem de drogas. Em princípio, as drogas podem ser adicionadas diretamente na água em não precisa ser injetado. Além disso, esta abordagem também fornece informações sobre as propriedades ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção) de um candidato de drogas. No entanto, uma das principais limitações desta técnica é que algumas moléculas não são solúveis em água e, portanto, não são imediatamente apropriadas para ser investigado por esse método. Para contornar essa limitação, as células cancerosas foram tratadas com compostos ex vivo para ser injetado em zebrafish numa fase onde as células estão empenhadas, no entanto, manter a viabilidade. Nossos resultados mostraram que as células A549 tratadocom com OT-48 ou com BH3 mimética A1210477 sozinho não reduzir fortemente o tumor, formando a capacidade das células A549 em comparação com uma combinação de OT48 e A1210477. Esta observação mais validado nosso em vitro CFA onde a combinação mostrou efeito anti-câncer significativo em comparação com tratamentos individuais. No total, esta técnica pode contribuir para triagem rápida de drogas num cenário pré-clínicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Pesquisa no SNU é suportada por Fundação Nacional de pesquisa (NRF), pela MEST da Coreia para concessão de Tumor microambiente Global Core Research Center (GCRC), [número de concessão 2011-0030001]; por o Seul National University Research Grant e pelo cérebro Coreia (BK21) e mais o programa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
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