Summary
Burada, antikanser coumarins 3D kültür ve zebra balığı kullanarak preklinik tarama mevcut.
Abstract
Roman terapötik ajanlar içinde in vitro ve in vivo önceden klinik tarama çoğu kanser ilaç keşif önemli bir araçtır. Her ne kadar insan kanser hücre hatları 2D (boyutlu) monolayer hücre kültürlerinde terapötik bileşiklerin yanıt, 3D kültür sistemleri daha fizyolojik ilgili modelleri ilaçların etkinliğini anlamak için geliştirilmiştir. Son yıllarda, daha doğrusu tümör microenvironment taklit eden 3D kültür sistemlerinde yeni moleküller potens doğrulamak için önceden klinik araştırma bir paradigma kayması gözlendi. Bu sistemler daha fizyolojik ilgili bir şekilde hastalık durumu karakterize ve daha iyi mekanik kavrama ve belirli bir molekül farmakolojik potens anlayış kazanmak için yardım. Ayrıca, in vivo kanser modelleri iyileştirilmesinde mevcut trendi ile zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu değerlendirmek ve terapötik ajanlar etkisini incelemek için önemli bir omurgalı model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, biz Hidroksikumarin OT48 tedavi edici etkinliği tek başına veya akciğer kanseri hücre kültürünü A549 BH3 mimetics ile birlikte koloni oluşumu deneyleri (CFA), küresel oluşumu tahlil (SFA) dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür sistemleri kullanarak araştırdık ve vivo zebra balığı xenografts.
Introduction
Kanser tarafından hücresel mutasyonlar neden olur ve sonuç olarak biyokimyasal sinyal yolları kontrolsüz hücre bölünmesi ve hücre ölümü direnç tetikleyen bozdu. Tümörleri sindirim, sinir, dolaşım sistemi ve daha sonra komşu dokulara1fizyolojik fonksiyonları müdahale. Kapsamlı bir araştırma, kanser dünya2' deki en yaygın hayatı tehdit eden hastalık imlere rağmen. Hassas tıp gelecekteki kanser tedavi temel olarak kabul edilmiştir. Yeni moleküler varlıklar klinik sonuç geliştirmek için mevcut uyuşturucu ile birlikte düzenli olarak test edilir.
Ancak, yeni verimli hedefli tedaviler gelişimi ile ilişkili önemli kısıtlamalar uyuşturucu pozlama3tam biyolojik sonucu benzetimini yapmak için yaygın olarak kullanılan deneyleri başarısızlığın biridir. Kanser ilaç keşif hala çoğunlukla terapötik ajanlar etkinliğinin klinik4' te doğrulamak zor olan 2D monolayer kültürde kültürlü kanser hücre hatlarında test dayanır. Bu nedenle, daha iyi taklit tümörler vivo içinde5yerel özelliklerini daha iyi kanser modelleri geliştirmek için büyüyen bir ilgi vardır. Son yıllarda, 3D kültür modelleri artan bir ilgi 3D tümör modelleri5üretmek için geliştirilmiş yöntemleri geliştirmede sonuçlandı.
Burada, bir yaklaşım içinde derinlik vivo deneyleri daha önce BH3 mimetics ile birlikte OT486 Hidroksikumarin potens anlayış geliştirmek için izin üç farklı 3D hücre kültürü teknikleri ile mevcut. Daha fazla akciğer kanser hücrelerini OT48 ve BH3 mimetics arada etkinliğini doğrulamak ve kanser bir yaşam ilerlemesinde izlemek için bir zebra balığı modelini temel bir vivo içinde tümör oluşumu testi ile koloni ve SFAs birleştirerek bizim Yöntem oluşur organizma.
Koloni oluşumu deneyleri düzenli olarak hem katı hem de hematopoetik kanserler için antikanser ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Tahlil süresiz olarak çoğalırlar ve koloniler7oluşturmak için hücre yeteneğini belirler. Antikanser Ajan etkisi yetenek hücre oluşturan colony sayısı azalması ve/veya koloniler boyutunu tarafından belirlenir.
Pulcuklarının vitro tümör modelleri temsil ve antikanser maddeleri için bir düşük maliyetli tarama platform olarak hizmet. Pulcuklarının süspansiyon büyüyen hücresi ya da 3D dizey içinde gömülü. Bu yaklaşım yaygın uyuşturucu tarama ve tümör büyüme, yayılmasını önleme ve bağışıklık etkileşim8çalışmalar için kullanılır.
Tamamen yeni bir ilaç özelliklerini anlamak için in vivo deneyler kemirgenler üzerinde esastır. Ancak, geleneksel bu yöntem pahalı ve zaman alıcı. Son yıllarda, zebra balığı (Danio rerio) daha ucuz ve daha hızlı yükseltmek için yaygın olarak okudu laboratuvar organizma oldu. Tümör zebra balığı temsil bir 3D hücre kültür yaklaşımda ama içinde vivo ayarındaki omurgalı9geliştirdi.
Tamamen, biz burada Hidroksikumarin OT48 BH3 mimetics ile birlikte bir akciğer kanseri A549 hücre modelindeki antikanser kapasitesini göstermek için CFAs, SFAs ve zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu da dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür yaklaşımları kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. koloni oluşumu deneyleri
- Kültür A549 hücreleri 20.000 hücre/cm2 RPMI1640 15 ml bir konsantrasyon, hücre kültürü 10 ile desteklenmiş orta % FBS (Fetal sığır Serum) ve CO2 kuluçka CO237 ° C ve % 5, 75 cm2 şişeye %1 antibiyotik.
- Deneme günü, bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek. Santrifüjü 400 x g 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 7 min için de tarafından 50.000 hücreleri toplamak ve 1 x steril PBS (fosfat tamponlu tuz) 1,5 mL tüpler 100 µL hücrelerde yeniden askıya alma.
- 15 mL tüpler bir multipipette ile yarı katı methylcellulose tabanlı Orta (MCBM) 1.1 mL dağıtmak. Bir tüp her koşul için hazırlayın.
- FBS 110 µL P200 micropipette kullanarak MCBM için 1.1 mL ekleyin.
- 1000 hücre/mL, Tohum hücreleri. Hisse senedi çözüm (1 x PBS 100 µL 50.000 hücreleri) hücre süspansiyon, 2.4 µL toplamak bir P2 micropipette kullanarak ve MCBM % 10 ile desteklenmiş 1.1 mL için eklemek FBS.
- Hücreleri, ekledikten sonra girdap tüpler için 1dk onları tutan dikey olarak en yüksek hızda MCBM ve hücreler iyice karıştırın.
- Test bileşikler (OT48 tek başına veya birlikte A1210477 ile) ekleyin. Bir denetim olarak ayrı bir tüp hazırlamak için kullanılan çözücü (burada dimetil sülfoksit (DMSO)). Bileşikleri ve her koşul için eklenen hacim konsantrasyonu bağlı olarak, solvent denetim solvent testi bileşik, dilutions için çözücü tarafından kaynaklanan olumsuz etkileri için değerlendirmek için kullanılan en yüksek konsantrasyonu içerir.
- Girdap tüpler 1 dakika.
- Her tahlil için karışımı P1000 micropipette ile 1 mL merkezine de 12-şey hücre kültür plaka ekleyin.
- Boş wells ile 1 mL steril su veya nem stabilize etmek için 1 x PBS doldurun.
- Kültür plakaları bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO210 gün kuluçkaya.
- Kuluçka, 10 gün sonra 200 µL MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromür) hisse senedi çözümünün (5 mg/mL) 1 mg/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için her şey için ekleyin.
- Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO210 min kuluçkaya. Kalıcı koloniler dönecek violet.
- Beyaz arka plan plaka (LAS beyaz dia tepsi) kullanarak bir dijital kamera ile çekim. Kullanma ertesi gün koyma: Yöntem, dijital ortama; Pozlama türü, hassas; Çekim hızı, el kitabı, 1 saniye; Hassasiyet/çözünürlük, yüksek çözünürlüklü. Resmi TIFF formatında kaydedin.
- Kalıcı koloniler ImageJ yazılım kullanarak ölçmek. Seç menüsünü "görüntü | Türü | 8 bit". Seç menüsünü "ayarlama | Eşik". Eşik denetimine ayarlayın ve tüm koşulları için sabit tutmak; Seç menüsünü "Analyze | «««Analiz"parçacıkları. Verileri kaydetmek ve grafik olarak gösterilmesi için bir istatistik yazılım ile analiz.
2. küresel oluşumu tahlil
- Kültür A549 hücreleri 20.000 hücre/cm2 ' 75 cm2 şişeler bir konsantrasyon ile 15 mL RPMI 1640 orta % 10 FBS ve % 1 antibiyotik ile desteklenmiştir.
- Deneme günü, 96 hazırlamak de U-alt plaka.
- Bileşik faiz (OT48, burada 50 µM) ve/veya A1210477 20 µM içeren bir kuyuya plaka 10.000 hücre. Hücre kültür ortamının 100 µL için son ses düzeyini ayarlayın. Sağlam bir dış kenarlığı ile Tekdüzen pulcuklarının oluşturan hücreleri formu pulcuklarının için yeterli kabul edilir.
- Bir kuluçka 37 ° C'de ve % 5 CO23 gün kuluçkaya.
- Kuluçka 3 gün sonra 4 x büyütme ile hafif bir mikroskop kullanarak pulcuklarının görüntülerini yakalamak.
3. zebra balığı Xenograft tahlil
Not: Bu teknik yaklaşım bir şematik (Şekil 1) görüntülenir.
-
Hisse senedi reaktifler hazırlanması
- 30 Danieau'nın çözüm x 1 L hazırlamak: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2ve 150 mM HEPES. PH metre kullanarak 7,6 arabelleğe pH için ayarlayın.
- %1 (50 x) tricaine çözüm hazırlamak: 20 mg 2 mL distile su içinde etil 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) geçiyoruz.
- %1 fenol Red-PBS çözeltisi hazırlamak: fenol Red sodyum tuz solüsyonu 1,5 µL tüp içinde sterilize PBS çözümün 198 µL için Ekle 2 µL.
- %3 methylcellulose hazırlamak: 1 Danieau'nın çözüm x 100 ml methylcellulose 3 g ekleyin.
-
Zebra balığı yumurta üretimi ve kuluçka
- Ayrı bir kadın ve bir erkek zebra balığı bir bölüm tank karanlıkta 28.5 ° C'de UV sterilize ve filtre uygulanmış musluk suyu ile dolu. Ayrılık 24 saat sonra balık çiftleşme başlatmak için her iki cinsiyette karıştırın. Döllenmiş yumurta çiftleşme tankından 5 mL taze Danieau'nın çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.
- Yumurta 3 kez 5 mL Danieau'nın çözeltisi ile yıkayın. Yıkama için dikkatle yumurta bir pipet ve 5 mL taze çözüm de aktarmak ile Aspire edin. 28.5 ° C'de 8 h için kuluçkaya
- Kuluçka Danieau'nın çözüm içinde 8 h sonra %0,03 1-fenil-2-Tioüre (pigmentasyon inhibe PTU) içeren Danieau'nın eriyik-e doğru değiştirmek. Kontaminasyonu önlemek için opak yumurta (döllenmemiş veya içeren gelişmemiş embriyo) sıralamak.
-
Embriyo dechorionation
- 24 saat sonrası döllenme (hpf), keskin forseps kullanarak dechorionate zebra balığı embriyo. Damızlık embriyo % 0.03 ile Danieau'nın çözümde kuluçkaya PTU 48 kadar 28.5 ° C'de hpf.
-
Bileşik tedavi hücre hazırlık
- Tohum A549 hücreleri 20.000 hücre/cm2 25 cm2 kültür şişeler'de. Tohum 24 saat sonra bileşikler ekleyin (50 µM, burada OT48 ve ve/veya A1210477, 20 µM) bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO224 h için. Tedavi süresi her bileşik için hücrelerin canlılık korumak için ama onları hücre ölüme doğru işlemek için ayarlayın. Bu sefer noktası ihtiyaçlarını tek tek ayarlamak için hücre canlılığı, Morfoloji ve moleküler işaretleyiciler dayalı.
- 2 h tedavi sonundan önce leke hücreleri floresan hücre izci 4 µM ile 37 ° C ve % 5 CO2CM-Dil boya. 2 h, kuluçka sonra % 0.05 tripsin-EDTA içeren hücreleri trypsinize ve fenol Red-PBS çözüm enjeksiyon önce 50 µL 106 hücrelerde sulandırmak.
-
Mikro-enjeksiyon xenograft oluşumu için kanser hücrelerinin
- Onlar bir agar plaka üzerinde sakinleşene kadar zebra balığı 5 min için %0,02 tricaine çözümünde anestezi.
- 1.0 mm (dış çapı (OD) cam kapiller) tarafından bir micropipette çektirmenin çekin (Program ayarları: P: 300, ısı: 260, çekin: 60, VEL: 50 ve Saat: 200). Microcapillary bir keskin kenar üretmek için bir şırınga ile kesti. Yük microcapillaries hücre/fenol Red 20 µL ile-PBS çözüm. Ayarla enjeksiyon basıncı ve 2 dağıtmak için zaman nL enjeksiyon başına.
- 100-200 hücreleri sarısı kesesi içine enjekte ederek 6 ila 10 tarafından enjekte nL 3-5 enjeksiyon yoluyla. Enjeksiyon sonra balık 10-30 dk için 5 mL taze Danieau'nın çözüm PTU solüsyon içeren kurtarmak izin. 1 mL PTU solüsyon içeren Danieau'nın çözeltisi ile 24-şey plakalar Merkez balık vardır ve 28.5 ° C'de 72 h için kuluçkaya
- 72 h, kuluçka sonra balık %0.02 tricaine çözümünde anestezi ve % 3 methylcellulose bir damla ile bir cam slayt üzerinde hareketsiz. Bir dalga boyu 620-750, floresans mikroskobu tarafından 5 x fotoğraf çekmek nm.
- ImageJ yazılım tarafından floresan tümör boyutunu ölçmek. Seç menüsünü "Analyze | Ölçü birimi". Floresan sinyal karşılık gelen değerleri kaydetmek ve grafik olarak gösterilmesi için bir istatistik yazılım ile analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2' de, akciğer kanseri hücre satırı A549 MCBM içinde form kolonilere OT48 ile tedavi sonra tek başına veya birlikte belirtilen konsantrasyonlarda BH3 mimetic A1210477 ile seribaşı. Sonuçlar kasanın numarası, boyut ve kolonilerin toplam yüzey alanı kuluçka 10 gün sonra azaltılacağını olduğunu gösterdi.
Şekil 3' te A549 hücreleri ile OT48 tek başına veya birlikte BH3 mimetic A1210477 ile tedavi edildi ve form pulcuklarının U-alt plaka tekniği ile izin verildi. Kuluçka 3 gün sonra pulcuklarının görüntüleri alındı. Pulcuklarının miktar yapıldı görüntü J ve 3D kullanarak görüntüleri oluşturulur.
Şekil 4' te, A459 hücre OT48 ile tek başına veya birlikte 24 h için BH3 mimetic A1210477 ile tedavi ve zebra balığı sarısı sac enjekte. 72 saat sonra miktar floresan tümörlerin bileşik inhibitör potansiyeline karşılıklı olarak ilişkilendirir.
Şekil 1: zebra balığı xenograft tahlil işlemindeki Şematik diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: A549 sinerjik inhibisyon koloni oluşumu ile Hidroksikumarin OT48 ve BH-3 mimetic A1210477. OT48, 50 µM ve/veya A1210477 20 µM ile tedavi bir A549 koloni oluşumu testin(a)görüntüler. (B-D) Miktar sayı, ortalama boyutu ve toplam yüzölçümü koloniler. Deneyler nüsha fark. Post hoc analizleri yapıldı. İstatistiksel anlamlar aşağıda 0,05 p değerlerinde değerlendirilir ve aşağıdaki göstergeyi tarafından temsil: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; özel mesaj Dunnett inceliyor; Sidak). Tüm çubuk grafikler en az üç bağımsız deneyler ortalama ± SD temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: OT48 ve/veya A1210477 A549 kapasitesinin üzerindeki etkisini hücreleri formu pulcuklarının. A549 tümör pulcuklarının 3 gün sonra görüntüleri.
Şekil 4: A549 tümör kitle oluşumu bir bileşik tarafından inhibisyonu. (A)resimleri CM Dil lekeli A549 hücreleri kapasitesini oluşturan tümör üzerinde inhibitör etkisi OT48 ve/veya A1210477 gösteren. (B) miktar tümör oluşumu. Post hoc analizleri yapıldı. İstatistiksel anlamlar aşağıda 0,05 p değerlerinde değerlendirilir ve aşağıdaki göstergeyi tarafından temsil: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; özel mesaj Dunnett inceliyor; Sidak). Tüm çubuk grafikler en az on bağımsız deneyler ortalama ± SD temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Koloni oluşumu MCBM ile elde edilen oranda hücre türüne bağlıdır. Genellikle, yapışık olmayan hücreler için koloni sayısı çok daha yüksek yapisan hücrelere karşılaştırılır. A549 hücreleri 10 gün sonra 30-40 kolonileri oluşturduğu görülmektedir. Daha önce farklı lösemi hücreleri için kolonileri sayısının 200-2509arasında olduğunu bildirdin. Sonuçlarımız OT48 yalnız kolonileri yalnız sayısı önemli bir azalma getirmedi gösterdi. Ancak, BH3 ile birlikte mimetic A1210477 koloni şekillendirme yeteneği A549 hücre sinerjik düşürüldü. Daha önce o başka bir Hidroksikumarin türev A549 hücreleri koloni şekillendirme yeteneğine etkisizleştirmek için BH3 mimetics ile de synergized OT52 bildirdi. Önerilen tohum toplama 1.5 x 10 için 1 x 103 farklı olabilir3. CFA MethoCult kullanarak rutin olarak tumorigenesis çeşitli kanser hücre hatlarında ölçmek için kullanılan bir değerli tekniktir, ancak bazı sınırlamalar vardır. Kez deneme rahatsız edici ve hücreleri de bir kez büyümek değil sonra kalıcı koloniler kurtarma MCBM izole ve RPMI1640 ortamda tohumlari. Yine de, daha iyi bir 3D ortamda kanser progresyon mekanizmasını anlamak iyi kabul edilen bir önceden klinik tekniktir. 3D büyüme koşullar doğru tümör oluşumu bir in vivo ortamda doğal ortamının temsil. Ancak, bu yöntem yavaştır, emek yoğun ve yüksek işlem hacmi10eleme için uygun değildir.
SFAs yapışık hücreleri ile gerçekleştirilen ve onlar bir vivo içinde durum daha fazla temsilcisi olan fiziksel özellikler artan hücre hayatta kalma, tümör Morfoloji ve hipoksik bir çekirdek gibi sergilemek gibi kanser ilaç keşif geniş popülerlik kazandı 11,12. Toplam boyut, doku ve U-alt plaka tekniği ile elde edilen pulcuklarının bütünlüğünü hücre hatları arasında farklılık gösterebilir. Ayrıca, form pulcuklarının için kullanılan hücre başlangıç konsantrasyonu da genel gelişimini etkileyebilir. Bizim sonuçları OT48 BH3 mimeticA1210477 ile birlikte küresel bütünlük inhibe ve yetenek A549 hücre şekillendirme küresel azaltılmış gösterdi. Daha önce başka bir Hidroksikumarin türev BH3 mimetics9ile birlikte tarafından A549 pulcuklarının inhibisyonu bildirdi. Bu tekniğin büyük avantaj tekrarlanabilirlik ve maliyet etkinliği vardır. Sıvı kaplama tekniği gibi diğer teknikleri de düzenli olarak kanser hücrelerinin 3D pulcuklarının geliştirmek için kullanılır. Bu teknikte bir yapışık olmayan hücre kültür çanak hücreleri büyümek. Hücre kümeleri sonra toplanan ve süspansiyon kültür formu pulcuklarının için yerleştirilir. Ancak, bu teknik ile ilişkili önemli sınırlamaları hücre kümeleri için de çeşitli hücre hatları ile müsamaha edilmez süspansiyon kültür transferi biridir. Bileşik böyle bir 3D kültür sistem eleme, iş çıkarma yeteneğini artırmak için bazı şirketler belirli yüzeylerde, düşük ek tahlil plakalar ve 3D yapılar13oluşumu iyileştirilmesi iskele geliştiriyoruz. Daha fazla teknik gelişmeler ile bir daha temsilcisi 3D tümör modeli geliştirilmesi bir kanser türü için roman bileşiklerin Farmakoloji daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Zebra balığı xenografts antikanser ilaç geliştirme9,14için rutin olarak kullanılan en uygun maliyetli hayvan deneyleri olarak kabul edilir. Çeşitli katı ve hematolojik kanser türleri yanı sıra hasta elde edilen hücreleri ile zebra balığı vivo içinde sistem optimize edilmiştir. Zebra balığı uyuşturucu tarama için kullanmanın yararları vardır. Prensip olarak, uyuşturucu doğrudan suya eklenebilir ve enjekte edilebilir gerekmez. Ayrıca, bu yaklaşım aynı zamanda uyuşturucu aday ADME (emme, dağıtım, metabolizması ve atılımı) özellikleri hakkında bilgi sağlar. Ancak, bir büyük sınırlamalar bu tekniğin bazı biridir molekülleri suda çözünür değildir ve bu nedenle hemen bu yöntem tarafından araştırılması için uygun değildir. Bu sınırlamayı aşmak için kanser hücrelerinin zebra balığı nerede hücreleri kararlıyız bir aşamada enjekte edilir, yine de canlılığı korumak için bileşikler ex vivo ile tedavi edildi. Sonuçlarımız A549 hücreleri OT-48 ile tedavi veya BH3 mimetic A1210477 yalnız yetenek A549 hücre OT48 ve A1210477 bir arada karşılaştırıldığında oluşturan tümör güçlü azaltmak değil gösterdi. Bu gözlem daha fazla bizim vitro burada kasanın bireysel tedavilere göre önemli bir anti-kanser etkisi gösterdi CFA geçerliliği. Özet olarak, bu teknik preklinik bir ortamda ilaçların hızlı tarama için katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
SNU Araştırma Kore MEST tümör Microenvironment küresel çekirdek Araştırma Merkezi (GCRC) Bursu, [grant numarası 2011-0030001]; tarafından Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) tarafından desteklenmektedir Seul Ulusal Üniversitesi Araştırma Bursu ve beyin Kore (BK21) tarafından program artı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
