Summary
Denna artikel visar principerna för en snabb, minimalinvasiv injektion av fluorescerande mikropartiklar i circulatory system av små fiskar och i vivo visualisering av mikropartiklar i fisk blod.
Abstract
Micro-storlek partiklar systemisk administration in i en levande organism kan tillämpas för vaskulatur visualisering, läkemedel och vaccin leverans, implantation av transgena celler och små optiska sensorer. Dock intravenös microinjections i små djur, som oftast används i biologiska och veterinära laboratorier, är mycket svårt och kräver utbildad personal. Vi visar häri, en robust och effektiv metod för införandet av mikropartiklar i cirkulationssystemet av vuxen zebrafiskar (Danio rerio) genom injektion i fisk njure. För att visualisera den introducerade mikropartiklar i kärlsystemet, föreslår vi en enkel intravital bildteknik i fiskarnas gälar. In vivo övervakning av zebrafisk blod pH var fulländad med en injicerade mikrokapslat fluorescerande sond, SNARF-1, att visa en av de möjliga tillämpningarna av den beskrivna tekniken. Denna artikel ger en detaljerad beskrivning av inkapsling av pH-känsliga färgämne och visar principerna för snabb injektion och visualisering av erhållna mikrokapslarna för in vivo inspelning av fluorescerande signalen. Den föreslagna metoden för injektion kännetecknas av en låg dödlighet (0-20%) och hög verkningsgrad (70-90% framgång), och det är lätt att institutet använder allmänt tillgänglig utrustning. Alla beskrivna förfaranden kan utföras på andra små fiskarter såsom guppy och medaka.
Introduction
Förvaltning av mikro-storlek partiklar till en djur organism är en viktig uppgift i sådana områden som läkemedel och vaccin leverans1, vaskulatur visualisering2, transgena cell implantation3och liten optisk sensor implantation 4 , 5. implantation förfarandet för hur provtagningsutrustningen skall partiklar i det vaskulära systemet av små försöksdjur är dock svårt, särskilt för känsliga vattenorganismer. För populära forskning exemplar som zebrafisk, det rekommenderas att dessa förfaranden förtydligas med hjälp av video protokoll.
Intrakardiellt och kapillär microinjections kräver utbildad personal och unik microsurgery faciliteter för leverans av microobjects till zebrafiskar blod. Tidigare har föreslogs en retro-orbital manuell injektion3 som en enkel och effektiv metod för administrering av hela celler. Vår erfarenhet tar på grund av den lilla området av ögat välutbyggt nät, det dock mycket praktik att uppnå det önskade resultatet från denna teknik.
Häri, beskriver vi en metod för robusta och effektiva microparticle implantation in i blodomloppet genom manuell injektion direkt in i njure vävnad av vuxen zebrafiskar, som är rik på kapillärer och nedsatt fartyg. Denna teknik är baserad på video protokollet för stamcellstransplantation till zebrafiskar njure6, men de traumatiska och tidskrävande mikrokirurgisk stegen avlägsnades. Den föreslagna metoden kännetecknas av låg mortalitet (0-20%) och hög verkningsgrad (70-90% framgång), och det är lätt att institutet använder allmänt tillgänglig utrustning.
En viktig del av föreslagna protokollet är visualisering av den implanterade mikropartiklar (om de är fluorescerande eller färglagt) i gill kapillärerna, som möjliggör kontroll av injektion kvaliteten, en grov relativ bedömning av antalet injicerade partiklar, och upptäckt av spektral signalen för fysiologiska mätningar direkt från cirkulerande blod. Som ett exempel på de möjliga tillämpningarna av den beskrivna tekniken, vi visar protokollet för i vivo mätningar av zebrafisk blod pH med ett Mikroinkapslat fluorescerande sond, SNARF-1, ursprungligen föreslagits i Borvinskaya et al. 20175.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner genomfördes i enlighet med EU direktiv 2010/63/EU för djurförsök och har godkänts av djur ämnen forskning kommittén av Institutet för biologi vid Irkutsk State University.
1. tillverkning av mikrokapslar
Obs: Mikrokapslar som transporterar ett fluorescerande färgämne tillagas av en lager-för-lager montering av motsatt laddade polyelektrolyter7,8. Alla förfaranden utfördes vid rumstemperatur.
- För att syntetisera porösa CaCO3 microcores omslutande den fluorescerande färgen, blanda 2 mL SNARF-1-dextran lösningen (de flesta polymer-bundna fluorescerande färgämne som FITC-BSA kan användas) vid en koncentration på ~ 2 mg/mL med 0,6 mL var och en av 1 mol/L lösningar av CaCl2 och Na2CO3 under snabb omrörning.
Obs: Var uppmärksam olika känslighet för fluorescerande färgämnen till fotoblekning; om en ljuskänslig fluorescerande sond (som SNARF-1) används, måste manipulation och lagring av mikropartiklar utföras med så lite ljus som möjligt. - Efter 5-10 s av agitation, överföra suspensionen till 2 mL mikrocentrifugrör och centrifugera för 15 s 10 000-12 000 g till pellet CaCO3 microcores.
- Tag bort supernatanten, tvätta kärnar ur med ~ 2 mL avjoniserat vatten och återsuspendera pelleten genom skakning.
- Upprepa centrifugering-tvätt proceduren tre gånger sammanlagt. Efter den sista centrifugeringen, Kassera supernatanten.
- Inkubera i microcores för 1 min i ett ultraljudsbad att minska sammanräknas.
Varning: Glöm inte att skydda öronen med hörlurar. - För att deponera det första polymera lagret på mallar, Återsuspendera kärnar ur i ~ 2 mL av en 4 mg/mL lösning av poly(allylamine hydrochloride) (PAH) i 1 mol/L NaCl.
- Hålla microcores i lösningen för ~ 5 min med konstant skakning.
- Efter 15 s av centrifugering, Kassera supernatanten med obundna PAH. Tvätta den täckt microcores med avjoniserat vatten minst 3 gånger genom flera centrifugering och tvätt steg. Efter den sista centrifugeringen, Kassera supernatanten.
- Inkubera i microcores för 1 min i ett ultraljudsbad att minska sammanräknas.
Obs: Om den tillämpade fluorescerande färgämnen är katjoniska, starta från poly (natrium 4-styrenesulfonate) (PSS) i 1 mol/L NaCl (se steg 1,7).
- Upprepa steg 1,6 med ~ 2 mL av en 4 mg/mL lösning av PSS (även innehållande 1 mol/L NaCl) för att sätta in det andra polymera lagret på mallar.
- Upprepa steg 1,6 och 1,7 sex gånger för att deponera 12 polymera lager.
Obs: Det rekommenderas inte att ta en lång paus (~ 12 h eller mer) i förfarandet fram till ~ 3-5 lager har deponerats eftersom CaCO3 microcores utan täckning kan tendera att rekristalliserar. Observera att PSS täckning orsakar en högre aggregering av microcores och den långa pausen är lämpligt endast när PAH eller poly-L-lysin ympade med polyetylenglykol (PLL-g-PEG) är det yttersta lagret. - Inkubera i täckta microcores i 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL per mikrorör) för minst 2 h.
- Tvätta microcores med vatten via sekventiell centrifugering och resuspension trappan. Efter den sista centrifugeringen, Kassera supernatanten.
- För att erhålla ihåliga mikrokapslar, lös CaCO3 mallar genom att lägga till 2 mL 0,1 mol/L etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syralösning (justerat till pH 7.1 med NaOH) till den täckta microcores.
- Efter ~ 5 min inkubering, Centrifugera mikrokapslarna för 45 s och Kassera supernatanten med EDTA.
- Upprepa steg 1.10-1.10.1 två gånger.
- Tvätta mikrokapslarna med 0,9% NaCl tre gånger genom flera centrifugering steg inom 45 s följt av tvättning steg. Efter det sista centrifugeringssteget-Kassera supernatanten.
Obs: Den sista microcapsule lösningen för injektion måste hållas steril (till exempel genom att lägga till ampicillin, 0,1 mg/mL) och media bör vara biokompatibla syfte undersökningen (isoton media med neutralt pH). - Beräkna koncentrationen av beredda mikrokapslarna i en hemocytometer i fluorescens Mikroskop. Ta en serie bilder av mikrokapslarna, Mät diametern på om hundra mikrokapslar med ImageJ9 eller motsvarande programvara och undersöka fördelningen av storlek med ett histogram.
- Store erhålls inkapslade sonden i mörkret.
Obs: efter flera tvättar i steril 0,9% NaCl, mikrokapslarna kan lagras i månader vid 4 ° C. Fullständig torkning av mikrokapslarna under lagring rekommenderas inte.
2. beredning av optiska installation och kalibrering av mikrokapslat SNARF-1
Obs: Grov pH-mätningar med mikrokapslat SNARF-1 kan göras med hjälp av bilder i två kanaler av en fluorescerande Mikroskop7, men i detta protokoll enkanals fluorescerande Mikroskop ansluten till en fiber spektrometer tillämpades.
- Placera den krävda uppsättningen fluorescens filter till fluorescerande mikroskopet enligt kännetecknen av den tillämpade fluorescerande färgämnen och slå på lysröret.
- Dra ut spaken till okularen.
FÖRSIKTIGHET: Överskott ljus kan skada matrisen spektrometer. Kontrollera därför att spaken är i ”okularet” läge när spektrometern inte används. - Anslut ena änden av den optiska fibern till spektrometern och den andra ändan till en kollimator. Använder nätverkskort, placera kollimator i fokus för kamera röret eller andra tillgängliga port av fluorescerande Mikroskop.
- Slå på spektrometern. Kör programmet spektrometer kontroll och gör klar spektrometern för mätningar.
- Dra ut spaken till okularen.
- För kalibrering av microcapsule batchen, placera ~ 5 µL av microcapsule upphängning (~ 10 000 mikrokapslar per µL avjoniserat vatten) på ett objektglas och torka nedgången i en mörk plats (till exempel i en termostat vid 35 ° C).
- För att kalibrera de spektrala egenskaperna av mikrokapslat SNARF-1, Använd en serie av buffertar med olika pH-värden i intervallet ~ 6-9. Släppa ~ 10 µL av en buffert på torkade mikrokapslarna med SNARF-1-dextran och täck med ett täckglas.
- Placera glasskiva på Mikroskop scenen. Leta upp mikrokapslarna använder ett × 40 mål.
- Vrid den Mikroskop spaken till kamera-porten. Registrera sin fluorescens med spektrometern. Sväng spaken tillbaka till okularen.
Obs: Kontrollera spektrala signalen är långt bortom bakgrundsnivån och säkerställa att mikrokapslarna i synfältet inte i en bubbla (genom att byta till en lägre förstoring om det behövs). Undvik långvarig belysning av samma mikrokapslarna. SNARF-1 är känslig för fotoblekning. - Upprepa steg 2.2.3 för olika mikrokapslar 10 - 15 gånger.
- Beräkna fluorescens peak kvoterna (exempelvis använda R eller Scilab) för alla registrerade spectra och bestämma regressionslinjen mellan medianvärdet förhållandet (för varje buffert) och medelstora pH med hjälp av följande formel:
Obs: SNARF-1 har ett spektrum med två toppar motsvarar utsläpp av protonerade och deprotonated färgämnet och förhållandet mellan topparna är mottaglig för pH i mediet. I denna studie används förhållandet mellan fluorescensintensiteten för 605 och 660 nm. Dessa våglängder väljs beroende på de filter som används. a och b är koefficienter som skall fastställas av icke-linjär regression (exempelvis använda R). Värden 0,15 och 1.1 är, respektive de lägsta och högsta värdena av jag605/I660 observerats under kalibreringen. - Samla in ca 10 µL av fisk blod från ca 5 vuxna djur. Plats fisk i en petriskål med 1 µL/mL vatten suspension av kryddnejlika olja för anestesi och vänta tills djuret visar på dess sida och slutar svara till krm fenan (vanligtvis ~ 2-3 min). Överföra fisken på en glasskiva. Skär av fisk svans med en lansett och samla ca 2 µL av fisk blod från svans venen.
Obs: För att förhindra blodproppar, behandla snitt med heparin (5000 E/mL) och använder hepariniserad glas kapillärer och mikrocentrifugrör för att samla blod.- Droppa ca 10 µL blod med en pipett på spetsen av mikroelektrod och bestämma pH med pH-mätare.
- Droppe blod på ett objektglas med torkade mikrokapslar och registrera förhållandet mellan fluorescensintensiteten som beskrivs för kalibrering buffertar (steg 2.2-2.3).
- Justera den linjär utvidgningskoefficient av kalibreringskurvan att göra kurvan som matchar måtten i fisk blodet (för mer detaljer se Borvinskaya et al. 20175).
3. förberedelse för injektion
- Släppa stål nålen från spetsen av insulinpennan (eller spruta) genom att ta bort plasten med en skarp lancet.
Obs: Någon tunn nål (Ø0.33 mm eller mindre) eller glas kapillär (vanligtvis Ø1 mm) kan förberedas för Mikroskop10,11. - Stick in nålen halvvägs i glas microcapillary; snabbt och skonsamt löda den med en gaslåga.
- Anslut glas microcapillary till microinjector och spola med sterilt vatten tre gånger. Se till att vätskan flödar genom nålen.
- Fyll systemet med destillerat vatten.
Notera: Se till att det finns inga bubblor i systemet.
4. injektion
- Återsuspendera den beredda suspensionen av mikrokapslar (i steril 0,9% NaCl eller andra medier används för injektioner, med en koncentration av 0,5 till 6 miljoner mikrokapslar per mikroliter) med ultraljudsbadet för 1 min.
Obs: Eftersom mikrokapslarna tenderar att fällningen, under följande injektionen, skaka injektionsflaskan med mikrokapslarna mekaniskt (med en rotor) eller manuellt varje några minuter att resuspendera dem och förhindra sammanräknas. - Placera fisken i en petriskål med bedövningsmedel (0,1 mL/L av kryddnejlika olja uppslammat i vatten) för ~ 2-3 min. vänta tills fisken visar på dess sida och slutar svara på en lätt nypa fenan.
- Med hjälp av en sked, överför fisken ur bedövningsmedlet och försiktigt placera den på en fuktig svamp i en lateral position med huvudet mot vänster (för högerhänt person) eller mot höger (för vänsterhänt person).
- Precis före injektion, suga 1-2 mm luft i glaset kapillär förbindelse med microinjector. Sedan ladda den med cirka 2 µL av spridda mikrokapslarna.
Obs: Före injektionen, microcapsule lösningen anpassas till den temperatur där fisken hålls. - Försiktigt stabilisera kroppen av fisk på svampen med icke-dominanta hand.
- Hitta den laterala linjen av fisken. Mentalt Markera ett segment som sträcker sig från operculum till slutet av bukhålan. Hitta mitten av detta segment. Sätta nålen 1 mm lägre i ventrala riktning.
- Med en skrapning rörelse, försiktigt flytta fisken skalor åt sidan och göra en punktering. Stick in nålen i kroppen i en vinkel av 45° med bordsytan.
- Tryck nålen mot ryggraden tills det noggrant vilar mot den.
- Släppa ca 1 µL mikrokapslarna suspension i njuren och långsamt dra ut injektionsnålen.
Obs: För att hitta webbplatsen korrekt punktering lättare, det är nyttigt att öva att hitta stammen njuren genom transilluminating fiskar med en botten ljus, som visas i figur 2A och 2B.
- Skölj fisken från huvud till svans med en ström av vatten för att avlägsna eventuella utspillda mikrokapslar vid injektionsstället.
5. in Vivo visualisering
- Använd dissektion saxen för att ta bort locket till gill från fisk huvudet och beröva fisk gälarna. Skölj gälarna med vatten.
- Med hjälp av en sked, överföra fisken till ett objektglas och placera den på scenen av fluorescerande mikroskopet.
Obs: Kontrollera att gälarna av fisken inte torkar under successiva förfaranden. Undvik detta genom regelbundet Fukta dem med vatten och en Pasteur-pipett (ungefär varje 1-2 min). - Mörklägg rummet och använda låg förstoring (x 10 mål) inspektera gälarna att hitta fluorescerande mikrokapslarna.
Obs: När förfaranden som används för införsel av vissa fluorescerande partiklar fisk cirkulationssystemet, det rekommenderas att inspektera gälar av flera individer för oväntade fluorescerande partiklar före injektioner. Gälar av vildtyp zebrafisk har inte autofluorescens, men i vissa fall sporadiska fluorescerande partiklar (som mat bitar eller encelliga symbionter) kan förekomma på gälarna. Om nödvändigt, sådana partiklar kan identifieras utifrån sin specifika form (till exempel mat bitar har oregelbunden form, till skillnad från Sfärisk mikrokapslar) eller fluorescens spektrum (dvs färg).- Byta lins till en högre magnitud (× 40 mål) och placera en microcapsule eller en grupp av mikrokapslar i mitten av synfältet.
- Sväng spaken till porten med en ansluten spektrometer. Registrera den spektrala signalen.
- Sväng spaken tillbaka till okularet.
- Upprepa mätningarna för olika mikrokapslar flera gånger.
- Överföra fiskarna till akvariet med ordentlig luftning för återvinning.
Obs: Med minimal träning är det möjligt att utföra injektion och signal inspelning med en ungefärlig hastighet på 2-3 min per fisk. Mätningen kan upprepas för en enskild flera gånger med användning av upprepade låga, ofarliga doser av anestesi eller en annan metod för fixering. För långsiktig observation, använda ett system med kontinuerlig anestesi12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De erhållna resultaten kommer från en av de tre huvudkategorierna av protokollet presenteras: bildandet av fluorescerande mikropartiklar av inkapsling av ett fluorescerande färgämne (figur 1), njure injektion av mikrokapslar med ytterligare visualisering i Gill kapillärer (figur 2 och 3) och, slutligen, i vivo spektrala inspelning av SNARF-1 fluorescens att övervaka pH i blodet (figur 4).
Metoden lager-för-lager med beläggning av mallen CaCO3 kärnor omslutande färgämnet av flera lager av motsatt laddade polymerer (PAH och PSS) och ett yttersta lager av en biokompatibel polymer (PLL-g-PEG) är en enkel och kostnadseffektiv metod att tillåta att kapsla in olika fluorescerande sonder såsom SNARF-1-dextran, FITC-BSA eller andra (figur 1A). Som ett resultat, erhålls ihåliga mikrokapslar av Mikrometerinställning storlek med stabil ljusgenomsläppande elastiska skal och laddad med den fluorescerande färgen (figur 1B). Mikrokapslarna fabricerade av denna teknik är vanligtvis icke-uniform, med en normalfördelning av partikelstorlek och karakteristiska median storlek i varje batch (figur 1С).
Figur 1 : Lager-för-lager syntes och karakterisering av ihåliga polyelectrolyte mikrokapslar laddad med ett fluorescerande färgämne. (A) systemet en mikrokapslar församling (dras från ett liknande system som publiceras i Gurkov et al. 20164). (B) bild av ihåliga mikrokapslar laddad med fluorescerande färg FITC-BSA. (C) storlek karakterisering av partiet med mikrokapslar från figur 1B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Robust och effektiv microparticle implantation in i blodomloppet av små fiskar kan utföras genom manuell injektion direkt i fisk njure. Punkteringen på webbplatsen korrekt av fisk kroppen (bålen njure) är avgörande för snabb leverans av mikropartiklar genom manuell injektion. Fisk njure är en hematopoetisk orgel och innehåller pigmenterade melanophores, och därmed, det är väl färgad. Eftersom det ligger inbäddat mellan transparent avdelningar med simblåsan, är det lätt att identifiera organ i intakta djur med svag pigmentering eller genom genomlysning av små fiskar med en botten ljuskälla, som visas i figur 2A och 2B.
Figur 2 : Lokalisering av webbplatsen korrekt njure injektionsvätska. (A) Trans-belysning av zebrafiskar visar localizationen av stammen njuren (pil). (B) system visar hur att identifiera webbplatsen korrekt punktering. Den vita streckade linjen indikerar laterala linjen av abdominal-segmentet av fisken. Pilen anger platsen för punktering och korrekt riktningen av injektion mot ryggraden. Simblåsan utsetts av den gröna linjen. (C) visualisering av zebrafisk njure efter avlägsnande av organ och kroppen väggen. En pil pekar på den centrala utbuktningen av stammen njure. (D) en sagittal histologiska avsnitt av D. rerio illustrerar de inre organen av vuxen fisk allmän anatomi (H & E fläcken). (E) Mikrograf av en fisk njure (prickig) skalas från (D) med en pil som pekar till lumen av bakre kardinal venen. Asteriskerna visar simblåsan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att kontrollera framgången med injektionsproceduren, bör en snabb visuell kontroll av gälarna på låg förstoring (x10-20 mål) göras efter styckning fisk gill omslaget (figur 3A). Trots att de flesta av mikrokapslarna resterande vid injektionsstället eller spilla in kroppen hålighet (figur 3B), om injektionen utförs korrekt, det är möjligt att observera fluorescerande mikrokapslarna fritt flytande i gill kapillärerna i den utblottad fisk gälar omedelbart efter injektionen (figur 3 c). Om ingen fluorescerande partiklar upptäcks i gälarna, är det möjligt att upprepa injektionen i samma punkteringen. Framgångsrik leverans i blodet bör uppnås i ca 70-90 procent av den totala injicerade fisken.
Figur 3 : Njure injektion av mikrokapslar med ytterligare visualisering i gill kapillärer. (A) den allmänna systematiken i microcapsule leverans i zebrafiskar blodomloppet. (B) fluorescerande bild av en zebrafiskar efter injektion av mikrokapslarna med grön FITC-BSA dye (injektionsstället indikeras med en pil). (C) denna bild av gälarna fisk, skalas från (B), visar den framgångsrik leveransen av mikrokapslar av njure injektion (gälar av vildtyp zebrafisk har ingen autofluorescens). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vid injektion direkt i fisk stammen njuren bildar blåmärken normalt under injektionsstället, som indikerar skada parenkymet kapillärerna eller nedsatt fartygen. Det finns inget blod läckage ur kroppen eftersom punkteringen verkar snabbt kontrakt. Trots inre blödning, kan individer fortfarande återställa med cirka 80-90% överleva genom förfarandet (tabell 1). Det är också känt att fiskarter kan regenerera nephrons de novo efter skada13,14. Om mer än 20% av fisk dör, måste man se till att anesthetization utförs på rätt sätt.
| Inkapslade fluorescerande färgämne | n | Koncentration, mikrokapslar per µL | Injektionsvolym, µL | Genomsnittlig diameter av mikrokapslar, µm | Framgångsrik leverans i fisk blodomloppet, % | Dödlighet efter injektion, % | |
| 1 h | 1 dag | ||||||
| Injektion i stammen njure | |||||||
| FITC-BSA | 36 | 4 x 106 | 1.6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| SNARF-1-dextran | 29 | 3-6 x 105 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| RITC-dextran | 20 | 6 x 106 | 2 | 2.0 | 70 | 0 | 0 |
| 0,9% NaCl | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| Retro-orbital injektion | |||||||
| FITC-BSA | 9 | 1 x 105 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| RITC-dextran | 11 | 6 x 106 | 1 | 2.0 | 9 | 18 | 0 |
Tabell 1. Säkerhet och effektivitet av leveransen av mikrokapslar i zebrafiskar blodomloppet. Ingreppets framgång bestäms av förekomsten av fluorescerande material i fisk gill kapillärerna.
Om koncentrationen av den injicerade mikropartiklar är otillräcklig, kanske alltför få partiklar finns att visualiseras snabbt i fiskarnas gälar. På samma gång, kan en suspension med en för hög koncentration täppa nålen. Vid lager-för-lager monterade mikrokapslar med median diameter ~ 2-5 µm är en koncentration av cirka 4 * 105-6 * 106 mikrokapslar per µL optimal för enkel identifiering i fiskarnas gälar efter injektion i fisk njure (tabell 2).
| Koncentration, mikrokapslar per µL | Antal mikrokapslar i ett Mikroskop synfält (× 20 mål) i gälarna av olika individer (n = 7 per koncentration) | ||||||
| 4 x 106 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 x 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 x 104 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 x 103 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabell 2. Rekord av visuella räkna av FITC-BSA-innehållande mikrokapslar i D. rerio gälarna efter injektion (1.6 µL) i stammen njuren.
Den föreslagna metoden för mikropartiklar implantering i fisk cirkulationssystemet kan sökas i vivo övervakning av zebrafisk blod pH av mikrokapslat fluorescerande probe, SNARF-1 (figur 4). SNARF-1 har ett spektrum med två toppar motsvarar utsläpp av protonerade och deprotonated färgämnet (figur 4A), således kalibreringen kurvor av förhållandet mellan topparna vid olika pH av media kan vara ritade (figur 4B). Komponenterna i blodet påverkar avläsningen av inkapslade SNARF-1 (figur 4B), som kan utvärderas experimentellt genom samtidig mätning av pH blod av mikrokapslar och pH-mätare med ett glas mikroelektrod. En förmodad kalibreringskurva för mikrokapslar i zebrafiskar blod bör ritas genom att skifta buffertar kurvan med koefficienten som är lika med pH skillnaden mäts experimentellt (se Borvinskaya et al. 20175 för detaljer).
Blod pH i zebrafiskar gill kapillärer förblir stabila under minst flera timmar efter injektion av mikrokapslar (figur 4 c). På samma gång leder en kort hyperkapnisk exponering till en statistiskt signifikant minskning av blod pH, vilket visar tillämpligheten av metoden för i vivo forskning om små fiskar.
Figur 4 : Representativa exempel på övervakning av zebrafisk blod РН genom registrering av fluorescens spektra av mikrokapslat färgämne SNARF-1. (A) spektra av beredda mikrokapslarna laddad med SNARF-1 i natriumfosfat buffertar vid olika pH. (B) kalibreringskurvor för beredda pH-känsliga mikrokapslarna i natriumfosfat buffertar och extraherade zebrafiskar blod. För alla mätningar avbildas medelvärde ± standardavvikelsen. (C) ett representativt exempel på i vivo övervakning av zebrafisk blod рН inkapslade fluorescerande SNARF-1 färg i zebrafiskar gill kapillärer. I villkor för kontroll förblir blod pH stabil under 4 timmar efter injektion av mikrokapslar, medan 5 minuter exponering under svår hyperkapni (900-1000 mg/L av upplöst CO2) orsakar försurning av blodet fisk. Asterisken anger statistiskt signifikant skillnad från parallella kontrollgruppen med p < 0,01 (Mann-Whitney U-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att demonstrera injektionen av mikropartiklar i zebrafiskar njuren, använde vi ljusgenomsläppande mikrokapslar laddad med en indikator färgämne. Således, protokollet innehåller instruktioner för tillverkning av mikrokapslarna använder lager-för-lager assembly motsatt laddade polyelektrolyter7,8,15,16,17 ,18 (figur 1A). En fördel med denna teknik är att det är lätt att utföra med tillgängliga laboratorieutrustning. Beroende på de villkor och föreningar, kan påhittade mikrokapslarna variera från 0,5 till 100 µm med nanometer tjockt polyelectrolyte skal15. Syntes parametrar beskrivs i detta manuskript resultat i elastisk mikrokapslar bestående av 12 lager (förutom det slutliga biokompatibla skiktet) av polymerer cirka 2-6 µm i storlek (figur 1B och 1 C). Det viktigaste steget att fastställa storleken på mikrokapslarna är bildandet av den mallen microcores. Denna process innebär spontana bildandet av kalciumkarbonat kristaller och därför erhålls partiklarna är ojämn. En karakterisering av fördelningen av microcapsule storlek bör därför utföras för varje parti.
Det viktiga steget i detta protokoll är optimering av distribution av mikropartiklar i zebrafiskar cirkulationssystemet utan användning av mikromanipulation tekniker. Administrering av hela celler av retro-orbital injektion har tidigare beskrivits i detalj3. Men vår erfarenhet är det inte lätt för nybörjare att få injektion effektivitet beskrivs av författarna eftersom den retro-orbital sinus är mycket små och ligger nära svalget och gill bågar, som är lätt att oavsiktligt skada med en nål. Sedan mindre än en millimeter noggrannhet krävs för injektioner, den injicera korrekt är en ganska svår uppgift. En lika snabb och effektivare alternativ (tabell 1) är att injicera direkt i fisk njure parenkymet. Under injektionen skadar nålen mekaniskt nedsatt kapillärer och blodkärl (t.ex. den största bakre Kardinala ven), som tillåter hänrycka av mikropartiklar in i blodomloppet (figur 2E). Slutligen, centrala utbuktning av stammen njure i vuxen zebrafiskar är stor nog (upp till 2 mm) för manuell injektion utan mikrokirurgisk utrustning.
Korrekt positionering av injektionsnålen är avgörande för en framgångsrik manuell administration. Du kan öva att hitta stammen njuren i intakta djur med transilluminating fiskar med en botten ljus, vilket visas i figur 2A och 2B. Ordningen i figur 2B visar hur du korrekt utför injektionen. Om förfarandet misslyckas att administrera mikropartiklar i blodet, kan förnyad injektion göras på samma punkteringen inom en kort tidsram med praktiskt taget ingen effekt på överlevnaden av individerna.
Injektion i stammen njuren av vuxen zebrafiskar (också framgångsrikt testats på vuxen guppy Poecilia reticulata) är en effektiv metod för microparticle leverans i fisk blodomloppet med en tillåtna animaliska dödlighet; men passar det inte perfekt för drug administration på grund av variationer i den injicerade volymen. En svag punkt i denna teknik är en betydande läckage av lösningen av njuren i buken på grund av snabb administration. Dock uppskattas en relativ mängden ämne injiceras i blodomloppet grovt med hjälp av visualisering i gill kapillärerna (tabell 2). Det finns ingen strikt begränsning av injektionsvolymen, men administrationen av mer än 1 µL av suspensionen verkar vara ineffektiva. De finaste glas kapillärerna kan tillämpas för Mikroskop; men eftersom ett stort antal mikrokapslar tenderar att hetsa aggregering, rekommenderar vi användning av 31-29G (Ø 0,33-0,25 mm) stål nålar att undvika träskor i nållumenet.
Framgången för microcapsule leverans via njuren injektion i blodet övervakas med snabb inspektion för förekomsten av fluorescerande partiklar i gälarna. Gälarna är lättillgängligt organ för i vivo observationer. Gill filament är ett nätverk av blod kapillärerna täcks av ett tunt lager av respiratoriskt epitel, vilket gör intravital avbildning av blodet flöda i gälarna särskilt praktiskt (en slags naturliga optiska fönstret). För att utföra observation, kan brosk gill omslaget skäras för att exponera glödtrådarna. Detta förfarande är säkra för fisk, som kan leva med utblottad gälar i väl kolsyrat vatten utan en minskning av livslängden. Dessutom kan gälarna stor fisk undersökas i Mikroskop helt enkelt genom att trycka operculum ur väg19. Vid en framgångsrik injektion visas fluorescerande mikropartiklar direkt i gälarna (figur 3). Observera att implanterade mikropartiklar löses betydligt i den cirkulerande blodvolymen, och ett minskat antal partiklar når gill kapillärerna, således tillräcklig koncentration av mikropartiklar bör väljas för identifiering i fiskarnas gälar efter injektion i fisk njure (tabell 2).
Det föreslagna förfarandet för implantation kan tillämpas i ett stort antal studier med olika arter av små fiskar. Trots att tekniken har utvecklats och optimerats för injektion av fluorescerande mikropartiklar i cirkulationssystemet, det kan också tillämpas för implantation av icke-färgade mikro/nanopartiklar eller upplöst ämnen. dock bör i detta fall effekten av injektion kontrolleras på annat sätt. För närvarande beskrivs stegen är optimal för sådana ändamål som fysiologiska övervakning med hjälp av olika optiska mikro - eller nanosensorer, visualisering av kärlsystemet, leverans av vaccin eller läkemedel på vissa optiskt synlig bärare och implantation av genetiskt modifierade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner kraftigt hjälp av Bogdan Osadchiy och Evgenii Protasov (Irkutsk State University, Ryssland) i förberedelse av protokollet video. Denna forskning stöddes av den ryska Science Foundation (nr 15-14-10008) och ryska Foundation för grundforskning (nr 15-29-01003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
