Summary
يوضح هذا المقالة مبادئ حقن سريعة، وكسبها من الفلورسنت المجهرية الدقيقة في circulatory system الأسماك الصغيرة والتصور في فيفو من المجهرية الدقيقة في دم الأسماك.
Abstract
ويمكن تطبيق الإدارة النظامية للجسيمات الصغيرة الحجم في حي للتصور المفرج، العقاقير واللقاحات، زرع الخلايا المحورة وراثيا وأجهزة الاستشعار البصرية صغيرة. ومع ذلك، ميكروينجيكشنز عن طريق الحقن الوريدي في الحيوانات الصغيرة، والتي تستخدم في الغالب في المختبرات البيولوجية والبيطرية، صعبة جداً وتتطلب موظفين مدربين. هنا، نحن تثبت طريقة قوية وفعالة لإدخال المجهرية الدقيقة في نظام الدورة الدموية للكبار الزرد (دانيو rerio) بحقن في الكلي الأسماك. تصور المجهرية الدقيقة أدخلت في المفرج، نقترح تقنية تصوير إينترافيتال بسيطة في الخياشيم السمكية. في فيفو رصد درجة الحموضة الدم الزرد كان إنجازه باستخدام الفلورية المغلف حقن التحقيق، سنارف-1، لإثبات واحدة من التطبيقات الممكنة لوصف تقنية. هذا المقال يقدم وصفاً مفصلاً لتغليف صبغة حساسة لدرجة الحموضة ويوضح مبادئ حقن سريعة والتصور كبسولات رقيقة جداً التي تم الحصول عليها في فيفو تسجيل إشارة الفلورسنت. تتميز الطريقة المقترحة لحقن بمعدل وفيات منخفض (0-20 في المائة) وكفاءة عالية (النجاح 70-90 ٪)، وأنه من السهل أن المعهد باستخدام المعدات المتاحة عموما. يمكن تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة في أنواع الأسماك الصغيرة الأخرى، مثل أسماك الغابى والميداكا.
Introduction
إدارة الجسيمات الصغيرة الحجم في جسم حيوان مهمة هامة في مجالات مثل المخدرات و تسليم اللقاحات1والمفرج التصور2و زرع الخلايا المحورة وراثيا3وزرع أجهزة الاستشعار البصرية صغيرة 4 , 5-إجراءات غرس جسيمات microscale في نظام الأوعية الدموية في الحيوانات المختبرية الصغيرة غير صعبة، خاصة بالنسبة للكائنات المائية الحساسة. لعينات البحث شعبية مثل الزرد، فإنه ينصح أن يكون توضيح هذه الإجراءات باستخدام بروتوكولات الفيديو.
ميكروينجيكشنز إينتراكاردياك والشعرية تتطلب موظفين مدربين ومرافق الجراحة فريدة لتقديم ميكروبجيكتس في الدم الزرد. سابقا، قد اقترح حقن يدوي الرجعية-المداري3 كطريقة سهلة وفعالة لإدارة كل الخلايا. ومع ذلك، في تجربتنا، بسبب صغر مساحة الشبكة الشعرية العين، يستغرق الكثير من الممارسات لتحقيق النتيجة المرجوة من هذا الأسلوب.
هنا، نحن تصف طريقة لغرس يمثل قوية وفعالة في نظام الدورة الدموية عن طريق الحقن اليدوي مباشرة في أنسجة الكلي الزرد الكبار، وغنية بالشعيرات الدموية والأوعية الكلوية. يستند هذا الأسلوب على البروتوكول الفيديو لزرع الخلايا في الكلي الزرد6، ولكن تم القضاء على الخطوات microsurgical مؤلمة وتستغرق وقتاً طويلاً. الطريقة المقترحة تتسم بانخفاض معدل الوفيات (0-20 في المائة) وكفاءة عالية (النجاح 70-90 ٪)، وأنه من السهل أن المعهد باستخدام المعدات المتاحة عموما.
جزء هام من البروتوكول المقترح هو التصور من مزروع المجهرية الدقيقة (إذا كانوا الفلورسنت أو الملونة) في الشعيرات الدموية الخيشومية، مما يسمح لتحقق نوعية الحقن، وإجراء تقييم نسبي تقريبي لعدد حقن الجسيمات، والكشف عن إشارة الطيفية للقياسات الفسيولوجية مباشرة من الدم الجائل. كمثال للتطبيقات الممكنة لوصف تقنية، نبدي البروتوكول في فيفو قياسات pH دم الزرد استخدام مجس فلورسنت المغلف، سنارف-1، اقترح أصلاً في بورفينسكايا وآخرون. 20175.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التجريبية أجريت وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/الاتحاد الأوروبي للتجارب على الحيوانات، ووافق عليها "الحيوان مواضيع البحوث اللجنة من معهد علم الأحياء" في إركوتسك جامعة ولاية.
1-تصنيع كبسولات رقيقة جداً
ملاحظة: تعد كبسولات رقيقة جداً تحمل صبغة فلورسنت استخدام جمعية طبقة بطبقة مكونة من7،بولييليكتروليتيس المشحونة معاكس8. وأجريت جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة.
- لتوليف المسامية ميكروكوريس3 كربونات أرفق صبغة الفلورسنت، مزيج 2 مل الحل سنارف-1-ديكستران (يمكن استخدام معظم صبغة الفلورسنت البوليمر زمنياً مثل فيتك-جيش صرب البوسنة) بتركيز ~ 2 مغ/مل مع 0.6 مل كل حل من الحلول 1 مول/لتر من كاكل2 و Na2CO3 تحت التحريك السريع.
ملاحظة: إيلاء اهتمام لحساسيات مختلفة من الأصباغ الفلورية إلى فوتوبليتشينج؛ إذا كان يتم استخدام مجس فلورسنت حساسة للضوء (مثل سنارف-1)، فلابد من التلاعب وتخزين المجهرية الدقيقة مع كالقليل من الضوء قدر الإمكان. - بعد 5-10 ق من الانفعالات، نقل التعليق 2 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ق في 10,000-12,000 ز بيليه ميكروكوريس3 كربونات الكالسيوم.
- تجاهل المادة طافية ويغسل النوى مع ~ 2 مل مياه ريسوسبيند بيليه بالهز.
- كرر الإجراء الطرد المركزي والغسل ثلاث مرات في المجموع. بعد الطرد المركزي الماضي، تجاهل المادة طافية.
- احتضان ميكروكوريس لمدة 1 دقيقة في حمام الموجات فوق الصوتية للحد على التجميع.
تنبيه: لا تنسى لحماية الأذنين مع سماعات الرأس. - أن تودع في الطبقة الأولى البوليمر على القوالب ريسوسبيند النوى في مل ~ 2 حل 4 مغ/مل من poly(allylamine hydrochloride) (PAH) في 1 مول/لتر كلوريد الصوديوم.
- الحفاظ ميكروكوريس في الحل لدقيقة ~ 5 مع الرج المستمر.
- وبعد 15 ثانية للطرد المركزي، تجاهل المادة طافية مع الهيئة العامة للإسكان غير منضم. أغسل ميكروكوريس مغطاة بالمياه على الأقل 3 مرات عن طريق الطرد المركزي متعددة والغسيل الخطوات. بعد الطرد المركزي الماضي، تجاهل المادة طافية.
- احتضان ميكروكوريس لمدة 1 دقيقة في حمام الموجات فوق الصوتية للحد على التجميع.
ملاحظة: إذا كانت صبغة الفلورسنت التطبيقية الأيوني، بدء من بولي (الصوديوم 4-ستيرينيسولفوناتي) (PSS) في 1 مول/لتر كلوريد الصوديوم (راجع الخطوة 1، 7).
- كرر الخطوة 1.6 مع مل ~ 2 حل 4 مغ/مل من PSS (كما تحتوي على 1 مول/لتر كلوريد الصوديوم) بإيداع الطبقة الثانية البوليمرية في القوالب.
- كرر الخطوات من 1.6 و 1.7 ست مرات بإيداع 12 طبقات البوليمر.
ملاحظة: لا ينصح لتأخذ استراحة طويلة (ح ~ 12 أو أكثر) قد تم إيداع في الإجراء حتى ~ 3-5 طبقات لكربونات الكالسيوم3 ميكروكوريس دون تغطية قد تميل إلى ريكريستاليزي. ملاحظة أن التغطية PSS الأسباب تجميعاً أعلى من ميكروكوريس، ووقفه طويلة من المستحسن إلا عند الهيئة العامة للإسكان أو بولي-L-يسين المطعمة بالبولي إيثيلين غليكول (PLL-ز-شماعة) هي طبقة قصوى. - احتضان ميكروكوريس المغطاة في 2 مغ/مل PLL-ز-شماعة (~ 1 مل كل microtube) على الأقل ح 2.
- أغسل ميكروكوريس بالمياه عن طريق الطرد المركزي متسلسلة واستثارة الخطوات. بعد الطرد المركزي الماضي، تجاهل المادة طافية.
- للحصول على كبسولات رقيقة جداً جوفاء، حل القوالب3 كربونات الكالسيوم بإضافة 2 مل من 0.1 mol/L الإيثيلين حمض (يدتا) الحل (المعدل للأس الهيدروجيني 7.1 مع هيدروكسيد الصوديوم) إلى ميكروكوريس مغطاة.
- بعد دقيقة ~ 5 من الحضانة، الطرد المركزي كبسولات رقيقة جداً 45 ثانية وتجاهل المادة طافية مع يدتا.
- كرر الخطوات من 1، 10-1.10.1 مرتين.
- أغسل كبسولات رقيقة جداً مع 0.9% كلوريد الصوديوم ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي عدة خطوات داخل 45 s متبوعاً بالغسيل الخطوات. بعد آخر خطوة الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية.
ملاحظة: الحل النهائي ميكروكابسولي للحقن يجب أن تظل عقيمة (على سبيل المثال عن طريق إضافة الأمبيسلّين، 0.1 مغ/مل)، ووسائل الإعلام يجب أن يكون متوافق حيويا هدف التحقيق (وسائل الإعلام متساوي التوتر مع الأس الهيدروجيني المحايدة). - تقدير تركيز استعداد كبسولات رقيقة جداً في هيموسيتوميتير تحت مجهر الأسفار. اتخاذ سلسلة من الصور من كبسولات رقيقة جداً وقياس القطر حول استخدام البرمجيات9 أو ما يعادلها ImageJ كبسولات رقيقة جداً مائة التحقيق في توزيع حجم استخدام الرسم بياني.
- متجر الحصول على تغليف المسبار في الظلام.
ملاحظة: بعد عدة الغسالات في العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم، يمكن تخزينها في كبسولات رقيقة جداً لمدة أشهر في 4 درجات مئوية. لا ينصح بتجفيف كاملة من كبسولات رقيقة جداً أثناء التخزين.
2-إعداد الإعداد الضوئية ومعايرة المغلف سنارف-1
ملاحظة: قياسات pH الخام مع المغلف سنارف-1 يمكن إجراء باستخدام الصور في قناتين ل مجهر فلوري7، ولكن في هذا البروتوكول مجهر فلوري قناة واحدة متصلة مطياف ألياف طبق.
- ضع المجموعة المطلوبة من مرشحات الأسفار إلى مجهر فلوري وفقا لخصائص صبغة الفلورسنت التطبيقية وتشغيل المصابيح الفلورية.
- سحب الرافعة للعدسات.
تنبيه: الخفيفة الزائدة يمكن أن تلحق الضرر مصفوفة مطياف. وهكذا، تأكد من أن الذراع في وضع "عينية" عندما لا يستخدم في المطياف. - الاتصال واحدة من نهاية الألياف الضوئية والمطياف والطرف الآخر لصيد تلسكوب. استخدام محولات، مكان صيد تلسكوب في تركيز أنبوب الكاميرا أو منفذ آخر متاح من مجهر فلوري.
- قم بتشغيل والمطياف. قم بتشغيل برنامج مراقبة مطياف وإعداد والمطياف للقياسات.
- سحب الرافعة للعدسات.
- لمعايرة دفعة ميكروكابسولي، ضع ~ 5 ميليلتر من تعليق ميكروكابسولي (000 ~ 10 كبسولات رقيقة جداً كل ميليلتر في المياه) على شريحة مجهر، والجاف للهبوط في مكان مظلم (على سبيل المثال، في الحرارة على 35 درجة مئوية).
- لمعايرة خصائصها الطيفية المغلف سنارف-1، استخدم سلسلة من المخازن المؤقتة مع قيم الأس الهيدروجيني مختلفة في النطاق ~ 6-9. إسقاط ~ 10 ميليلتر من المخزن المؤقت إلى المجفف كبسولات رقيقة جداً مع سنارف-1-ديكستران وتغطية ذلك مع ساترة.
- ضع الشريحة الزجاجية في مرحلة المجهر. قم بتحديد موقع كبسولات رقيقة جداً استخدام هدفا 40 ×.
- تشغيل ذراع المجهر إلى منفذ الكاميرا. تسجيل هذه الأسفار مع والمطياف. قم بتشغيل الرافعة مرة أخرى إلى العدسات.
ملاحظة: تأكد من إشارة الطيفي أبعد من مستوى الخلفية، والتأكد من أن كبسولات رقيقة جداً في مجال الرؤية ليست في فقاعة (عن طريق التحول إلى تكبير السفلي إذا لزم الأمر). تجنب الإضاءة فترات طويلة من كبسولات رقيقة جداً نفس. سنارف-1 حساس فوتوبليتشينج. - كرر الخطوة 2.2.3 كبسولات رقيقة جداً مختلفة من 10-15 مرة.
- حساب نسب ذروة الأسفار (على سبيل المثال، استخدام R أو Scilab) لجميع أطياف المسجلة وتحديد خط الانحدار بين المعدل الوسيط (لكل المخزن المؤقت) ومتوسط الرقم الهيدروجيني باستخدام الصيغة التالية:
ملاحظة: قد سنارف-1 طائفة مع قمم اثنين المقابلة لانبعاث صبغ البروتونية وديبروتوناتيد، والنسبة بين القمم تستجيب للرقم الهيدروجيني للوسط. في هذه الدراسة، يتم استخدام النسبة بين كثافة الأسفار ل 605 و 660 شمال البحر الأبيض المتوسط. ويتم اختيار هذه الأطوال الموجية اعتماداً على مجموعة عوامل التصفية المستخدمة. و ب معاملات يحددها الانحدار غير الخطي (على سبيل المثال، باستخدام البحث والتطوير). القيم 0.15 و 1.1 هي، على التوالي، قيم الحد الأدنى والحد الأقصى أنا605/I660 ولاحظ أثناء المعايرة. - جمع حوالي 10 ميليلتر من الدم الأسماك من الحيوانات الكبار حوالي 5. مكان السمك في طبق بتري مع 1 ميليلتر/مل المياه تعليق زيت القرنفل للتخدير والانتظار حتى يتحول على جانبها الحيوان وتوقف عن الاستجابة القرصات زعنفة (عادة ~ 2-3 دقيقة). نقل الأسماك على شريحة زجاج. قطع ذيل سمكة مع مجلة لانسيت، وجمع حوالي 2 ميليلتر من الدم الأسماك من هذا السياق الذيل.
ملاحظة: لمنع تخثر الدم، علاج الشق مع الهيبارين (5000 U/mL) واستخدام الزجاج هيبارينيزيد الشعيرات الدموية وأنابيب ميكروسينتريفوجي لجمع الدم.- التنقيط حوالي 10 ميليلتر من الدم مع ماصة على غيض من ميكروليكترودي وتحديد الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
- قطره دم إلى شريحة مع المجفف كبسولات رقيقة جداً، وسجل نسبة كثافة الأسفار كما هو موضح للمخازن المؤقتة المعايرة (الخطوات 2، 2، 2-3).
- ضبط المعامل الخطي على منحنى المعايرة لجعل المنحنى يتطابق مع القياسات في دم الأسماك (لمزيد من التفاصيل انظر بورفينسكايا وآخرون عام 20175).
3-التحضير للحقن
- الإفراج عن إبرة الصلب من طرف القلم الأنسولين (أو حقنه) عن طريق إزالة البلاستيك مع انسيت حادة.
ملاحظة: أي إبرة رقيقة (Ø0.33 ملم أو أقل) أو الزجاج الشعرية (عادة Ø1 مم) يمكن أن تكون مستعدة ل microinjection10،11. - أدخل الإبرة في منتصف الطريق في ميكروكابيلاري الزجاج؛ بسرعة ولطف جندي باستخدام شعلة غاز.
- الاتصال ميكروكابيلاري الزجاج ميكروينجيكتور ومسح بالماء المعقم ثلاث مرات. ضمان تدفق السائل من خلال الإبرة.
- ملء هذا النظام مع الماء المقطر.
ملاحظة: تأكد من هناك لا فقاعات في النظام.
4-حقن
- ريسوسبيند تعليق استعداد كبسولات رقيقة جداً (من العقيمة 0.9% استخدام كلوريد الصوديوم، أو أية وسائط أخرى للحقن، مع تركيز من 0.5 إلى 6 مليون كبسولات رقيقة جداً الواحد ميكروليتير) استخدام الحمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: منذ كبسولات رقيقة جداً تميل إلى أن يعجل، من خلال حقن التالية، تهز القنينة مع كبسولات رقيقة جداً ميكانيكيا (باستخدام دوار) أو يدوياً كل بضع دقائق ريسوسبيند لهم ومنع على التجميع. - ضع السمك في طبق بتري مع مخدر (0.1 مل/لتر زيت القرنفل معلقة في الماء) ~ 2-3 دقيقة انتظر حتى الأسماك يتحول على جانبها وتوقف عن الاستجابة إلى رشة خفيفة fin.
- باستخدام ملعقة، نقل الأسماك من المخدر ووضعه برفق على اسفنجة رطبة في موقف أفقي مع الرأس نحو اليسار (للشخص اليد اليمنى) أو نحو اليمين (بالنسبة لشخص أعسر).
- قبل الحقن، تمتص 1-2 مم هواء إلى الزجاج الشعرية المرتبطة ميكروينجيكتور. ثم تحميله مع حوالي 2 ميليلتر من كبسولات رقيقة جداً فرقت.
ملاحظة: قبل الحقن، يجب تعديل الحل ميكروكابسولي إلى درجة الحرارة التي يتم الاحتفاظ الأسماك. - بلطف استقرار جسم الأسماك في الأسفنج مع جهة غير المهيمنة.
- البحث عن الخط الجانبي للأسماك. حدد جزء الذي يمتد من operculum إلى نهاية تجويف البطن عقلياً. العثور على الوسط من هذا الجزء. وضع الإبرة 1 ملم أقل في اتجاه البطني.
- مع حركة القشط، تحرك بلطف السمك جداول جانبا، وجعل ثقب. أدخل الإبرة في الجسم بزاوية 45 ° إلى السطح الجدول.
- دفع الإبرة نحو العمود الفقري ثم ضعه بعناية ضدها.
- الإفراج عن حوالي 1 ميليلتر من تعليق كبسولات رقيقة جداً في الكلي، وسحب الإبرة ببطء.
ملاحظة: للعثور على الموقع الصحيح ثقب بسهولة أكبر، أنها مفيدة للممارسة إيجاد الكلي الجذع ترانسيلوميناتينج الأسماك باستخدام ضوء السفلي، كما هو مبين في الشكل 2 ألف و 2 باء.
- يشطف السمك من الرأس إلى الذيل مع تيار الماء لإزالة أي كبسولات رقيقة جداً المنسكب في موقع الحقن.
5. التصور في فيفو
- استخدام مقص تشريح لإزالة غطاء الخياشيم من رأس السمك وأنصارها الخياشيم السمكية. شطف الخياشيم مع الماء.
- باستخدام ملعقة، نقل الأسماك إلى شريحة مجهر، ووضعه في مرحلة مجهر فلوري.
ملاحظة: تأكد من أن خياشيم الأسماك لم تجف خلال الإجراءات المتعاقبة. لتجنب هذا الأمر، بشكل دوري ترطيب لهم مع المياه باستخدام ماصة باستور (تقريبا كل دقيقة 1-2). - تلقي بظلالها الغرفة واستخدام التكبير المنخفض (× الهدف 10) تفقد الخياشيم للعثور كبسولات رقيقة جداً الفلورسنت.
ملاحظة: عند استخدام هذا الإجراء لإدخال بعض الجسيمات الفلورية في الأسماك الدموية، من المستحسن لتفقد الخياشيم للعديد من الأفراد للجسيمات الفلورية غير متوقعة قبل الحقن. لا تملك خياشيم الزرد البرية من نوع أوتوفلوريسسينسي، ولكن في بعض الحالات المتفرقة الجسيمات الفلورية (مثل قطع الطعام أو أحادي الخلية سيمبيونتس) قد تكون موجودة على الخياشيم. إذا الضرورية، مثل هذه الجسيمات يمكن التعرف عليها استناداً على شكل معين (على سبيل المثال، قد قطع الغذاء شكل منتظم، على عكس كروية كبسولات رقيقة جداً) أو الطيف الأسفار (أي لون).- تبديل العدسة إلى قوته أعلى (الهدف × 40)، وموقف ميكروكابسولي أو مجموعة من كبسولات رقيقة جداً في مركز مجال الرؤية.
- تشغيل الذراع إلى الميناء مع مطياف متصلة. تسجيل إشارة الطيفية.
- قم بتشغيل الرافعة مرة أخرى إلى العدسة.
- كرر القياسات مختلفة كبسولات رقيقة جداً عدة مرات.
- نقل الأسماك إلى حوض السمك مع التهوية المناسبة للانتعاش.
ملاحظة: مع الحد الأدنى من الممارسة، من الممكن القيام بالحقن وإشارة تسجيل معدل تقريبي من 2-3 دقيقة لكل الأسماك. يمكن تكرار القياس واحد فردية عدة مرات باستخدام جرعات منخفضة، غير مؤذية المتكررة للتخدير أو أسلوب آخر للتثبيت. للمراقبة طويلة الأجل، واستخدام نظام مع التخدير المستمر12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تأتي النتائج التي تم الحصول عليها من واحدة من الفئات الرئيسية الثلاث للبروتوكول المقدم: تشكيل المجهرية الدقيقة الفلورسنت بتغليف صبغة الفلورسنت (الشكل 1)، حقن كبسولات رقيقة جداً مع مزيد من المرئيات في الكلي جيل الشعيرات الدموية (الشكل 2 و 3) و، أخيرا، في فيفو الطيفية تسجيل الأسفار سنارف-1 لمراقبة الدم مستويات الأس الهيدروجيني (الشكل 4).
اتهم النهج طبقة بطبقة طلاء من النوى قالب كربونات الكالسيوم3 أرفق الصبغة بطبقات متعددة من معاكس باستخدام البوليمرات (الهيئة العامة للإسكان و PSS) وطبقة أبعد من البوليمر متوافق حيويا (PLL-ز-شماعة) وسيلة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة السماح لتغليف مختلف المسابر الفلورسنت مثل سنارف-1-ديكستران، فيتك-جيش صرب البوسنة أو غيرها (الشكل 1A). كنتيجة لذلك، يتم الحصول على أجوف كبسولات رقيقة جداً من مكرمترك الحجم بقذائف مطاطا يسهل اختراقها شبه مستقرة ومحملة بصبغة الفلورسنت (الشكل 1B). كبسولات رقيقة جداً ملفقة بهذا الأسلوب عادة غير موحدة، مع توزيع الطبيعي لحجم الجسيمات وحجم متوسط مميزة في كل دفعة (الشكل 1С).
الشكل 1 : طبقة بطبقة توليف ووصف كبسولات رقيقة جداً بولييليكتروليتي جوفاء محملة بصبغة فلورسنت. (أ) نظام جمعية كبسولات رقيقة جداً (المستمدة من مخطط مماثل نشر في جوركوف et al. عام 20164). (ب) صورة جوفاء كبسولات رقيقة جداً محملة بصبغة الفلورسنت فيتك-جيش صرب البوسنة. (ج) حجم توصيف دفعة من كبسولات رقيقة جداً من الشكل 1B. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
يمكن أن يؤديها غرس يمثل قوية وفعالة في نظام الدورة الدموية للأسماك الصغيرة عن طريق الحقن اليدوي مباشرة في الكلي الأسماك. الثقب في الموقع الصحيح من جسم الأسماك (جذع الكلي) أمر حاسم للتسليم السريع المجهرية الدقيقة عن طريق الحقن اليدوي. الكلي الأسماك جهازا المكونة للدم ويحتوي على ميلانوفوريس المصطبغة، وهكذا، هو اللون جيدا. نظراً لأنها تقع بين الدوائر شفافة المثانة السباحة، فمن السهل تحديد الجهاز الذي في الحيوان سليمة مع تصبغ ضعيفة أو بواسطة تضوء من الأسماك الصغيرة باستخدام مصدر ضوء السفلي، كما هو مبين في الشكل 2 ألف و 2 باء.
الشكل 2 : تعريب الموقع المناسب لحقن الكلي. (أ) الإضاءة العابرة من الزرد يوضح التعريب الكلي الجذع (السهم). (ب) مخطط يوضح كيفية تحديد موقع الثقب الصحيح. خط منقط أبيض يشير إلى الخط الجانبي للجزء البطن من الأسماك. يشير السهم إلى الموقع للثقب والاتجاه الصحيح للحقن باتجاه العمود الفقري. المثانة السباحة المعينة بالخط الأخضر. (ج) التصور الكلي الزرد بعد إزالة الأجهزة وجدار الجسم. يشير سهم إلى الإنتفاخ المركزي الكلي الجذع. (د) قسم النسيجي السهمي من ريريو دال- يوضح تشريح عام للأجهزة الداخلية للأسماك الكبار (وصمة عار ح & ه)- (ه) صورة مجهرية السمك الكلي (منقط) تحجيم من (د) مع سهم يشير إلى التجويف الوريد الكاردينال اللاحق. وتشير العلامات النجمية إلى المثانة السباحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
للتحقق من نجاح عملية الحقن، ينبغي تفتيش البصري سريع من الخياشيم تكبير منخفضة (الهدف x10-20) بعد قطع غطاء الخياشيم السمكية (الشكل 3A). على الرغم من معظم كبسولات رقيقة جداً المتبقي في موقع الحقن، أو تسرب في تجويف الجسم (الشكل 3B)، إذا حقن القيام بذلك بشكل صحيح، فمن الممكن التقيد كبسولات رقيقة جداً الفلورسنت بحرية عائمة في الشعيرات الدموية الخيشومية من الأسماك المعراة الخياشيم فورا بعد الحقن (الشكل 3). إذا تم الكشف عن لا الجسيمات الفلورية في الخياشيم، من الممكن تكرار الحقن في الثقب ذاته. ينبغي الحصول على النجاح في إيصال إلى مجرى الدم في حوالي 70-90 في المائة من مجموع الأسماك حقن.
الشكل 3 : حقن الكلي من كبسولات رقيقة جداً مع مزيد من المرئيات في الشعيرات الدموية الخيشومية. (أ) الخطة الشاملة لإيصال ميكروكابسولي إلى مجرى الدم الزرد. (ب) صورة الفلورسنت الزرد بعد حقن كبسولات رقيقة جداً مع الصبغة الخضراء فيتك-جيش صرب البوسنة (الموقع ثقب المشار إليها سهم). (ج) يوضح هذه الصورة من خياشيم الأسماك، وتحجيم من (ب)، النجاح في إيصال كبسولات رقيقة جداً بواسطة حقن الكلي (خياشيم الزرد البرية من نوع قد لا أوتوفلوريسسينسي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
خلال الحقن مباشرة في الكلي جذع الأسماك، كدمات عادة أشكال تحت الموقع الثقب، ويشير إلى الأضرار بالشعيرات الدموية حمة أو الأوعية الكلوية. هناك لا تسرب الدم خارج الجسم لأنه يبدو الثقب بسرعة التعاقد. على الرغم من نزيف داخلي، لا يزال يمكن استرداد الأفراد مع ما يقرب من 80-90% من الباقين على قيد الحياة من خلال الإجراء (الجدول 1). ومن المعروف أيضا أن أنواع الأسماك يمكن تجديد النيفرون حيثياته بعد إصابة13،14. إذا يموت أكثر من 20 في المائة أسماك، واحدة يجب التأكد من أن يتم تنفيذ أنيسثيتيزيشن بشكل صحيح.
| صبغة الفلورسنت مغلفة | n | التركيز، وكبسولات رقيقة جداً كل ميليلتر | حجم الحقن، ميليلتر | متوسط القطر من كبسولات رقيقة جداً، ميكرومتر | النجاح في إيصال إلى مجرى الدم الأسماك، % | وفيات بعد الحقن، % | |
| ح 1 | يوم 1 | ||||||
| حقن في الكلي الجذع | |||||||
| فيتك-جيش صرب البوسنة | 36 | 4 × 106 | 1.6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| سنارف-1-ديكستران | 29 | 3-6 × 105 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| المكافحة-ديكستران | 20 | 6 × 106 | 2 | 2.0 | 70 | 0 | 0 |
| 0.9% كلوريد الصوديوم | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| حقن الرجعية-المداري | |||||||
| فيتك-جيش صرب البوسنة | 9 | 1 × 105 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| المكافحة-ديكستران | 11 | 6 × 106 | 1 | 2.0 | 9 | 18 | 0 |
الجدول 1. سلامة وكفاءة إيصال كبسولات رقيقة جداً في مجرى الدم الزرد. يتحدد نجاح الإجراء بوجود المواد الفلورية في الشعيرات الدموية الخيشومية الأسماك.
في حالة عدم كفاية تركيز المجهرية الدقيقة حقن، جزيئات قليلة جداً قد تكون متاحة سرعة تصور في الخياشيم السمكية. في الوقت نفسه، وقف مع تركيز عال جداً يمكن أن تسد الإبرة. في حالة وجود طبقة بطبقة كبسولات رقيقة جداً تجميعها مع متوسط قطرها ~ 2-5 ميكرومتر، تجمعا لكبسولات حوالي رقيقة 4 * 105-6 * 106 جداً كل ميليلتر الأمثل للكشف عن جهد في الخياشيم السمكية بعد حقن في السمك الكلي (الجدول 2).
| التركيز، وكبسولات رقيقة جداً كل ميليلتر | عدد كبسولات رقيقة جداً في مجهر حقل لعرض (الهدف × 20) في الخياشيم لمختلف الأفراد (n = 7 كل تركيز) | ||||||
| 4 × 106 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 × 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 x 104 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 × 103 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
الجدول 2. سجل لعد فيتك جيش صرب البوسنة-التي تحتوي على كبسولات رقيقة جداً في visual ريريو دال- الخياشيم بعد الحقن (1.6 ميليلتر) في الكلي الجذع.
الطريقة المقترحة لغرس المجهرية الدقيقة في نظام الدورة الدموية الأسماك يمكن أن تطبقها في فيفو الرصد لدرجة الحموضة في الدم الزرد مسبار الفلورسنت المغلف، سنارف-1 (الشكل 4). سنارف-1 طائفة مع قمم اثنين المقابلة لانبعاث صبغ البروتونية وديبروتوناتيد (الشكل 4 أ)، وهكذا رسم معايرة المنحنيات للنسبة بين القمم في درجة الحموضة مختلف وسائل الإعلام يمكن أن تكون (الشكل 4 باء). مكونات الدم تؤثر قراءات مغلفة سنارف-1 (الشكل 4 باء)، التي يمكن تقييمها تجريبيا بقياس درجة الحموضة في الدم المتزامن بكبسولات رقيقة جداً ومقياس الأس الهيدروجيني مع ميكروليكترودي زجاج. يجب أن يمكن رسم منحنى معايرة المفترضة لكبسولات رقيقة جداً في الدم الزرد بتحويل منحنى المخازن المؤقتة بمعامل يساوي الفرق الأس الهيدروجيني قياسها تجريبيا (انظر بورفينسكايا وآخرون عام 20175 للحصول على التفاصيل).
درجة الحموضة في الدم في الشعيرات الدموية الخيشومية الزرد لا يزال مستقرا خلال ساعات عدة على الأقل بعد حقن كبسولات رقيقة جداً (الشكل 4). في الوقت نفسه، يؤدي تعرض هايبركابنيك لفترة قصيرة إلى انخفاض يعتد به إحصائيا من درجة الحموضة في الدم، مما يدل على إمكانية تطبيق أسلوب للبحث في فيفو على الأسماك الصغيرة.
الشكل 4 : مثال لرصد الدم الزرد РН بتسجيل الأطياف fluorescence صبغ المغلف سنارف-1- (أ) محملة الأطياف من كبسولات رقيقة جداً استعداد سنارف-1 في مخازن فوسفات الصوديوم على درجة الحموضة المختلفة. (ب) منحنيات المعايرة استعداد حساسة لدرجة الحموضة كبسولات رقيقة جداً في مخازن فوسفات الصوديوم والدم الزرد المستخرجة. ويرد لكل القياسات، يعني ± الانحراف المعياري. (ج) مثال ممثل في فيفو رصد الزرد الدم рН بصبغة سنارف-1 الفلورية مغلفة في الزرد جيل الشعيرات الدموية. في مراقبة الأوضاع، لا يزال درجة الحموضة في الدم مستقرة خلال 4 ساعات بعد الحقن بكبسولات رقيقة جداً، بينما 5 دقائق التعرض تحت هايبركابنيا شديدة (900-1000 مغ/لتر من أول أكسيد الكربون المذاب2) يسبب تحمض الدم الأسماك. تشير العلامة النجمية إلى فرق يعتد به إحصائيا من مجموعة مراقبة موازية مع ف < 0.01 (اختبار مان-ويتني U). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وللتدليل على الحقن المجهرية الدقيقة في الكلي الزرد، استخدمنا شبه نفاذية كبسولات رقيقة جداً محملة صبغ مؤشر. وهكذا، يتضمن البروتوكول إرشادات لتصنيع كبسولات رقيقة جداً استخدام الجمعية طبقة بطبقة polyelectrolytes المشحونة معاكس7،8،،من1516،17 ،18 (الشكل 1A). استفادة من هذه التكنولوجيا أنه من السهل القيام به مع معدات المختبرات المتاحة. تبعاً للظروف والمركبات المستخدمة، يمكن أن تتراوح كبسولات رقيقة جداً ملفقة من 0.5 إلى 100 ميكرومتر مع شل polyelectrolyte نانومتر سميكة15. معلمات التوليف الموصوفة في هذه النتيجة المخطوطة في مرونة كبسولات رقيقة جداً تتكون من 12 طبقات (بالإضافة إلى الطبقة النهائية متوافق حيويا) البوليمرات حوالي 2-6 ميكرومتر في الحجم (الشكل 1 باء وجيم 1). هو الخطوة الأكثر أهمية تحديد حجم كبسولات رقيقة جداً تشكيل ميكروكوريس القالب. تتضمن هذه العملية تلقائية تكوين بلورات كربونات الكالسيوم، وبالتالي، الجسيمات التي تم الحصول عليها غير موحدة. ومن ثم، ينبغي إجراء توصيف لتوزيع حجم ميكروكابسولي لكل دفعة.
مرحلة هامة من هذا البروتوكول هو الأمثل لإيصال المجهرية الدقيقة في نظام الدورة الدموية الزرد دون استخدام تقنيات ميكرومانيبوليشن. إدارة كامل الخلايا عن طريق الحقن الرجعية-المداري قد وصفت سابقا بالتفصيل3. ومع ذلك، في تجربتنا، ليس من السهل للمستخدمين المبتدئين لاكتساب كفاءة حقن وصف أصحاب البلاغ لأن الجيوب الأنفية الرجعية-المداري صغيرة جداً ويقع بالقرب من البلعوم والأقواس الخيشومية، التي سهلة لإصابة بطريق الخطأ بإبرة. منذ أقل من ملليمتر الدقة المطلوبة للحقن، الحقن بشكل صحيح مهمة صعبة. بديل التساوي سريعة وأكثر كفاءة (الجدول 1) حقن حمة الكلي الأسماك مباشرة. أثناء الحقن، الإبرة ميكانيكيا الأضرار الشعيرات الدموية الكلوية والأوعية الدموية (مثلاً، السياق الكاردينال الخلفي أكبر)، الذي يتيح مدخل المجهرية الدقيقة في نظام الدورة الدموية (الشكل 2E). أخيرا، الإنتفاخ المركزي الكلي الجذع في الزرد الكبار كبيرة ما يكفي (تصل إلى 2 مم) لحقن يدوي دون معدات ميكروسورجيكال.
تحديد المواقع المناسبة لابره حقن أمر بالغ الأهمية لإدارة دليل نجاح. يمكنك ممارسة إيجاد الكلي الجذع في الحيوانات سليمة من أسماك ترانسيلوميناتينج استخدام ضوء السفلي، كما هو مبين في الشكل 2 ألف و 2 باء. المخطط في الشكل 2 (ب) يوضح كيفية إجراء الحقن بشكل صحيح. إذا فشل هذا الإجراء لإدارة المجهرية الدقيقة في مجرى الدم، ويمكن إجراء إعادة الحقن في الثقب نفسه في إطار زمني قصير مع عمليا أي تأثير على معدل البقاء على قيد الحياة للأفراد.
حقن في الكلي الجذع من الزرد الكبار (أيضا بنجاح اختبار على الكبار غوبي الشبكي Poecilia) طريقة فعالة للتسليم يمثل في مجرى الدم الأسماك مع وفيات حيوانية المسموح بها؛ بيد أنها ليست مناسبة تماما لإدارة المخدرات بسبب الاختلافات في حجم حقن. نقطة ضعف هذا الأسلوب تسرب كبير للحل خارج الكلي في البطن بسبب الإدارة السريع. ومع ذلك، بقدر نسبي من مضمون حقنها في مجرى الدم يمكن تقريبا تقدير استخدام التصور في الشعيرات الدموية الخيشومية (الجدول 2). هناك أي قيود صارمة من حجم الحقن، ولكن يبدو أن إدارة أكثر من 1 ميليلتر من التعليق غير فعالة. يمكن تطبيق الشعيرات الدموية الزجاج خيرة microinjection؛ ومع ذلك، نظراً لأن عددا كبيرا من كبسولات رقيقة جداً يميل إلى التحريض على التجميع، نوصي باستخدام غ 31-29 (Ø 0.33-0.25 مم) الإبر لتجنب قباقيب في التجويف إبرة من الصلب.
وينبغي رصد نجاح التسليم ميكروكابسولي عن طريق حقن الكلي في مجرى الدم باستخدام التفتيش السريع لوجود الجسيمات الفلورية في الخياشيم. الخياشيم هي الأجهزة الوصول إليها بسهولة للملاحظات في فيفو . خيوط جيل شبكة الشعيرات الدموية تغطيها طبقة رقيقة من الظهارة التنفسية، مما يجعل التصوير إينترافيتال الدم يتدفق في الخياشيم مريحة خاصة (نوع من نافذة ضوئية طبيعية). للقيام المراقبة، ويمكن خفض غطاء الخياشيم الغضروف لفضح خيوط. هذا الإجراء آمنة للأسماك، والتي يمكن أن يعيش مع الخياشيم المعراة في المياه الغازية جيدا دون حدوث انخفاض في متوسط العمر المتوقع. وعلاوة على ذلك، يمكن فحص خياشيم الأسماك الكبيرة تحت مجهر ببساطة عن طريق دفع أوبيركولوم من أصل نحو19. في حال حقنه ناجح، تظهر المجهرية الدقيقة الفلورسنت فورا في الخياشيم (الشكل 3). علما بأن مزروع المجهرية الدقيقة هي حلت إلى حد كبير في حجم الدم الجائل، وتخفيض عدد الجسيمات تصل إلى الشعيرات الدموية الخيشومية، وبالتالي يجب تحديد تركيز كاف من المجهرية الدقيقة للكشف في الخياشيم السمكية بعد حقن في السمك الكلي (الجدول 2).
يمكن تطبيق الإجراء المقترح لغرس في طائفة واسعة من الدراسات التي تنطوي على أنواع مختلفة من الأسماك الصغيرة. على الرغم من هذا الأسلوب وقد وضعت والأمثل لضخ الفلورسنت المجهرية الدقيقة في نظام الدورة الدموية، فإنه يمكن أيضا تطبيقها لغرس غير الملونة الصغيرة/جسيمات نانوية أو فسخ المواد؛ ومع ذلك، في هذه الحالة فعالية حقن ينبغي التحقق من طريقة أخرى. الخطوات الموصوفة حاليا المثلى لمثل هذه الأغراض الفسيولوجية كما رصد استخدام مختلف الضوئية المتناهية الصغر أو nanosensors، وتصور المفرج، تسليم اللقاحات أو الأدوية على بعض الناقلين مرئية بصريا، وغرس الخلايا المحورة وراثيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف الاعتراف إلى حد كبير مساعدة بوغدان أوسادتشيي وقد بروتاسوف (جامعة ولاية إيركوتسك، روسيا) في إعداد البروتوكول الفيديو. وأيد هذا البحث "المؤسسة الروسية" للعلوم (#15-14-10008) و "مؤسسة روسية" عن "البحوث الأساسية" (#15-29-01003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
