Summary
Dit artikel demonstreert de beginselen van een snelle, minimaal invasieve injectie van fluorescerende microdeeltjes in de circulatory system van kleine vissen en de visualisatie in vivo van het microdeeltjes in vis bloed.
Abstract
De systemische toediening van micro-formaat deeltjes in een levend organisme kan worden toegepast voor therapieën visualisatie, drugs en levering van vaccin, implantatie van transgene cellen en kleine optische sensoren. Echter intraveneuze microinjections in kleine dieren, die meestal in biologische en veterinaire laboratoria worden gebruikt, zijn zeer moeilijk en vereist opgeleid personeel. Hierin tonen wij een robuuste en efficiënte methode voor het binnenbrengen van deeltjes in de bloedsomloop van volwassen zebravissen (Danio rerio) door injectie in de nier vis. Om te visualiseren de geïntroduceerde microdeeltjes in de therapieën, stellen wij voor een eenvoudige intravital beeldvormende techniek in de kieuwen van de vis. In vivo monitoring van de zebravis bloed pH werd uitgevoerd met behulp van een ingespoten microencapsulated TL probe, SNARF-1, om aan te tonen een van de mogelijke toepassingen van de beschreven techniek. Dit artikel bevat een gedetailleerde beschrijving van de inkapseling van pH-gevoelige kleurstof en toont aan de beginselen van de snelle injectie en visualisatie van de verkregen microcapsules voor in vivo opname van het fluorescerende signaal. De voorgestelde methode van injectie wordt gekenmerkt door een laag sterftecijfer (0-20%) en hoog rendement (70-90% succes), en het is eenvoudig in te stellen met behulp van algemeen beschikbare apparatuur. Alle beschreven procedures kunnen worden uitgevoerd op andere kleine vissoorten, zoals guppies en medaka.
Introduction
Het beheer van micro-formaat deeltjes in een dierlijke organisme is een belangrijke taak op gebieden zoals drugs en vaccin levering1, therapieën visualization2transgene cel implantatie3en kleine optische sensor implantatie 4 , 5. de implantatie procedure voor microscale deeltjes in het vaatstelsel van kleine laboratoriumdieren is echter moeilijk, vooral voor delicate waterorganismen. Voor specimens van de populaire onderzoek zoals zebrafish, is het raadzaam dat deze procedures worden verduidelijkt met behulp van video protocollen.
Intracardiac en capillaire microinjections nodig opgeleid personeel en unieke microchirurgie voorzieningen voor de levering van microobjects in zebrafish bloed. Eerder, een retro-orbitaal Handleiding injectie3 werd voorgesteld als een gemakkelijke en effectieve methode voor het beheer van hele cellen. Echter in onze ervaring duurt vanwege de kleine oppervlakte van het oog capillaire netwerk, het veel praktijk om het gewenste resultaat van deze techniek.
Hierin beschrijven we een methode voor robuuste en efficiënte microparticle implantatie in de bloedsomloop door Handleiding injectie rechtstreeks in het nierweefsel van volwassen zebrafish, die rijk is aan haarvaten en renale vaartuigen. Deze techniek is gebaseerd op het video protocol voor cel transplantatie in de zebravis nier6, maar de traumatische en tijdrovende microchirurgische stappen werden uitgeschakeld. De voorgestelde methode wordt gekenmerkt door lage sterfte (0-20%) en hoog rendement (70-90% succes), en het is eenvoudig in te stellen met behulp van algemeen beschikbare apparatuur.
Een belangrijk onderdeel van het voorgestelde protocol is de visualisatie van de geïmplanteerde microdeeltjes (als ze TL of colorized zijn) in de haarvaten van gill, dat voorziet in de verificatie van de kwaliteit van de injectie, een ruwe relatieve beoordeling van het aantal ingespoten deeltjes, en de opsporing van de spectrale signaal voor fysiologische metingen vanuit het circulerende bloed. Als een voorbeeld van de mogelijke toepassingen van de beschreven techniek, wij laten zien dat het protocol voor in vivo metingen van zebravis bloed pH met behulp van een microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1, oorspronkelijk voorgesteld in Borvinskaya et al. 20175.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijn 2010/63/EG voor dierproeven en zijn goedgekeurd door het dier onderwerpen onderzoek Comité van Instituut Biologie aan de Universiteit van de staat van Irkoetsk.
1. fabricage van Microcapsules
Opmerking: De Microcapsules uitvoering een fluorescente kleurstof worden bereid met een laag-voor-laag-vergadering van tegengesteld geladen polyelectrolytes7,8. Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- Om te synthetiseren poreuze CaCO3 microcores bijvoeging van de fluorescente kleurstof, Meng 2 mL van de oplossing van de SNARF-1-dextran (de meeste polymeer-gebonden fluorescente kleurstof zoals FITC-BSA kan worden gebruikt) met een concentratie van ~ 2 mg/mL met 0,6 mL elk van 1 mol/L-oplossingen van CaCl2 en Na2CO3 snel roeren.
Opmerking: Aandacht besteden aan de verschillende gevoeligheden van fluorescente kleurstoffen aan photobleaching; Als een lichtgevoelige fluorescente sonde (zoals SNARF-1) wordt gebruikt, moeten de manipulatie en de opslag van de deeltjes worden uitgevoerd met zo weinig licht mogelijk. - Na 5-10 s van agitatie, spoel de suspensie 2 mL microcentrifuge buizen en centrifuge voor 15 s bij 10.000-12.000 g tot pellet CaCO3 microcores.
- Verwijder het supernatant, wassen van de kernen met ~ 2 mL gedeïoniseerd water en resuspendeer de pellet door schudden.
- Herhaal de procedure centrifugeren-wassen drie keer in totaal. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant.
- Incubeer de microcores gedurende 1 minuten in een ultrasoonbad om hun aggregatie.
Let op: Vergeet niet om de oren met koptelefoon te beschermen. - Om te storten de eerste polymeer laag van de sjablonen, resuspendeer de kernen in ~ 2 mL van een 4 mg/mL oplossing van poly(allylamine hydrochloride) (PAH) in 1 mol/L NaCl.
- Houd de microcores in de oplossing voor ~ 5 min met constante schudden.
- Na 15 albums van centrifugeren, verwijder het supernatant met de niet-afhankelijke PAH. De overdekte microcores met gedeïoniseerd water minstens 3 maal door middel van meerdere centrifugeren en wassen stappen wassen. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant.
- Incubeer de microcores gedurende 1 minuten in een ultrasoonbad om hun aggregatie.
Opmerking: Als de toegepaste fluorescente kleurstof kationische, begint van poly (natrium-4-styreensulfonaat) (PSS) in 1 mol/L NaCl (zie stap 1.7).
- Herhaal stap 1.6 met ~ 2 mL van een 4 mg/mL oplossing van PSS (ook met 1 mol/L NaCl) om te storten de tweede polymeer laag van de sjablonen.
- Herhaal stap 1.6 en 1.7 zesmaal te deponeren 12 polymere lagen.
Opmerking: Het is niet aanbevolen om een lange pauze (~ 12 h of meer) te nemen in de procedure tot ~ 3-5 lagen zijn nedergelegd omdat CaCO3 microcores zonder dekking kunnen de neiging om recrystallize. Merk op dat PSS dekking een hogere aggregatie van de microcores veroorzaakt en de lange pauze is aan te raden dat alleen wanneer pak of poly-L-lysine met polyethyleenglycol geënt (PLL-g-PEG) is de buitenste laag. - Incubeer de overdekte microcores in 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL per microtube) gedurende ten minste 2 uur.
- Wassen van de microcores met water via opeenvolgende centrifugeren en resuspensie stappen. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant.
- Voor het verkrijgen van holle microcapsules, Los de CaCO3 sjablonen door toevoeging van 2 mL 0,1 mol/L ethyleendiamminetetra (EDTA) zuuroplossing (aangepast aan de pH 7.1 met NaOH) naar de overdekte microcores.
- Na ~ 5 min van incubatie, centrifugeer de microcapsules voor 45 s en negeren het supernatant met de EDTA.
- Herhaal stap 1.10-1.10.1 tweemaal.
- Wassen van de microcapsules met 0,9% NaCl driemaal door meerdere centrifugeren binnen 45 stappen s gevolgd door wassen stappen. Na de laatste stap van het centrifugeren, verwijder het supernatant.
Opmerking: De uiteindelijke microcapsule oplossing voor injectie moet worden bewaard steriele (bijvoorbeeld door toevoeging van ampicilline, 0,1 mg/mL), en de media moeten biocompatibel met het doel van onderzoek (isotone media met neutrale pH). - Schatting van de concentratie van de bereid microcapsules in een hemocytometer onder een fluorescentie Microscoop. Neem een serie foto's van de microcapsules, meet de diameter van over de honderd microcapsules ImageJ9 of gelijkwaardige softwarematig en onderzoeken de grootteverdeling met behulp van een histogram.
- Winkel de verkregen ingekapseld sonde in het donker.
Opmerking: na enkele wasbeurten in steriele 0.9% NaCl, de microcapsules kunnen worden opgeslagen voor maanden bij 4 ° C. Volledige droging van de microcapsules tijdens de opslag wordt niet aanbevolen.
2. voorbereiding van optische Setup en kalibratie van Microencapsulated SNARF-1
Opmerking: Ruwe pH metingen met microencapsulated SNARF-1 kan worden gemaakt met behulp van afbeeldingen in twee kanalen van een fluorescente microscoop7, maar in dit protocol een één-kanaals fluorescente microscoop op een vezel-spectrometer aangesloten werd toegepast.
- Plaats van de vereiste set fluorescentie filters om de fluorescente microscoop volgens de kenmerken van de toegepaste fluorescente kleurstof en inschakelen van de TL-lamp.
- Trek de hendel aan de oculairs.
Let op: Teveel licht kan schade aan de spectrometer-matrix. Dus, zorg ervoor dat de hendel in de modus "oculair" wanneer de spectrometer wordt niet gebruikt. - Sluit één uiteinde van de optische vezel aan de spectrometer en het andere uiteinde op een collimator. Plaats de collimator met adapters in de focus van de camera-buis of andere beschikbare poort van de fluorescente microscoop.
- Inschakelen van de spectrometer. De spectrometer controleprogramma uitvoeren en stel de spectrometer voor metingen.
- Trek de hendel aan de oculairs.
- Voor de kalibratie van de microcapsule partij, ~ 5 µL van de microcapsule ophanging (microcapsules ~ 10 000 per µL in gedeïoniseerd water) op een microscoopglaasje plaats en drogen van de druppel op een donkere plek (bijvoorbeeld in een thermostaat bij 35 ° C).
- Als u wilt kalibreren de spectrale kenmerken van de microencapsulated SNARF-1, door een reeks van buffers met verschillende pH-waarden in het bereik ~ 6-9 te gebruiken. ~ 10 µL van een buffer op de gedroogde microcapsules met SNARF-1-dextran drop en bedek het met een dekglaasje aan.
- Plaats het glasplaatje in het werkgebied van de Microscoop. Zoek de microcapsules met behulp van een × 40 doelstelling.
- Zet de hendel van de Microscoop op de poort van de camera. Registreren hun fluorescentie met de spectrometer. Zet de hendel terug naar de oculairs.
Opmerking: Zorg ervoor dat de spectrale signaal is tot ver buiten het achtergrondniveau, en zorgen dat de microcapsules in het gezichtsveld niet in een zeepbel (door over te schakelen naar een lagere vergroting indien nodig). Vermijd langdurige verlichting van de dezelfde microcapsules. SNARF-1 is gevoelig voor photobleaching. - Herhaal stap 2.2.3 voor verschillende microcapsules 10 - 15 keer.
- De ratio's van fluorescentie, piek (bijvoorbeeld met behulp van R of Scilab) voor alle geregistreerde spectra berekenen en bepalen van de regressielijn tussen de mediane verhouding (voor elke buffer) en middellange pH met behulp van de volgende formule:
Opmerking: SNARF-1 heeft een spectrum met twee bergtoppen die overeenkomen met de emissie van de kleurstof geprotoneerd en ring, en de verhouding tussen de pieken is reageren op de pH van het medium. In deze studie, wordt de verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie van 605 en 660 nm gebruikt. Deze golflengten worden gekozen afhankelijk van het filter gebruikt. a en b zijn coëfficiënten te bepalen door middel van niet-lineaire regressie (bijvoorbeeld met behulp van R). Waarden 0,15 en 1.1 zijn, respectievelijk, de minimale en maximale waarden van ik605/I660 waargenomen tijdens de kalibratie. - Ongeveer 10 µL van vis bloed van ongeveer 5 volwassen dieren verzamelen. Plaats vissen in een petrischaal met 1 µL/mL water opschorting van kruidnagel olie voor anesthesie en wacht totdat het dier op zijn kant draait en reageert aan snuifjes van de fin (meestal ~ 2-3 min). Het overbrengen van de vis op een glasplaatje. De staart van de vis met een lancet afgesneden en verzamelen van ongeveer 2 µL van vis bloed uit de ader van de staart.
Opmerking: Om te voorkomen dat de bloedstolling, behandelen de incisie met heparine (5000 U/mL) en gebruik van EDTA glazen capillairen en microcentrifuge buizen voor het verzamelen van het bloed.- Ongeveer 10 µL van bloed met een pipet op het puntje van de micro-elektrode druppelen en bepaal de pH met behulp van een pH-meter.
- Drop het bloed op een dia met gedroogde microcapsules en registreren van de verhouding van de intensiteit van de fluorescentie zoals beschreven voor de kalibratie buffers (stappen 2.2-2.3).
- Aanpassen van de lineaire coëfficiënt van de kalibratiekromme te maken van de curve dat overeenkomt met de metingen in het bloed van de vis (voor meer details zie Borvinskaya et al. 20175).
3. voorbereiding voor injectie
- Laat de stalen naald uit het topje van de insuline pen (of spuit) door het verwijderen van de kunststof met een scherpe lancet.
Opmerking: Een dunne naald (Ø0.33 mm of minder) of glazen viscometerbuizen (meestal Ø1 mm) kan worden voorbereid voor microinjection10,11. - Plaats de naald halverwege in het glas-microcapillary; snel en zachtjes soldeer met behulp van een gas fakkel.
- De glazen microcapillary verbinden met de microinjector en het spoelen met steriel water drie keer. Ervoor zorgen dat de vloeistof door de naald stroomt.
- Vul het systeem met gedestilleerd water.
Opmerking: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem.
4. injectie
- Resuspendeer de bereid schorsing van microcapsules (in steriele 0.9% NaCl, of andere media gebruikt voor de injecties, met een concentratie van 0,5 tot 6 miljoen microcapsules per microliter) met behulp van het ultrasoonbad voor 1 min.
Opmerking: Aangezien de microcapsules neigen te precipiteren, tijdens de volgende injectie, schud de flacon met de microcapsules mechanisch (met behulp van een rotor) of handmatig elke paar minuten resuspendeer hen en hun aggregatie wordt voorkomen. - Plaats de vis in een petrischaal met verdoving (0,1 mL/L van kruidnagel olie geschorst in water) voor ~ 2-3 min. wachten totdat de vis op zijn kant draait en reageert op een lichte snuifje van de fin.
- Met behulp van een lepel, overbrengen van de vis uit de verdoving en breng dit voorzichtig op een vochtige spons in een laterale positie met het hoofd naar links (voor rechtshandige persoon) of naar rechts (voor linkshandige persoon).
- Zuigen net vóór de inspuiting, 1-2 mm van lucht in de glazen capillaire verbonden met microinjector. Vervolgens laad het met ongeveer 2 µL van de verspreide microcapsules.
Opmerking: Voordat de injectie, de microcapsule oplossing moet worden aangepast aan de temperatuur waarop de vis worden gehouden. - Zachtjes het stabiliseren van het lichaam van de vis op de spons met niet-dominante hand.
- De zijlijn van de vis te vinden. Mentaal Selecteer een segment dat zich uitstrekt van de operculum aan het einde van de buikholte. Het vinden van het midden van dit segment. Steek de naald 1 mm lager in de ventrale richting.
- Met een schraperig beweging, verplaatsen voorzichtig de vis schalen opzij, en maak een lekke band. Steek de naald in het lichaam in een hoek van 45° naar de tabel oppervlak.
- Duw de nld richting de wervelkolom totdat het zorgvuldig ertegen rust.
- Laat ongeveer 1 µL van de microcapsules schorsing in de nier en de naald langzaam te trekken.
Opmerking: Om te zoeken naar de juiste punctie site gemakkelijker, het is handig om te oefenen het vinden van de kofferbak nier door het transilluminating van de vissen die met behulp van een licht van de bodem, zoals weergegeven in figuur 2A en 2B.
- Spoel de vis van kop tot staart met een stroom van water om eventuele gemorste microcapsules op de injectieplaats.
5. in Vivo visualisatie
- Gebruik de dissectie schaar te verwijderen van de gill-cover uit het hoofd van de vis en denude de kieuwen van de vis. Spoel de kieuwen met water.
- Met behulp van een lepel, de vis naar een microscoopglaasje overbrengen, en plaats deze in het werkgebied van de fluorescente microscoop.
Opmerking: Zorg ervoor dat de kieuwen van de vis niet tijdens opeenvolgende procedures doen uitdrogen. Om dit te vermijden, periodiek hen bevochtigen met water met behulp van een pipet van Pasteur (ongeveer elke 1-2 min). - De kamer donkerder en met behulp van lage vergroting (x 10 doelstelling) inspecteren de kieuwen om te vinden de fluorescerende microcapsules.
Opmerking: Wanneer de procedure wordt gebruikt voor de invoering van sommige fluorescerende deeltjes in de bloedsomloop van de vis, is het aanbevolen om de kieuwen van verscheidene individuen voor onverwachte fluorescerende deeltjes vóór injecties inspecteren. Kieuwen van wild-type zebrafish hebben geen autofluorescence kunnen, maar in sommige gevallen sporadisch fluorescerende deeltjes (zoals voedsel stukken of eencellige symbionten) aanwezig op de kieuwen. Als nodig, deze deeltjes kunnen worden herkend op basis van hun specifieke vorm (bijvoorbeeld voedsel stukken hebben onregelmatige vorm, in tegenstelling tot de sferische microcapsules) of fluorescentie spectrum (bijvoorbeeld kleur).- Overschakelen van de lens naar een hogere magnitude (× 40 doelstelling) en een microcapsule of een groep van microcapsules in het midden van het gezichtsveld plaats.
- Zet de hendel met de poort na een aangesloten spectrometer. Record de spectrale signaal.
- Zet de hendel terug naar het oculair.
- Herhaal de metingen voor verschillende microcapsules meerdere malen.
- De vis overbrengen in het aquarium met goede beluchting voor herstel.
Opmerking: Met minimale praktijk is het mogelijk om uit te voeren van de injectie en signaal opnemen met een geschatte snelheid van 2-3 min per vis. De meting kan worden herhaald voor een individuele meerdere malen met het gebruik van herhaalde lage, onschadelijk doses van verdoving of een andere methode van fixatie. Voor de lange termijn waarneming, een systeem met continu verdoving12te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verkregen resultaten komen uit een van de drie belangrijkste categorieën van de gepresenteerde protocol: de vorming van fluorescerende microdeeltjes door inkapseling van een fluorescente kleurstof (Figuur 1), de nier injectie van microcapsules met verdere visualisatie in Gill haarvaten (Figuur 2 en 3) en, ten slotte, het in vivo spectrale opnemen van SNARF-1 fluorescentie te controleren bloed pH niveaus (Figuur 4).
De aanpak van de laag-voor-laag met behulp van de coating van de kernen van de sjabloon CaCO3 bijvoeging van de kleurstof door meerdere lagen van tegengesteld geladen polymeren (PAH en PSS) en een buitenste laag van een biocompatibele polymeer (PLL-g-PEG) is een eenvoudige en kosteneffectieve methode toe te staan om in te kapselen verschillende TL sondes zoals SNARF-1-dextran, FITC-BSA of anderen (figuur 1A). Dientengevolge, worden holle microcapsules van Micrometrische grootte met stabiele semi-permeabel elastische schelpen en geladen met de fluorescente kleurstof verkregen (figuur 1B). De microcapsules vervaardigd door deze techniek zijn meestal niet-uniforme, met een normale verdeling van de deeltjesgrootte en karakteristiek mediaan grootte in elke partij (Figuur 1С).
Figuur 1 : Laag-voor-laag synthese en karakterisering van holle polyelectrolyte microcapsules geladen met een fluorescente kleurstof. (A) schema van een vergadering van de microcapsules (ontleend aan een soortgelijke regeling gepubliceerd in Gurkov et al. 20164). (B) foto van holle microcapsules geladen met fluorescente kleurstof FITC-BSA. (C) formaat karakterisering van de partij van microcapsules van figuur 1B. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Robuuste en efficiënte microparticle innesteling in de bloedsomloop van kleine vissen kan worden uitgevoerd door handmatige injectie direct in de nier vis. Het lek in de juiste site van het lichaam van de vis (trunk nier) is cruciaal voor de snelle levering van deeltjes door Handleiding injectie. De nier van de vis is een hematopoietische orgaan en gepigmenteerde melanophores bevat, en dus is het goed gekleurd. Omdat het is gelegen tussen transparante kamers van de zwemblaas, is het gemakkelijk te identificeren van het orgel in het intact dier met zwakke pigmentatie of door transillumination van kleine vissen met behulp van een lichtbron onder, zoals afgebeeld in figuur 2A en 2B.
Figuur 2 : Lokalisatie van de juiste site voor nier injectie. (A) Trans-verlichting van de zebravis toont de lokalisatie van de kofferbak nier (pijl). (B) regeling wordt geïllustreerd hoe het identificeren van de juiste punctie-site. De witte stippellijn geeft aan de zijlijn van de abdominale segment van de vis. De pijl geeft de site voor de lekke band en de juiste richting van injectie richting de wervelkolom. De zwemblaas is aangewezen door de groene lijn. (C) visualisatie van zebravis nier na het wegnemen van organen en de muur van het lichaam. Een pijl wijst naar de centrale verdikking van de kofferbak nier. (D) een Sagittaal histologische sectie van D. rerio illustreert de algemene anatomie van de inwendige organen van de volwassen vis (H & E vlek). (E) de opname van een nier van de vis (gestippeld) vanuit (D) met een pijl naar het lumen van de posterieure kardinaal ader geschaald. Sterretjes geven de zwemblaas. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Om te controleren het succes van de procedure van de injectie, moet een snelle visuele inspectie van de kieuwen bij lage vergroting (x10-20-doelstelling) geschieden na het snijden van de vis gill cover (figuur 3A). Ondanks allermeest naar de microcapsules resterende op de injectieplaats of morsen in de lichaamsholte (figuur 3B), als de injectie wordt correct uitgevoerd, is het mogelijk om te observeren de fluorescerende microcapsules vrij zwevend in de haarvaten van de gill van de de kieuwen van het blootgelegde vis onmiddellijk na de inspuiting (Figuur 3 c). Als geen fluorescerende deeltjes op de kieuwen worden aangetroffen, is het mogelijk om te herhalen de injectie in de dezelfde punctie. Succesvolle levering aan de bloedbaan te worden verkregen in ongeveer 70-90% van de totale ingespoten vis.
Figuur 3 : Nier injectie van microcapsules met verdere visualisatie in gill haarvaten. (A) de algemene regeling van de levering van de microcapsule in de bloedbaan van de zebravis. (B) TL afbeelding van een zebravis na de injectie van de microcapsules met groene FITC-BSA kleurstof (de punctie-site wordt aangegeven door een pijl). (C) dit beeld van de kieuwen van vissen, geschaald uit (B), toont de succesvolle levering van microcapsules door injectie van de nier (kieuwen van wild-type zebrafish dan niet geen autofluorescence). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tijdens de injectie direct in de nier van de romp vis vormt uitgebreide kneuzingen normaal onder de site van de punctie, die schade aan de haarvaten parenchym of de renale bloedvaten aangeeft. Er is geen lekkage van de bloed uit het lichaam omdat de punctie lijkt snel contract. Ondanks de interne bloeden, kunnen individuen nog herstellen met ongeveer 80-90% overleven door middel van de procedure (tabel 1). Het is ook bekend dat vissoorten nephrons DOVO na letsel13,14 regenereren kan. Als meer dan 20 gewichtspercenten vis sterven, moet een ervoor zorgen dat de afstomping naar behoren is uitgevoerd.
| Ingekapselde fluorescente kleurstof | n | Concentratie, microcapsules per µL | Geïnjecteerd volume, µL | Gemiddelde diameter van microcapsules, µm | Succesvolle levering in de bloedbaan van de vis, % | Mortaliteit na injectie, % | |
| 1 h | 1 dag | ||||||
| Injectie in de kofferbak nier | |||||||
| FITC-BSA | 36 | 4 x 106 | 1.6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| SNARF-1-Dextraan | 29 | 3-6 x 105 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| RITC-dextran | 20 | 6 x 106 | 2 | 2.0 | 70 | 0 | 0 |
| 0,9% NaCl | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| Retro-orbitaal injectie | |||||||
| FITC-BSA | 9 | 1 x 105 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| RITC-dextran | 11 | 6 x 106 | 1 | 2.0 | 9 | 18 | 0 |
Tabel 1. Veiligheid en efficiëntie van de levering van microcapsules in de bloedbaan van de zebravis. Het succes van de procedure wordt bepaald door de aanwezigheid van de fluorescerende materialen in de haarvaten van de gill vis.
Wanneer de concentratie van de geïnjecteerde microdeeltjes ontoereikend is, wellicht te weinig deeltjes mogelijk te worden snel gevisualiseerd in de kieuwen van de vis. Op hetzelfde moment, kan een ophanging met een te hoge concentratie de naald verstoppen. In geval van laag-voor-laag geassembleerde microcapsules met mediaan diameter ~ 2-5 µm is een concentratie van ongeveer 4 * 105-6 * 106 microcapsules per µL optimaal voor moeiteloos opsporen in de kieuwen van de vis na injectie in vis nier (tabel 2).
| Concentratie, microcapsules per µL | Aantal microcapsules in een Microscoop gezichtsveld (× 20 doelstelling) in de kieuwen van verschillende personen (n = 7 per concentratie) | ||||||
| 4 x 106 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 x 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 x 104 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 x 103 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabel 2. Opnemen van de visuele tellen van FITC-BSA-bevattende microcapsules in D. rerio kieuwen na injectie (1.6 µL) in de kofferbak nier.
De voorgestelde methode microdeeltjes innesteling in de bloedsomloop van de vis kan worden toegepast voor in vivo monitoring van zebravis bloed pH door microencapsulated fluorescente sonde, SNARF-1 (Figuur 4). SNARF-1 heeft een spectrum met twee bergtoppen die overeenkomen met de emissie van de geprotoneerd en ring kleurstof (figuur 4A), dus de kalibratie curven van de verhouding tussen de pieken bij verschillende pH van de media kunnen worden uitgezet (figuur 4B). De onderdelen van het bloed beïnvloeden de uitlezing van de ingekapselde SNARF-1 (figuur 4B), die experimenteel door gelijktijdige meting van pH van het bloed kan worden geëvalueerd door de microcapsules en een pH-meter met een glas micro-elektrode. Een vermeende kalibratiekromme voor microcapsules in zebrafish bloed moet worden uitgezet door het verschuiven van de buffers' curve door de coëfficiënt gelijk aan het verschil van de pH experimenteel gemeten (Zie Borvinskaya et al. 20175 voor meer informatie).
Bloed pH in zebrafish gill haarvaten blijft stabiel tijdens ten minste enkele uren na de injectie van microcapsules (figuur 4C). Op hetzelfde moment leidt een korte hypercapnische blootstelling tot een statistisch significante afname van bloed pH, waaruit blijkt hoe de toepasbaarheid van de methode voor in vivo onderzoek naar kleine vissen.
Figuur 4 : Representatief voorbeeld van het toezicht op de zebravis bloed РН door registratie van de spectra van de fluorescentie van microencapsulated kleurstof SNARF-1. (A) Spectra van de bereid microcapsules geladen met SNARF-1 in natriumfosfaat buffers bij verschillende pH. (B) de kalibratiekrommen van de bereid pH-gevoelige microcapsules in natriumfosfaat buffers en uitgepakte zebrafish bloed. Voor alle metingen, wordt de gemiddelde ± standaardafwijking afgebeeld. (C) een representatief voorbeeld van het in vivo toezicht zebrafish bloed рН door ingekapselde fluorescente SNARF-1 kleurstof in zebrafish gill haarvaten. In controlevoorwaarden blijft bloed pH stabiel gedurende 4 uur na injectie van microcapsules, terwijl 5 minuten blootstelling onder ernstige hypercapnie (900-1000 mg/L van opgeloste CO2) veroorzaakt een verzuring van het bloed van de vis. Sterretje geeft aan statistisch significant verschil uit de parallelle controlegroep met p < 0,01 (Mann-Whitney U test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We gebruikten om aan te tonen de injectie van microdeeltjes in de zebravis nier, semi-permeabel microcapsules geladen met een indicator kleurstof. Dus bevat het protocol instructies voor de fabricage van de microcapsules met behulp van de vergadering van de laag-voor-laag van tegengesteld geladen polyelectrolytes7,8,15,16,17 ,18 (figuur 1A). Een voordeel van deze technologie is dat het gemakkelijk uit te voeren met beschikbare laboratoriumapparatuur. Afhankelijk van de voorwaarden en de verbindingen die worden gebruikt, kunnen de verzonnen microcapsules variëren van 0,5 tot 100 µm met nanometer dik polyelectrolyte shell15. De synthese-parameters die worden beschreven in dit manuscript resultaat in elastische microcapsules bestaande uit 12 lagen (naast de laatste biocompatibel laag) van polymeren in grootte (figuur 1B en 1 C) ongeveer 2-6 µm. De belangrijkste stap bepalen van de grootte van de microcapsules is de vorming van de sjabloon microcores. Dit proces omvat de spontane vorming van calciumcarbonaat kristallen, en daarom de verkregen deeltjes non uniform zijn. Vandaar, moet een karakterisering van de verdeling van de grootte van de microcapsule voor elke batch worden uitgevoerd.
De belangrijke fase van dit protocol is de optimalisatie van de levering van deeltjes in de bloedsomloop van de zebravis zonder het gebruik van micromanipulation technieken. De administratie van hele cellen door retro-orbitaal injectie is eerder beschreven in detail3. In onze ervaring is het echter niet makkelijk voor beginnende gebruikers te winnen van de efficiëntie van de injectie beschreven door de auteurs, omdat de retro-orbitaal sinus is zeer klein en ligt dicht bij de farynx en gill bogen, die gemakkelijk kunnen worden per ongeluk verwonden met een naald. Sinds minder dan een millimeter nauwkeurigheid is vereist voor de injecties, de injecteren goed is een vrij moeilijke taak. Even snel en efficiënter alternatief (tabel 1) is om te injecteren rechtstreeks in de vis nier parenchym. Tijdens de injectie schade de naald mechanisch renale haarvaten en bloedvaten (b.v., de grootste posterieure kardinaal ader) waarmee ingang van deeltjes in de bloedsomloop (figuur 2E). Tot slot, de centrale verdikking van de kofferbak nier van een volwassen zebrafish is groot genoeg (tot 2 mm) voor een handleiding injectie zonder microchirurgische apparatuur.
De juiste positionering van de naald van de injectie is essentieel voor een succesvolle handmatig beheer. U kunt de praktijk vinden de kofferbak nier in intact dieren door transilluminating vissen met behulp van een bodem licht, zoals weergegeven in figuur 2A en 2B. Het schema in figuur 2B toont het correct uitvoeren van de injectie. Indien de procedure niet beheren microdeeltjes in de bloedstroom, kan opnieuw injectie worden gemaakt op de dezelfde lekke band binnen een kort tijdsbestek met vrijwel geen invloed op de overlevingskansen van de personen.
Injectie in de kofferbak nier van volwassen zebrafish (ook met succes getest op volwassen guppy Poecilia reticulata) is een effectieve methode van microparticle levering in de bloedbaan van de vis met een toegestane dierlijke sterfte; het is echter niet perfect geschikt voor drug administration wegens verschillen in het geïnjecteerde volume. Een zwak punt van deze techniek is een aanzienlijke lekkage van de oplossing uit de nier in de buik wegens de snelle administratie. Niettemin, een relatieve hoeveelheid van de stof in de bloedbaan ingespoten kan worden ruwweg geschat met behulp van visualisatie in de haarvaten van de gill (tabel 2). Er is geen strikte beperking van het geïnjecteerde volume, maar het beheer van meer dan 1 µL van de schorsing lijkt te zijn ineffectief. De fijnste haarvaten van glas kunnen worden toegepast voor de microinjection; echter, omdat een groot aantal microcapsules neiging tot samenvoeging, raden we het gebruik van 31-29G (Ø 0,33-0,25 mm) stalen naalden om te voorkomen klompen in het lumen van de naald.
Het succes van microcapsule bezorging via nier injectie in de bloedbaan moet worden gecontroleerd met behulp van de snelle inspectie op de aanwezigheid van de fluorescerende deeltjes in de kieuwen. Kieuwen zijn gemakkelijk toegankelijk organen voor in vivo waarnemingen. De gill-filamenten zijn een netwerk van haarvaten bloed bedekt met een dunne laag van respiratoire epitheel, waardoor beeldvorming van de intravital van het bloed stromen in de kieuwen bijzonder handig (een soort van natuurlijke optische venster). Voor het uitvoeren van de observatie, kan de kraakbeen gill cover worden gesneden om de gloeidraden bloot te stellen. Deze procedure is veilig voor vis, die met blootgelegde kieuwen in goed belucht water zonder een afname van de levensverwachting leven kan. Bovendien kunnen de kieuwen van grote vissen worden onderzocht onder een Microscoop simpelweg door het indrukken van de operculum uit de manier19. In het geval van een succesvolle injectie verschijnen fluorescerende microdeeltjes onmiddellijk in de kieuwen (Figuur 3). Merk op dat geïmplanteerde microdeeltjes aanzienlijk worden opgelost in het circulerende bloed volume, en een beperkt aantal deeltjes bereiken de haarvaten gill, dus voldoende concentratie van deeltjes moet worden geselecteerd voor de detectie in de kieuwen van de vis na injectie in vis nier (tabel 2).
De voorgestelde procedure voor implantatie kan worden toegepast in een breed scala van studies waarbij verschillende soorten kleine vissen. Ondanks de techniek hebben ontwikkeld en geoptimaliseerd voor injectie van fluorescerende microdeeltjes in de bloedsomloop, het kan ook worden toegepast voor het implanteren van niet-gekleurde micro/nanodeeltjes en opgeloste stoffen; echter, in dit geval de doeltreffendheid van de injectie moet worden geverifieerd op een andere manier. De momenteel beschreven stappen zijn optimaal voor dergelijke doeleinden als fysiologische monitoring met behulp van verschillende optische micro - of nanosensors, visualisatie van therapieën, levering van vaccins of drugs op sommige optisch zichtbaar vervoerders, en de inplanting van genetisch gemodificeerde cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Auteurs erkennen sterk de hulp van Bogdan Osadchiy en Evgenii Protasov (Irkoetsk State University, Rusland) ter voorbereiding van het protocol van de video. Dit onderzoek werd gesteund door de Russische Science Foundation (#15-14-10008) en de Russische Stichting voor fundamenteel onderzoek (#15-29-01003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
