Summary
Dieser Artikel beschreibt die Grundsätze der eine schnelle, minimal-invasive Injektion von fluoreszierenden Mikropartikel in der Circulatory system von kleinen Fischen und in Vivo Visualisierung von Mikropartikeln Fisch im Blut.
Abstract
Die systemische Gabe von Mikro-Größe Partikel in einem lebenden Organismus kann zur Gefäßsystem Visualisierung, Drogen und Impfung, Implantation von transgenen Zellen und kleine optische Sensoren eingesetzt werden. Jedoch intravenöse Mikroinjektionen in kleine Tiere, die meist in biologischen und veterinärmedizinischen Laboratorien verwendet werden, sind sehr schwer und erfordert geschultes Personal. Hier zeigen wir eine robuste und effiziente Methode für die Einführung von Mikropartikeln in das Kreislaufsystem der Erwachsenen Zebrafisch (Danio Rerio) durch Injektion in die Fisch-Niere. Um die eingeführten Mikropartikel in das Gefäßsystem zu visualisieren, schlagen wir eine einfache intravitalen bildgebende Verfahren in Kiemen. Überwachung von Zebrafisch-Blut-pH in Vivo wurde erreicht mit einem injizierten mikroverkapselte Leuchtstofflampen Sonde, SNARF-1, eine der möglichen Anwendungen von der beschriebenen Technik demonstrieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung der Kapselung des pH-sensitiven Farbstoffs und zeigt die Grundsätze der schnelle Injektion und Visualisierung der erhaltenen Mikrokapseln für in Vivo Aufnahme das Fluoreszenzsignal. Die vorgeschlagene Methode der Injektion zeichnet sich durch eine niedrige Sterblichkeitsrate (0-20 %) und hohe Effizienz (70-90 % Erfolg), und es ist leicht, Institut, mit handelsüblichen Geräten. Alle beschriebene Verfahren können auf anderen kleinen Fischarten wie Guppys und Medaka durchgeführt werden.
Introduction
Die Verwaltung der Mikro-Größe Partikel in den tierischen Organismus ist eine wichtige Aufgabe in Bereichen wie Drogen und Impfstoff Lieferung1, Gefäßsystem Visualisierung2, transgenen Zelle Implantation3und winzigen optischen Sensor implantation 4 , 5. der Implantation für Microscale Partikel in das Gefäßsystem von kleinen Labortieren ist jedoch schwierig, vor allem für empfindliche Wasserorganismen. Für populäre Forschung Exemplare wie Zebrafisch, ist es ratsam, die diese Verfahren mit Videoprotokolle geklärt werden.
Intrakardialen und Kapillare Mikroinjektionen erfordert geschultes Personal und einzigartige Mikrochirurgie Einrichtungen für die Lieferung von Microobjects in Zebrafisch Blut. Zuvor wurde ein Retro-Orbital manuelle Injektion3 als eine einfache und effektive Methode für die Verwaltung ganzer Zellen vorgeschlagen. Aber nach unserer Erfahrung dauert wegen der kleinen Fläche des Auges Kapillaren Netzes, es viel Übung, um das gewünschte Ergebnis von dieser Technik zu erreichen.
Hier beschreiben wir eine Methode für die robuste und effiziente Mikropartikel Implantation in das Herz-Kreislauf-System durch manuelle Injektion direkt in das nierengewebe Erwachsenen Zebrafisch, die ist reich an Kapillaren und renaler Gefäße. Diese Technik basiert auf dem video-Protokoll für Stammzelltransplantation in der Zebrafisch Niere6, aber die traumatischen und zeitraubende mikrochirurgische Schritte wurden beseitigt. Die vorgeschlagene Methode zeichnet sich durch geringe Mortalität (0-20 %) und hohe Effizienz (70-90 % Erfolg), und es ist leicht, Institut, mit handelsüblichen Geräten.
Ein wichtiger Teil des vorgeschlagenen Protokolls ist die Visualisierung der implantierten Mikropartikel (wenn sie fluoreszierende oder eingefärbte) in den Kapillaren der Kieme, ermöglicht eine Überprüfung der Injektion Qualität, eine grobe relative Bewertung der Anzahl der injizierten Partikel und die Erkennung des spektralen Signals für physiologische Messungen direkt aus dem zirkulierenden Blut. Als ein Beispiel für die Einsatzmöglichkeiten von der beschriebenen Technik demonstrieren wir das Protokoll für in Vivo Messungen von Zebrafisch-Blut-pH mittels mikroverkapselte fluoreszierende Sonde, SNARF-1, ursprünglich vorgeschlagenen in Borvinskaya Et Al. 2017-5.
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Protocol
Alle experimentelle Verfahren wurden im Einklang mit der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche und die Tier Themen Forschung Ausschusses des Instituts für Biologie an Irkutsk Landesuniversität genehmigt worden.
1. Herstellung von Mikrokapseln
Hinweis: Mikrokapseln mit einem Fluoreszenzfarbstoff werden mit einer Schicht für Schicht Versammlung entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten7,8zubereitet. Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Um poröse CaCO3 Microcores umschließt den Fluoreszenzfarbstoff zu synthetisieren, mischen Sie 2 mL der SNARF-1-Dextran-Lösung (die meisten Polymer gebundener Fluoreszenzfarbstoff wie FITC-BSA kann verwendet werden) in einer Konzentration von etwa 2 mg/mL mit 0,6 mL jeweils 1 Mol/L-Lösungen von CaCl2 und Na2CO3 unter schnell rühren.
Hinweis: Achten Sie auf die unterschiedlichen Empfindlichkeiten von Fluoreszenzfarbstoffen, Immunofluoreszenz; Wenn eine lichtempfindliche fluoreszierende Sonde (wie SNARF-1) verwendet wird, müssen die Manipulation und Lagerung der Mikropartikel mit so wenig Licht wie möglich durchgeführt werden. - Nach ca. 5-10 s Agitation, übertragen die Aussetzung auf 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 15 s bei 10.000-12.000 g zu CaCO3 Microcores Pellets.
- Den überstand verwerfen, die Kerne mit ~ 2 mL entionisiertem Wasser waschen und Aufschwemmen der Pellets durch Schütteln.
- Wiederholen Sie die Zentrifugation Waschvorgang in insgesamt drei Mal. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands.
- Inkubieren Sie die Microcores für 1 min in ein Ultraschallbad, deren Aggregation zu reduzieren.
Achtung: Vergessen Sie nicht, Ohren mit Kopfhörern zu schützen. - Um die erste Polymerschicht auf die Vorlagen einzuzahlen, Aufschwemmen der Kerne in ~ 2 mL einer 4 mg/mL Lösung von Poly(allylamine hydrochloride) (PAK) in 1 Mol/L NaCl.
- Halten Sie die Microcores in der Lösung für ~ 5 min mit konstanter schütteln.
- Nach 15 s der Zentrifugation, verwerfen den Überstand mit dem ungebundenen PAH. Waschen Sie die überdachte Microcores mit entionisiertem Wasser mindestens 3 Mal durch mehrere Zentrifugation und Waschschritte. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands.
- Inkubieren Sie die Microcores für 1 min in ein Ultraschallbad, deren Aggregation zu reduzieren.
Hinweis: Wenn die angewandte Fluoreszenzfarbstoff kationischen ist, starten von Poly (Natrium-4-Styrenesulfonate) (PSS) in 1 Mol/L NaCl (siehe Schritt 1,7).
- Wiederholen Sie Schritt 1.6 mit ~ 2 mL einer 4 mg/mL Lösung von PSS (auch mit 1 Mol/L NaCl) die zweite Polymerschicht auf die Vorlagen zu hinterlegen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 sechs mal 12 Polymere Schichten zu hinterlegen.
Hinweis: Es empfiehlt sich nicht für eine lange Pause (~ 12 h oder mehr) in der Prozedur bis ~ 3-5 Schichten weil CaCO3 Microcores ohne Abdeckung kann tendenziell recrystallize hinterlegt worden. Beachten Sie, dass PSS Abdeckung eine höhere Ansammlung von den Microcores bewirkt und die lange Pause empfiehlt sich nur dann, wenn PAH oder Poly-L-Lysin mit Polyethylenglykol veredelt (PLL-g-PEG) ist die äußerste Schicht. - Inkubieren Sie die überdachte Microcores in 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL pro reaktionscup) für mindestens 2 h.
- Waschen Sie die Microcores mit Wasser über sequentielle Zentrifugation und Wiederfreisetzung Schritte. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands.
- Um hohle Mikrokapseln zu erhalten, Auflösen der CaCO3 Vorlagen durch Zugabe von 2 mL 0,1 Mol/L Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Säurelösung (eingestellt auf 7,1 pH mit NaOH) auf die überdachten Microcores.
- Nach ca. 5 min Inkubation, Zentrifugieren die Mikrokapseln für 45 s und entsorgen des Überstands mit EDTA.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.10-1.10.1 zweimal.
- Waschen Sie die Mikrokapseln mit 0,9 % NaCl dreimal durch mehrere Zentrifugation innerhalb 45 Schritte s gefolgt von Waschschritten. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt verwerfen des Überstands.
Hinweis: Die endgültige Mikrokapsel Injektionslösung muss gehalten werden steril (z. B. durch Hinzufügen von Ampicillin, 0,1 mg/mL), und die Medien sollen biokompatible mit dem Ziel, Untersuchung (isotonische Medien mit neutralem pH-Wert). - Schätzen Sie die Konzentration der vorbereiteten Mikrokapseln in einer Hemocytometer unter dem Fluoreszenzmikroskop. Nehmen Sie eine Reihe von Bildern der Mikrokapseln, Messen Sie den Durchmesser von über hundert Mikrokapseln mit ImageJ9 oder gleichwertige Software und untersuchen Sie die Größenverteilung mit ein Histogramm.
- Shop der erhaltenen gekapselt Sonde im Dunkeln.
Hinweis: nach mehrmaligem Waschen in steriler 0,9 % NaCl, die Mikrokapseln können Monate bei 4 ° c gelagert Vollständige Trocknung der Mikrokapseln während der Lagerung wird nicht empfohlen.
2. Vorbereitung des optischen Aufbau und Kalibrierung von mikroverkapselte SNARF-1
Hinweis: Grobe pH-Messung mit mikroverkapselte SNARF-1 kann mit Bildern in zwei Kanälen eines fluoreszierenden Mikroskop7erfolgen, aber in diesem Protokoll eine einkanalige fluoreszierende Mikroskop mit einem Glasfaser-Spektrometer verbunden angewendet wurde.
- Die erforderlichen Satz von Fluoreszenz-Filter an das fluoreszierende Mikroskop nach den Merkmalen der angewandten Fluoreszenzfarbstoff und schalten Sie der Leuchtstofflampe ein.
- Ziehen Sie den Hebel in die Okulare.
Achtung: Überschüssige Licht kann die Spektrometer-Matrix Schäden. So stellen Sie sicher, dass der Hebel in der "Okular" Modus ist, wenn das Spektrometer nicht verwendet wird. - Schließen Sie ein Ende des Lichtleiters das Spektrometer und das andere Ende an einen Kollimator. Verwendung von Adaptern, legen Sie den Kollimator in den Fokus der Kamera Röhre oder anderen verfügbaren Port des fluoreszierenden Mikroskops.
- Schalten Sie das Spektrometer. Führen Sie das Spektrometer-Steuerprogramm und bereiten Sie das Spektrometer für Messungen.
- Ziehen Sie den Hebel in die Okulare.
- Platzieren Sie für die Kalibrierung der Mikrokapsel-Charge ~ 5 µL der Mikrokapsel Suspension (~ 10 000 Mikrokapseln pro Mikroliter in entionisiertem Wasser) auf einen Objektträger zu und trocknen Sie den Tropfen an einem dunklen Ort (z.B. in einem Thermostat bei 35 ° C).
- Um die spektralen Eigenschaften der mikroverkapselte SNARF-1 zu kalibrieren, verwenden Sie eine Reihe von Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten im Bereich von ~ 6-9. Drop ~ 10 µL eines Puffers auf die getrockneten Mikrokapseln mit SNARF 1 Dextran und mit einem Deckglas abgedeckt.
- Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Suchen Sie die Mikrokapseln mit einem × 40 Ziel.
- Durch Drehen des Hebels Mikroskop an den Kamera-Anschluss. Registrieren Sie ihre Fluoreszenz mit dem Spektrometer. Drehen Sie den Verschluss wieder in die Okulare.
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die spektrale Signal weit jenseits der Hintergrund-Ebene ist, und sicherstellen Sie, dass die Mikrokapseln in das Sichtfeld nicht in einer Blase (durch die Umstellung auf eine geringere Vergrößerung bei Bedarf). Vermeiden Sie längere Beleuchtung der gleichen Mikrokapseln. SNARF-1 reagiert empfindlich auf Immunofluoreszenz. - Wiederholen Sie Schritt 2.2.3 für unterschiedliche Mikrokapseln 10 - 15 Mal.
- Berechnen Sie die Fluoreszenz-Peak-Verhältnisse (z. B. Verwendung von R oder Scilab) für alle registrierten Spektren und bestimmen Sie die Regressionsgerade zwischen dem Median Verhältnis (für jeden Puffer) und mittlerer pH-Wert mit Hilfe der folgenden Formel:
Hinweis: SNARF-1 hat ein Spektrum mit zwei Spitzen, die Emission des protonierten und deprotonierten Farbstoffs entspricht und das Verhältnis zwischen den Gipfeln reagiert auf den pH-Wert des Mediums. In dieser Studie wird das Verhältnis zwischen der Fluoreszenzintensität für 605 und 660 nm verwendet. Diese Wellenlängen sind je nach eingestellter Filter verwendet gewählt. a und b sind Koeffizienten durch nicht-lineare Regression (z. B. Verwendung von R) bestimmt werden. Werte 0,15 bis 1.1 sind, bzw. die minimalen und maximalen Werte der ich605/i660 beobachtet während der Kalibrierung. - Sammeln Sie etwa 10 µL Blut Fisch von ca. 5 Erwachsene Tiere. Statt Fisch in eine Petrischale mit 1 µL/mL Wasser-Suspension von Nelkenöl für Anästhesie und warten, bis das Tier dreht sich auf der Seite und nicht mehr reagiert, drückt der Flosse (in der Regel ~ 2-3 min). Übertragen Sie die Fische auf einen Objektträger. Die Schwanzflosse mit einer Lanzette abgeschnitten und ca. 2 µL Blut der Fische von der Rute Vene zu sammeln.
Hinweis: Um zu verhindern, Blutgerinnung, behandeln Sie den Schnitt mit Heparin (5000 U/mL) zu und verwenden Sie heparinisierten Glaskapillaren und Mikrozentrifugenröhrchen, um das Blut zu sammeln.- Drip ca. 10 µL Blut mit einer Pipette auf die Spitze der Mikroelektrode und bestimmen den pH-Wert mit einem pH-Meter.
- Tropfen Sie Blut auf eine Folie mit getrockneten Mikrokapseln und registrieren Sie das Verhältnis von der Fluoreszenzintensität wie für die Kalibrierung Puffer (Schritte 2.2-2.3) beschrieben.
- Anpassen der lineare Koeffizient der Eichkurve die Kurve die Messungen in der Fisch-Blut (für weitere Details siehe Borvinskaya Et Al. 20175) entsprechen.
3. Vorbereitung für die Injektion
- Lassen Sie die Stahl-Nadel von der Spitze des Insulin-Pen (oder Spritze) durch Entfernen des Kunststoffs mit einer scharfen Lanzette.
Hinweis: Eine dünne Nadel (Ø0.33 mm oder weniger) oder Glas-Kapillare (in der Regel Ø1 mm) für die Mikroinjektion10,11zubereitet werden. - Stechen Sie die Nadel auf halbem Weg in die Glas-Microcapillary; Verlöten Sie schnell und schonend mit einem Gasbrenner.
- Schließen Sie die Glas-Microcapillary an die Microinjector an und spülen Sie es mit sterilem Wasser dreimal. Stellen Sie sicher, dass die Nadel die Flüssigkeit durchströmt.
- Füllen Sie das System mit destilliertem Wasser.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es gibt keine Luftblasen im System.
4. Injektion
- Die vorbereitete Aussetzung der Mikrokapseln Aufschwemmen (in steriler 0,9 % NaCl oder ein anderes Medium die Injektionen verwendet, mit einer Konzentration von 0,5 bis 6 Millionen Mikrokapseln pro Mikroliter) mit Ultraschallbad für 1 min.
Hinweis: Da die Mikrokapseln Niederschlag tendenziell, während der folgenden Injektion, schütteln Sie das Fläschchen mit der Mikrokapseln mechanisch (mit einem Rotor) oder manuell alle paar Minuten sie aufschwemmen und verhindern deren Aggregation. - Legen Sie den Fisch in eine Petrischale mit Betäubung (0,1 mL/L von Nelkenöl in Wasser suspendiert) für ~ 2 – 3 min. warten, bis der Fisch stellt sich auf seiner Seite und reagiert auf eine leichte Prise die Flosse.
- Mit einem Löffel, übertragen Sie den Fisch aus der Narkose zu und legen Sie sie vorsichtig mit einem feuchten Schwamm in einer seitlichen Position mit dem Kopf nach links (für Rechtshänder) oder nach rechts (für Linkshänder).
- Kurz vor der Injektion saugen Sie 1-2 mm Luft in das Glas-Kapillare mit Microinjector verbunden. Laden Sie es anschließend mit ca. 2 µL der dispergierten Mikrokapseln.
Hinweis: Vor der Injektion muss die Mikrokapsel-Lösung auf die Temperatur eingestellt werden an dem die Fische gehalten werden. - Stabilisieren Sie sanft den Körper des Fisches auf den Schwamm mit der nichtdominanten Hand.
- Die Seitenlinie des Fisches zu finden. Geistig markieren Sie ein Segment, das erstreckt sich von der Kiemendeckel bis zum Ende der Bauchhöhle. Die Mitte dieses Segments zu finden. Legen Sie die Nadel 1 mm niedriger ventralen.
- Bewegen Sie mit einer Schaben Bewegung sanft die Fische Skalen beiseite und machen einen Reifenschaden. Stechen Sie die Nadel in den Körper in einem Winkel von 45° auf der Tischoberfläche.
- Schieben Sie die Nadel in Richtung der Wirbelsäule, bis es sorgfältig anliegt.
- Lassen Sie etwa 1 µL der Mikrokapseln Suspension in der Niere und langsam zurückziehen der Nadelöhrs.
Hinweis: Um die richtige Einstichstelle zu finden ist leichter, es sinnvoll zu üben, die Suche nach der Stamm Niere durch transilluminating die Fische mit einem unteren Licht, wie in Abbildung 2A und 2 bdargestellt.
- Spülen Sie den Fisch von Kopf zu Endstück mit einem Strom des Wassers, eine verschütteten Mikrokapseln an der Injektionsstelle zu entfernen.
5. in Vivo Visualisierung
- Verwenden Sie die Dissektion Schere die Kiemendeckel aus den Fischkopf entfernen und entblößen die Kiemen. Spülen Sie die Kiemen mit Wasser.
- Mit einem Löffel, übertragen Sie den Fisch auf einen Objektträger, und legen Sie es auf der Bühne des fluoreszierenden Mikroskops.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Kiemen der Fische während der nachfolgenden Verfahren nicht austrocknen. Um dies zu vermeiden, Befeuchten Sie sie regelmäßig mit Wasser und einer Pasteurpipette (etwa alle 1-2 min). - Verdunkeln den Raum und mit geringer Vergrößerung (x 10 Ziel) untersuchen die Kiemen, die fluoreszierenden Mikrokapseln zu finden.
Hinweis: Wenn das Verfahren für die Einführung von einigen fluoreszierenden Partikeln in Fisch-Kreislauf-System verwendet wird, empfiehlt es Kiemen mehrerer Personen für unerwartete fluoreszierenden Partikeln vor Injektionen zu inspizieren. Kiemen von Wildtyp Zebrafisch haben keine Autofluoreszenz, aber in einigen Fällen können sporadische fluoreszierende Partikeln (z. B. Lebensmittel Stücke oder einzelligen Symbionten) auf Kiemen vorhanden sein. Wenn nötig, solche Partikel können basierend auf ihre spezifische Form erkannt werden (z. B. Lebensmittel Stücke haben unregelmäßigen Form, im Gegensatz zu kugelförmig Mikrokapseln) oder Fluoreszenz-Spektrum (z.B. Farbe).- Wechseln Sie das Objektiv in eine höhere Größenordnung (× 40 Ziel) und positionieren Sie eine Mikrokapsel oder eine Gruppe von Mikrokapseln in der Mitte des Sichtfeldes.
- Durch Drehen des Hebels zum Hafen mit einem angeschlossenen Spektrometer. Die spektrale Signal aufzeichnen.
- Drehen Sie den Verschluss wieder in das Okular.
- Wiederholen Sie die Messungen für unterschiedliche Mikrokapseln mehrmals.
- Übertragen Sie die Fische in das Aquarium mit der richtigen Belüftung für die Wiederherstellung.
Hinweis: Mit minimalen Praxis ist es möglich zur Durchführung der Injektion und Signal Aufnahme mit einer ungefähren Geschwindigkeit von 2 bis 3 min pro Fisch. Für eine individuelle mehrmals mit dem Einsatz von wiederholten niedrig, harmlosen Dosen der Narkose oder eine andere Methode der Fixierung kann die Messung wiederholt werden. Verwenden Sie für Langzeit-Beobachtung ein System mit kontinuierlicher Narkose12.
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Representative Results
Die erzielten Ergebnisse stammen aus einer der drei Hauptkategorien des Protokolls präsentiert: die Bildung von fluoreszierenden Mikropartikel durch Verkapselung von einem Fluoreszenzfarbstoff (Abbildung 1), die Niere Injektion von Mikrokapseln mit weiteren Visualisierung in Gill Kapillaren (Abbildung 2 und 3) und schließlich die in Vivo spektrale Aufnahme SNARF-1 Fluoreszenz zu überwachen, Blut-pH Niveaus (Abbildung 4).
Die Schicht für Schicht Ansatz mit Beschichtung der Vorlage CaCO3 Kerne umschließt den Farbstoff durch mehrere Ebenen der entgegengesetzt aufgeladen Polymere (PAH und PSS) und eine äußerste Schicht aus einem biokompatiblen Polymer (PLL-g-PEG) ist eine einfache und kostengünstige Methode erlauben, verschiedene fluoreszierende Sonden wie SNARF 1 Dextran, FITC-BSA oder andere (Abbildung 1A) kapseln. Infolgedessen werden hohle Mikrokapseln von mikrometrische Größe mit stabilen semipermeable elastischen Schalen und geladen mit dem Fluoreszenzfarbstoff (Abbildung 1 b) gewonnen. Die Mikrokapseln hergestellt durch diese Technik sind in der Regel nicht-Uniform, mit einer Normalverteilung der Partikelgröße und charakteristische mittlere Größe in jeder Charge (Abbildung 1С).
Abbildung 1 : Schicht für Schicht Synthese und Charakterisierung von hohlen Polyelektrolyten Mikrokapseln mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen. (A) Schema einer Mikrokapseln Versammlung (gezeichnet von einem ähnlichen Schema in Gurkov Et Al. 20164veröffentlicht). (B) Bild von hohlen Mikrokapseln beladen mit Fluoreszenzfarbstoff FITC-BSA. (C) Größe Charakterisierung der Charge von Mikrokapseln aus Abbildung 1 b. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Robuste und effiziente Mikropartikel Implantation in das Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen kann durch manuelle Injektion direkt in die Fisch-Niere durchgeführt werden. Die Punktion am richtigen Standort des Körpers Fisch (Stamm Niere) ist entscheidend für die schnelle Lieferung von Mikropartikeln durch manuelle Injektion. Die Fisch-Niere ist eine blutbildende Organ und enthält pigmentierte Melanophoren, und so ist es gut gefärbt. Da es zwischen transparenten Kammern von der Schwimmblase eingebettet ist, ist es einfach, die Orgel im intakten Tier mit schwacher Pigmentierung oder durch Durchleuchtung von kleinen Fischen, die mit einer unteren Lichtquelle, wie in Abbildung 2A und 2 bzu identifizieren.
Abbildung 2 : Lokalisierung der richtige Ort für Niere Injektion. (A) Trans-Beleuchtung der Zebrafisch zeigt die Lokalisierung der Stamm Niere (Pfeil). (B) Schema veranschaulicht die richtige Einstichstelle zu identifizieren. Die weiße gepunktete Linie zeigt die Seitenlinie des Segments Bauch des Fisches. Der Pfeil zeigt die Website für Punktion und die richtige Richtung der Einspritzung in Richtung der Wirbelsäule. Die Schwimmblase ist durch die grüne Linie gekennzeichnet. (C) Visualisierung der Zebrafisch Niere nach der Beseitigung der Organe und der Körperwand. Ein Pfeil zeigt auf die zentralen Bulge der Stamm Niere. (D) ein sagittaler histologischer Abschnitt D. Rerio zeigt die allgemeine Anatomie der inneren Organe der Erwachsenen Fische (H & E Fleck). (E) Schliffbild einer Fisch-Niere (punktiert) von (D) mit einem Pfeil in das Lumen der posterioren Kardinal Ader skaliert. Sternchen geben die Schwimmblase. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Um den Erfolg der die Injektion zu überprüfen, sollte eine schnelle Sichtkontrolle der Kiemen bei kleiner Vergrößerung (X10-20-Ziel) erfolgen nach dem Schneiden der Fisch Kiemendeckel (Abb. 3A). Obwohl die meisten der Mikrokapseln bleibt an der Injektionsstelle oder verschütten in die Körperhöhle (Abb. 3 b) Wenn die Injektion richtig durchgeführt wird, es ist möglich, frei schwebend in den Kapillaren der Gill von fluoreszierenden Mikrokapseln beobachten die abgeholzte Fische Kiemen unmittelbar nach der Injektion (Abbildung 3). Wenn keine fluoreszierenden Partikeln in den Kiemen erkannt werden, ist es möglich, die Injektion in die gleiche Einstichstelle zu wiederholen. Erfolgreiche Zustellung in den Blutstrom erhalten Sie in ca. 70-90 % der gesamten injizierten Fische.
Abbildung 3 : Niere Injektion von Mikrokapseln mit weiteren Visualisierung in Gill Kapillaren. (A) die allgemeine Systematik der Mikrokapsel-Lieferung in die Blutbahn Zebrafisch. (B) fluoreszierende Bild der Zebrafisch nach der Injektion der Mikrokapseln mit grünen FITC-BSA-Farbstoff (der Punktionsstelle ist durch einen Pfeil gekennzeichnet). (C) dieses Bild von den Kiemen der Fische, skaliert von (B), zeigt die erfolgreiche Durchführung der Mikrokapseln durch Nieren-Injektion (Kiemen der Wildtyp Zebrafisch haben keine Autofluoreszenz). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Während der Injektion direkt in die Fisch-Stamm-Niere bildet umfangreiche Blutergüsse normalerweise unterhalb der Punktionsstelle, Schäden an den Kapillaren Parenchym oder renaler Gefäße angibt. Gibt es kein Blut Austritt aus dem Körper, weil die Punktion erscheint, sich schnell zusammenzuziehen. Trotz inneren Blutungen, können Einzelpersonen noch mit ca. 80-90 % Überleben durch das Verfahren (Tabelle 1) wiederherstellen. Es ist auch bekannt, dass Fischarten Nephrone de Novo nach Verletzungen13,14regenerieren können. Wenn mehr als 20 % der Fische sterben, muss sichergestellt werden, dass die Anesthetization korrekt durchgeführt wird.
| Gekapselte Fluoreszenzfarbstoff | n | Konzentration, Mikrokapseln pro Mikroliter | Injektionsvolumen, µL | Durchmesser von Mikrokapseln, µm | Erfolgreiche Zustellung in die Blutbahn Fisch % | Mortalität nach Injektion, % | |
| 1 h | 1 Tag | ||||||
| Injektion in die Stamm-Niere | |||||||
| FITC-BSA | 36 | 4 x 106 | 1.6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| SNARF 1 dextran | 29 | 3-6 x 105 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| RITC-dextran | 20 | 6 x 106 | 2 | 2.0 | 70 | 0 | 0 |
| 0,9 % NaCl | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| Retro-Orbital-Injektion | |||||||
| FITC-BSA | 9 | 1 x 105 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| RITC-dextran | 11 | 6 x 106 | 1 | 2.0 | 9 | 18 | 0 |
Tabelle 1. Sicherheit und Effizienz der Lieferung von Mikrokapseln in die Blutbahn Zebrafisch. Der Erfolg des Verfahrens ist durch die Anwesenheit von fluoreszierenden Materialien in den Kapillaren der Fisch Gill bestimmt.
Wenn die Konzentration der injizierten Mikropartikel ausreicht, möglicherweise zu wenig Partikel zur Verfügung rasch in Fischkiemen visualisiert werden. Zur gleichen Zeit kann eine Suspension mit einer zu hohen Konzentration die Nadel verstopfen. Im Falle einer Schicht für Schicht montierten Mikrokapseln mit mittlere Durchmesser ~ 2 bis 5 µm ist eine Konzentration von etwa 4 * 105-6 * 106 Mikrokapseln pro Mikroliter optimal für mühelose Erkennung in Kiemen nach Injektion in Fisch Niere (Tabelle 2).
| Konzentration, Mikrokapseln pro Mikroliter | Anzahl der Mikrokapseln in ein Mikroskop Sichtfeld (× 20 Ziel) in den Kiemen der verschiedenen Individuen (n = 7 % Konzentration) | ||||||
| 4 x 106 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 x 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 x 104 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 x 103 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabelle 2: Aufzeichnungen über die visuelle Zählung der FITC-BSA-haltigen Mikrokapseln in D. Rerio Kiemen nach Injektion (1,6 µL() in der Stamm-Niere.
Die vorgeschlagene Methode der Mikropartikel Implantation in Fisch-Herz-Kreislauf-System kann für die Überwachung von Zebrafisch-Blut-pH in Vivo durch mikroverkapselte fluoreszierende Sonde, SNARF-1 (Abbildung 4) angewendet werden. SNARF-1 hat ein Spektrum mit zwei Spitzen, die Emission von der protonierten und deprotonierten Farbstoff (Abbildung 4A) entsprechen, damit die Kalibrierung, die Kurven des Verhältnisses zwischen den Gipfeln bei unterschiedlichen pH-Wert des Mediums werden können geplottet (Abbildung 4 b). Die Bestandteile des Blutes beeinflussen das Auslesen des gekapselten SNARF-1 (Abbildung 4 b), welche experimentell durch gleichzeitige Messung des Blut-pH von Mikrokapseln und ein pH-Meter mit einer Glas-Mikroelektrode ausgewertet werden können. Eine vermeintliche Eichkurve für Mikrokapseln im Zebrafisch Blut sollte geplottet werden, durch die Verlagerung der Puffer-Kurve mit dem Koeffizienten der pH-Wert Differenz experimentell gemessen (siehe Borvinskaya Et Al. 20175 für Details).
Blut-pH im Zebrafisch Gill Kapillaren bleibt stabil, während mindestens ein paar Stunden nach der Injektion von Mikrokapseln (Abbildung 4). Zum gleichen Zeitpunkt führt hyperkapnischen Kurzzeitbelichtung zu einer statistisch signifikanten Abnahme der Blut-pH, die Anwendbarkeit der Methode zur in Vivo Forschung auf kleine Fische zeigt.
Abbildung 4 : Repräsentatives Beispiel für die Überwachung der Zebrafisch Blut РН durch Eintragung der Fluoreszenz-Spektren von mikroverkapselte Farbstoff SNARF-1. (A) Spektren der vorbereiteten Mikrokapseln beladen mit SNARF-1 in Natrium-Phosphat-Puffer bei verschiedenen pH-Werten. (B) Kalibrierkurven der vorbereiteten pH-Sensitive Mikrokapseln in Natrium-Phosphat-Puffer und extrahierten Zebrafisch Blut. Bei allen Messungen wird der Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. (C) ein repräsentatives Beispiel für die in Vivo Kontrolle der Zebrafisch Blut рН durch gekapselte Fluoreszenzfarbstoff SNARF-1 im Zebrafisch Gill Kapillaren. In Kontrolle Bedingungen stabil Blut-pH während 4 Stunden nach der Injektion von Mikrokapseln, während 5 Minuten Exposition unter schweren Hyperkapnie (900-1000 mg/L gelösten CO2) Übersäuerung des Blutes Fisch verursacht. Sternchen gibt statistisch signifikanten Unterschied von der parallelen Kontrollgruppe mit p < 0,01 (Mann-Whitney U-Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Um die Injektion von Mikropartikeln in der Zebrafisch-Niere zu demonstrieren, haben wir semipermeable Mikrokapseln mit einem indikatorfarbstoff geladen. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Herstellung der Mikrokapseln mit der Schicht für Schicht Versammlung von entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten7,8,15,16,17 ,18 (Abb. 1A). Ein Vorteil dieser Technologie ist, dass es einfach durchzuführen mit Laborgeräten zur Verfügung. Je nach Bedingungen und Verbindungen verwendet werden reichen die fabrizierten Mikrokapseln von 0,5 bis 100 µm mit Polyelektrolyten Nanometer dicken Schale15. Die Synthese-Parameter erläutert in diesem Manuskript Ergebnis in elastischen Mikrokapseln, bestehend aus 12 Schichten (neben biokompatiblen Endschicht) von Polymeren ca. 2 – 6 µm groß (Abbildung 1 b und 1 C). Der wichtigste Schritt, die Bestimmung der Größe der Mikrokapseln ist die Bildung von der Vorlage Microcores. Dieser Prozess beinhaltet die spontane Bildung von Calciumcarbonat-Kristallen, und daher die erhaltenen Teilchen sind nicht gleichmäßig. Daher sollte eine Charakterisierung der Mikrokapsel Größenverteilung für jede Charge durchgeführt werden.
Die wichtige Etappe dieses Protokolls ist die Optimierung der Auslieferung von Mikropartikeln in der Zebrafisch-Kreislauf-System ohne den Einsatz von Techniken der Mikromanipulation. Die Verwaltung ganzer Zellen durch Retro-Orbital Injektion wurde zuvor im Detail3beschrieben. Allerdings ist es nach unserer Erfahrung nicht einfach für unerfahrene Anwender zu gewinnen die Injektion-Effizienz durch die Autoren beschrieben, da die Retro-Orbital-Sinus ist sehr klein und befindet sich in der Nähe der Pharynx und Kiemenbögen, die leicht mit einer Nadel versehentlich verletzen. Seit weniger als einem Millimeter Genauigkeit ist erforderlich für die Injektionen, die Injektion richtig ist eine ziemlich schwierige Aufgabe. Eine ebenso schnelle und effizientere Alternative (Tabelle 1) ist direkt in das nierenparenchym Fisch zu injizieren. Während der Injektion schädigt die Nadel mechanisch renal Kapillaren und Blutgefäße (z. B. die größte posterior Kardinal Vene), wodurch Eingang von Mikropartikeln in das Herz-Kreislauf-System (Abbildung 2E). Zu guter Letzt die zentralen Bulge der Stamm Niere im Erwachsenen Zebrafisch ist groß genug (bis zu 2 mm) für eine manuelle Injektion ohne mikrochirurgische Ausrüstung.
Die korrekte Platzierung der Injektionsnadel ist entscheidend für eine erfolgreiche manuelle Verwaltung. Sie können üben, finden die Stamm-Niere in intakten Tieren durch transilluminating Fische eine Leuchtbox mit, wie in Abbildung 2A und 2 bgezeigt. Das Schema in Abbildung 2 b zeigt, wie richtig die Injektion durchzuführen. Wenn die Prozedur fehlschlägt, Mikropartikel in die Blutbahn zu verwalten, kann re-Injektion an der gleichen Punktion innerhalb eines kurzen Zeitrahmens mit praktisch keinen Einfluss auf die Überlebensrate der Personen vorgenommen werden.
Injektion in die Stamm-Niere des Erwachsenen Zebrafisch (auch erfolgreich getestet auf Erwachsene Guppy Poecilia Reticulata) ist eine wirksame Methode der Mikropartikel-Lieferung in die Blutbahn Fisch mit einer zulässigen Tier Sterblichkeit; Es ist jedoch nicht perfekt geeignet für Medikamentengabe aufgrund von Schwankungen des injizierten Volumens. Ein Schwachpunkt dieser Technik ist wegen der schnellen Verwaltung einen nennenswerten Leckagen der Lösung aus der Niere in die Bauchhöhle. Dennoch kann eine relative Menge der Substanz in die Blutbahn injiziert mit Visualisierung in den Kapillaren der Gill (Tabelle 2) grob geschätzt werden. Gibt es keine strikte Begrenzung der das Injektionsvolumen, aber die Verwaltung von mehr als 1 µL der Aufhängung scheint unwirksam sein. Die besten Glaskapillaren können für die Mikroinjektion angewendet werden; jedoch, weil eine große Anzahl von Mikrokapseln Aggregation zu schüren tendenziell, wir empfehlen die Verwendung von 31-29G (Ø 0,33-0,25 mm) Stahl Nadeln, Holzschuhe in das Lumen der Nadel zu vermeiden.
Der Erfolg der Mikrokapsel Lieferung durch Nieren-Injektion in die Blutbahn sollte die schnelle Prüfung auf das Vorhandensein von fluoreszierenden Partikeln in den Kiemen mit überwacht werden. Kiemen sind leicht zugänglich für in Vivo Beobachtungen. Die Gill Filamente sind ein Netzwerk von Kapillaren bedeckt von einer dünnen Schicht des respiratorischen Epithels, wodurch intravitalen Bildgebung des Blutes fließen in den Kiemen besonders praktisch ist (eine Art natürlichen optischen Fenster). Um die Beobachtung durchzuführen, kann der Knorpel Kiemendeckel geschnitten werden, um die Filamente verfügbar zu machen. Dieses Verfahren ist sicher für die Fische, die mit unspektakulärem Kiemen in gut durchlüfteten Wasser ohne einen Rückgang der Lebenserwartung leben können. Darüber hinaus können die Kiemen von großen Fischen unter dem Mikroskop untersucht werden, durch einfaches Drücken der Kiemendeckel aus dem Weg19. Im Falle einer erfolgreichen Injektion erscheinen fluoreszierende Mikropartikel sofort in den Kiemen (Abbildung 3). Beachten Sie, dass die implantierten Mikropartikel sind erheblich in das zirkulierende Blutvolumen aufgelöst und eine reduzierte Anzahl von Teilchen erreichen die Kieme Kapillaren, damit ausreichender Konzentration von Mikropartikeln zur Erkennung in Kiemen nach gewählt werden Injektion in Fisch Niere (Tabelle 2).
Das vorgeschlagene Verfahren für die Implantation kann in einer Vielzahl von Studien mit verschiedenen Arten von kleinen Fischen angewendet werden. Trotz der Technik entwickelt und optimiert für die Injektion von fluoreszierenden Mikropartikel in Herz-Kreislauf-System es kann auch angewendet werden, für die Implantation nicht eingefärbten Mikro/Nanopartikel oder gelöste Substanzen; Allerdings sollte in diesem Fall die Wirksamkeit der Injektion in irgendeiner anderen Weise überprüft werden. Die gerade beschriebenen Schritte sind für solche Zwecke optimal als Physiologisches monitoring mit verschiedenen optischen Mikro- oder Nanosensoren, Visualisierung des Gefäßsystems, Impfstoffe oder Medikamente auf einige optisch sichtbaren Trägern und Implantation genetisch veränderten Zellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Autoren erkennen stark Hilfe von Bogdan Osadchiy und Evgenii Protasov (staatliche Universität Irkutsk, Russland) in Vorbereitung des video-Protokolls. Diese Forschung wurde von der russischen Science Foundation (#15-14-10008) und der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (#15-29-01003) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
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