Summary
Bu makalede, floresan microparticles hızlı, minimal invaziv enjeksiyon circulatory system küçük balıklar ve balık kan microparticles in vivo görselleştirme içine prensipleri gösterilir.
Abstract
Canlı bir organizma içine mikro büyüklükteki parçacıkların yönetim sistemik damarlara görselleştirme, ilaç ve aşı teslim, transgenik hücreleri ve küçük optik sensörler implantasyonu için uygulanabilir. Ancak, biyolojik ve veteriner laboratuvarları çoğunlukla kullanılan, küçük hayvanların içine intravenöz microinjections çok zor ve eğitimli personel gerektirir. Burada, biz balık böbrek içine enjeksiyon tarafından microparticles giriş yetişkin zebra balığı (Danio rerio) dolaşım sistemi içine için sağlam ve verimli bir yöntem göstermek. Damarlara tanıtılan microparticles görselleştirmek için balık solungaçları basit bir intravital görüntüleme tekniği öneriyorum. Vivo zebra balığı kan pH kontrolü başarılı bir enjekte microencapsulated floresan kullanarak sonda, SNARF-1, açıklanan tekniği mümkün uygulamalarından birini göstermek için. Bu makalede pH duyarlı boya encapsulation ayrıntılı bir açıklamasını ve hızlı enjeksiyon prensipleri ve görselleştirme floresan sinyali VIVO içinde kayıt için elde edilen microcapsules gösterir. Enjeksiyon önerilen yöntemi düşük mortalite oranı ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır. Tüm açıklanan yordamları süs balıkları ve medaka gibi diğer küçük balık türleri üzerinde gerçekleştirilebilir.
Introduction
Mikro büyüklükteki parçacıklar yönetim hayvan bir organizma içine ilaç ve aşı teslim1, damarlara görselleştirme2, transgenik hücre implantasyonu3ve küçük optik sensör implantasyon gibi alanlarda önemli bir görevdir 4 , 5. ancak, implantasyon yordam microscale parçacıklar halinde küçük Laboratuvar hayvanlarının damar sistemi için özellikle hassas Sucul organizmalar için zordur. Zebra balığı gibi popüler araştırma numuneler için bu tavsiye edilir bu yordamları açıklık video protokollerini kullanarak.
İntrakardiyak ve kapiller microinjections'microobjects dır zebra balığı kana eğitimli personel ve benzersiz mikrocerrahi özellikleri gerektirir. Daha önce bir retro-orbital el ile enjeksiyon3 tüm hücreleri yönetim için kolay ve etkili bir yöntem olarak önerilmiştir. Ancak, deneyim, göz kılcal ağ küçük alanı nedeniyle bu teknik üzerinden istenilen sonucu elde etmek için çok pratik alır.
Burada, biz güçlü ve verimli microparticle implantasyon dolaşım sistemi içine için bir yöntem yetişkin zebra balığı, böbrek dokusunun içine doğrudan el ile enjeksiyonla kılcal damar ve böbrek damarlarının açısından zengin olduğu açıklanmaktadır. Bu teknik zebra balığı böbrek6içine hücre transplantasyonu için video protokolünü dayanır ama travmatik ve zaman alıcı mikrocerrahi adımları elendi. Önerilen yöntem tarafından düşük mortalite ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır.
Hangi enjeksiyon kalite, sayısı bir kaba göreli değerlendirme doğrulanmasına izin verir (floresan veya renkli olmaları durumunda) implant microparticles gill kılcal damarlar içinde görselleştirme önerilen protokol önemli bir parçası olduğunu enjekte parçacıklar ve dolaşımdaki kandan doğrudan fizyolojik ölçümler için spektral sinyal algılama. Açıklanan tekniği olası uygulamaları bir örnek olarak, biz SNARF-1, ilk olarak önerilen Borvinskaya bir microencapsulated floresan sonda kullanarak zebra balığı kan pH vivo ölçümleri için protokol göstermek ve ark. 20175.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel yordamlar AB Direktifi 2010/63/AB hayvan deneyleri için uygun olarak yapılmıştır ve hayvan konularda araştırma komitesi, Enstitüsü biyoloji Irkutsk State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Microcapsules imalatı
Not: bir floresan boya taşıyan Microcapsules ters şarj edilmiş polyelectrolytes7,8katman katman Meclisi kullanarak hazırlanır. Tüm yordamları oda sıcaklığında yapıldı.
- Gözenekli CaCO3 microcores floresan boya kapsayan sentezlemek için 2 mL (çoğu polimer bağlı floresan boya FITC-BSA gibi kullanılabilir) SNARF-1-dextran çözeltisi ~ 2 mg/mL konsantrasyonu 0.6 mL ile her biri 1 mol/L çözümleri CaCl2, mix ve Na2CO3 hızlı karıştırma altında.
Not: floresan boyalar farklı hassasiyetleri photobleaching için dikkat; bir ışığa duyarlı floresan sonda (gibi SNARF-1) kullandıysanız, işleme ve depolama microparticles ile mümkün olduğunca az ışık olarak gerçekleştirilmelidir. - Sonra 5-10 s ajitasyon, süspansiyon 2 mL microcentrifuge tüpler ve santrifüj 15 transfer 10.000-12.000 CaCO3 microcores cips için g, s.
- Süpernatant atmak, çekirdek ~ 2 mL deiyonize su ile yıkayın ve Pelet sallayarak resuspend.
- Toplamda üç kez Santrifüjü yıkama yordamı yineleyin. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.
- Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya.
Dikkat: kulak kulaklık ile korumak unutmayın. - İlk polimer katman şablonlar yatırmak için ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik poly(allylamine hydrochloride) (PAH) 1 mol/L NaCl içinde çekirdek resuspend.
- Microcores ~ 5 dakika sürekli sallayarak ile çözüm unutmayın.
- 15 sonra Santrifüjü, s süpernatant ilişkisiz PAH ile atmak. Kapalı microcores en az 3 kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü ve adımları yıkama deiyonize su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.
- Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya.
Not: Uygulamalı floresan boya katyonik ise, poli (sodyum 4-styrenesulfonate) başlatma (PSS) ın 1 mol/L NaCl (bkz. Adım 1.7).
- 1.6 ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik (Ayrıca 1 mol/L NaCl içeren) PSS ile ikinci polimer tabaka şablonlar yatırmak için adımları yineleyin.
- 12 polimer kat yatırmak için 1,6 ve 1.7 altı kez adımları yineleyin.
Not: Bu uzun bir aradan (~ 12 saat veya daha fazla) almak için tavsiye edilmez çünkü CaCO3 microcores kapsama olmadan Li2 eğilimi ~ 3-5 kadar yordamdaki katmanları yatırılan. Not PSS kapsama microcores daha yüksek bir toplama neden olur ve uzun sessizlik (PLL-g-PEG) sadece PAH veya poli-L-lizin Polietilen glikol ile aşılı dıştaki katman olduğunda önerilir. - Kapalı microcores 2 mg/ml PLL-g-PEG (~ 1 mL microtube başına) en az 2 h için kuluçkaya.
- Microcores sıralı Santrifüjü ve resuspension adımları üzerinden su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.
- İçi boş microcapsules elde etmek için CaCO3 şablonlar 2 mL (pH 7.1 NaOH ile düzeltilmiş) 0,1 mol/L ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltisi ekleyerek kapalı microcores geçiyoruz.
- Microcapsules 45 s ve atma, kuluçka ~ 5 dk sonra santrifüj kapasitesi süpernatant EDTA ile.
- 1.10-1.10.1 adımları iki kez tekrarlayın.
- Microcapsules % 0,9 NaCl üç kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü adımlar içinde 45 ile yıkayın s takip adımlar yıkayarak. Son Santrifüjü adımdan sonra süpernatant atmak.
Not: Son microcapsule çözüm enjeksiyon için (örneğin ampisilin, 0.1 mg/mL ekleyerek) steril tutulmalıdır ve medya araştırma (izotonik ortam nötr pH ile) ile biyouyumlu olmalıdır. - Bir hemasitometre bir floresan mikroskop altında hazırlanan microcapsules konsantrasyonu tahmin ediyoruz. Microcapsules resimleri bir dizi, çapı yüz microcapsules ImageJ9 veya eşdeğer yazılım kullanma hakkında ölçmek ve bir çubuk grafik kullanarak boyutu dağıtım araştırmak.
- Mağaza elde edilen karanlıkta prob kapsüllenir.
Not: sonra birkaç yıkama steril % 0,9 NaCl, microcapsules ay 4 ° C'de depolanan Tam microcapsules depolama sırasında kurutma tavsiye edilmez.
2. Optik Kurulum ve kalibrasyon mikroenkapsüle SNARF-1'in hazırlanması
Not: Kaba pH ölçümleri mikroenkapsüle SNARF-1 ile floresan mikroskop7iki kanallarında görüntüleri kullanılarak yapılabilir, ancak tek kanallı floresan mikroskop fiber spektrometre için bağlı bu protokolü uygulandı.
- Floresan filtre uygulanan floresan boya özelliklerine göre floresan mikroskop için gerekli kümesi yerleştirin ve floresan lamba açmak.
- Kolu göz mercekleri için çekin.
Uyarı: Aşırı ışık Spektrometre matris zarar verebilir. Böylece, spektrometre kullanılmadığında kolu "mercek" modunda olduğundan emin olun. - Fiber optik bir ucunu Spektrometre ve bir kolimatör diğer ucunu bağlayın. Bağdaştırıcıları kullanarak, Kolimatör kamera tüpü odak veya floresan mikroskop diğer kullanılabilir bağlantı noktası ekleyin.
- Spektrometre üzerinde açın. Spektrometre denetim programını çalıştırıp Spektrometre ölçümleri için hazırlamak.
- Kolu göz mercekleri için çekin.
- Microcapsule toplu kalibrasyonunun ~ 5 µL microcapsule süspansiyon (~ 10 000 microcapsules µL deiyonize su başına), mikroskop slaytta yer ve karanlık bir yere (örneğin, bir termostat 35 ° c) içinde belgili tanımlık damla kuru.
- Microencapsulated SNARF-1 spektral özellikleri ayarlamak için bir dizi arabellekleri ~ 6-9 aralığındaki farklı pH değerleri kullanın. ~ 10 µL SNARF-1-dextran ile kurutulmuş microcapsules üzerine bir arabellek bırak ve bir coverslip ile kaplayın.
- Cam slayt mikroskop sahnesinde yerini. × 40 amacı istimal microcapsules bulun.
- Mikroskop kolu kamera bağlantı noktasına çevirin. Onların Floresans Spektrometre ile kayıt. Göz mercekleri başa kolu çevirin.
Not: spektral sinyal çok arka plan düzeyinin sağlayın ve görüş alanı içinde microcapsules bir balonun içinde (daha düşük bir boyuta gerekirse geçiş yaparak) olmadığından emin olun. Aynı microcapsules uzun süreli aydınlatma kaçının. SNARF-1 için photobleaching duyarlıdır. - 2.2.3 farklı microcapsules için 10 - 15 kez yineleyin.
- Floresan en yüksek oranları (örneğin, R veya Scilab kullanarak) hesaplamak için tüm kayıtlı spectra ve medyan oranı (için her arabellek) ve aşağıdaki formülü kullanarak orta pH arasındaki regresyon çizgisini belirler:
Not: SNARF-1 ile iki doruklarına protonated ve deprotonated boya emisyon için karşılık gelen bir spektrum vardır ve tepeler arasındaki oran orta pH cevap veriyor. Bu çalışmada, 605 ve 660 nm floresan yoğunluğu arasındaki oranı kullanılır. Bu dalga boyu kullanılan filtre kümesini bağlı olarak seçilir. a ve b (örneğin, R kullanarak) doğrusal olmayan regresyon belirlenecek katsayıları vardır. 0,15 ve 1.1 değerlerdir, sırasıyla, minimum ve maksimum değerlerini ben605/i660 kalibrasyon sırasında gözlenen. - Balık kan yaklaşık 10 µL yaklaşık 5 Yetişkin hayvanlardan toplamak. Yer balık Petri kabına 1 µL/mL ile içine su karanfil yağı anestezi için süspansiyon ve hayvan yan döner ve fin pinch için yanıt vermiyor kadar bekleyin (genellikle ~ 2-3 dk). Balık bir cam slayt üzerinde aktarın. Balık kuyruğu lanset ile kesti ve kuyruk damar yaklaşık 2 µL balık kan toplamak.
Not: kan pıhtılaşma önlemek için heparin (5000 U/mL) ile belgili tanımlık kesme tedavi ve heparinized cam kılcal damarlar ve microcentrifuge tüpler kan toplamak için kullanın.- Yaklaşık 10 µL kan elektrot ucunu üzerine bir pipet ile damla ve pH pH-metre kullanarak belirleyebilirsiniz.
- Kan kurutulmuş microcapsules ile bir slayt üzerine bırakın ve kalibrasyon arabelleklerini (adım 2.2 2.3) açıklandığı gibi floresan yoğunluğu oranı kayıt.
- Eğri (için daha fazla ayrıntı bkz: Borvinskaya ve ark. 20175) balık kanı ölçümlerde maç yapmak için kalibrasyon eğrisi doğrusal katsayısı ayarlayın.
3. hazırlık enjeksiyon için
- Çelik iğne ucu keskin lanset ile plastik kaldırarak insülin kalem (veya şırınga) yayın.
Not: Herhangi bir ince iğne (Ø0.33 mm veya daha az) veya cam kılcal (genellikle Ø1 mm) mikroenjeksiyon10,11için hazırlıklı ol. - İğneyi yarıya kadar cam microcapillary yerleştirin; hızlı ve yavaş bir gaz meşale kullanarak lehim.
- Cam microcapillary için microinjector bağlamak ve üç kez steril su ile yıkayın. Sıvı iğne akar emin olun.
- Sistem distile su ile doldurun.
Not: sistemde hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.
4. enjeksiyon
- Microcapsules hazırlanan süspansiyon resuspend (steril % 0.9 NaCl veya diğer medya kullanılan 0.5 ila 6 milyon microcapsules microliter başına bir konsantrasyon ile enjeksiyonlar için) için 1 dk ultrasonik banyo kullanarak.
Not: microcapsules, aşağıdaki enjeksiyon sırasında çökelti eğilimindedir bu yana şişeyi microcapsules ile mekanik sallamak (bir rotor kullanarak) veya el ile her birkaç dakikada onları resuspend ve onların toplama önlemek için. - ~ 2-3 için bir petri anestezi (0.1 mL/L karanfil yağı suya askıya) ile içine balık yer dk. kadar bekleyin balık yan döner ve fin hafif bir tutam yanıt vermiyor.
- Bir kaşık kullanarak, anestezi çıkmış balık aktarmak ve yavaşça (sağ elini kullanan kişi için) sola doğru veya (sol elli kişi için) sağa doğru kafa ile yanal bir konumda nemli bir sünger üzerine yerleştirin.
- Sadece enjeksiyon önce 1-2 mm cam kılcal damar içine hava microinjector ile bağlı emmek. O zaman, dağınık microcapsules yaklaşık 2 µL ile yük.
Not: enjeksiyon önce microcapsule çözüm hangi balık tutulur sıcaklık ayarlanması gerekir. - Yavaşça sigara dominant el ile sünger balık gövdesini stabilize etmek.
- Sonradan içini kaplamak balık bulmak. Zihinsel genişleten bir kesimi operculum karın boşluğu sonuna kadar seçer. Bu segmentteki ortasını bulmak. İğne 1 mm daha düşük ventral yönde koymak.
- Kazıma bir hareketi, yavaşça balık bir kenara ölçekler ve bir delik yapmak hareket. Tablo yüzeye 45 ° açılı ve vücuda iğne yerleştirin.
- Dikkatli bir şekilde buna karşı aittir kadar iğne omurga doğru itin.
- Microcapsules süspansiyon yaklaşık 1 µL böbrek bırakın ve yavaş yavaş iğne tutar.
Not: uygun delik site bulmak için daha kolay, pratik Şekil 2A ve 2B'yigösterildiği gibi bir alt ışık kullanarak balıklar transilluminating tarafından gövde böbrek bulmak için yararlıdır.
- Enjeksiyon yerinde dökülmüş herhangi bir microcapsules kaldırmak için su akışı ile kuyruk başından balık durulayın.
5. içinde Vivo görselleştirme
- Balık baştan gill kapağını çıkarın ve balık solungaçları denude için diseksiyon makası kullanın. Solungaçları su ile durulayın.
- Bir kaşık kullanarak, balık mikroskop slayda aktarmak ve floresan mikroskop sahnesinde yerini.
Not: balık solungaçları ardışık işlemler sırasında kurumasına olduğunu emin olun. Bunu önlemek için düzenli olarak onları nemlendirin su Pasteur pipet (yaklaşık her 1-2 dk) kullanarak. - Odayı karartmak ve düşük büyütme (x 10 amaç) kullanarak floresan microcapsules bulmak için solungaçları inceleyin.
Not: balık dolaşım sistemi içine bazı floresan parçacıkların giriş için yordam kullanıldığında, solungaçları, birkaç bireylerin enjeksiyonları önce beklenmedik floresan parçacıklar için incelemek için önerilir. Vahşi-türü zebra balığı solungaçları autofluorescence yok ama bazı durumlarda sporadik floresan parçacıklar (gıda parçaları veya tek hücreli simbiont) solungaçları üzerinde mevcut olabilir. Gerekli, bu tür parçacıklar belirli şekilleri göre kabul edilebilir eğer (örneğin, gıda adet düzensiz şekli, küresel microcapsules aksine var) veya floresan spektrum (Yani, renk).- Objektifin daha yüksek bir büyüklük (× 40 amaç) geçin ve bir microcapsule veya microcapsules bir grup görüş alanı ortasına yerleştirin.
- Yandaki bağlantı noktasına bağlı bir Spektrometre ile açmak. Spektral sinyal kaydedebilir.
- Mercek için geri kolu çevirin.
- Ölçümler için farklı microcapsules birkaç kere tekrar edin.
- Balık akvaryum kurtarma için uygun havalandırma ile aktarın.
Not: en az uygulama ile enjeksiyon ve 2-3 dk balık başına yaklaşık bir oranda kayıt sinyal yapmak mümkündür. Ölçüm bir bireysel birkaç kez anestezi tekrarlanan zararsız, düşük doz veya başka bir yöntemi fiksasyon kullanımı ile tekrar edilebilir. Uzun vadeli gözlem için bir sistem ile sürekli anestezi12kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elde edilen sonuçları sunulan Protokolü üç ana kategoride birinden gelir: bir floresan boya (Şekil 1), microcapsules daha fazla görselleştirme ile böbrek enjeksiyon encapsulation tarafından floresan microparticles oluşumu Gill kılcal damarlar (Şekil 2 ve 3) ve pH seviyeleri (Şekil 4) kan son olarak, in vivo spektral kayıt SNARF-1 floresans izlemek için.
Kaplama boya birden çok katmanı tarafından karşılıklı iliştirilen şablonu CaCO3 çekirdek kullanarak katman katman yaklaşım polimerler (PAH ve PSS) kullanılıyorsa ve biyouyumlu polimer (PLL-g-PEG) en dış tabakası basit ve düşük maliyetli bir yöntemdir SNARF-1-dextran, FITC-BSA veya diğerleri (Şekil 1A) gibi farklı floresan problar kapsüllemek için izin. Sonuç olarak, içi boş microcapsules micrometric, istikrarlı yarı geçirgen elastik kabukları ile boyut ve floresan boya ile yüklendi (Şekil 1B) elde edilir. Bu tekniği ile fabrikasyon microcapsules genellikle düzgün olmayan, partikül boyutu ve karakteristik ortalama boyutu her yığında (Şekil 1С) normal dağılım ile.
Resim 1 : Katman katman malzemelerin ve içi boş Polielektrolit microcapsules floresan bir boya ile dolu. (A) düzeni (Gurkov ve ark. 20164' te yayınlanan benzer bir düzeni çizilmiş) microcapsules derleme. (B) içi boş microcapsules resmini floresan boya FITC-BSA ile dolu. (C) microcapsules Şekil 1Büzerinden toplu karakterizasyonu boyutu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Dolaşım sistemi içine sağlam ve verimli microparticle implantasyonu küçük balıklar balık böbrek içine doğrudan el ile enjeksiyon tarafından gerçekleştirilebilir. Balık vücut (gövde böbrek) uygun sitedeki ponksiyon microparticles manuel iğne ile hızlı teslimat için önemlidir. Balık böbrek hematopoetik organ ve pigmente melanophores içerir ve bu nedenle de renklidir. Yüzme kesesi saydam odalar arasında nestled olduğunu çünkü zayıf pigmentasyon ile veya transillumination Şekil 2A ve 2B'yigösterildiği gibi alt ışık kaynağı kullanarak küçük balıklar tarafından olduğu gibi hayvan organ tanımlamak kolaydır.
Resim 2 : Böbrek enjeksiyon için doğru siteyi lokalizasyonu. (A) zebra balığı Trans ışıklandırması gövde böbrek (ok) lokalizasyonu gösterir. (B) düzeni uygun delik sitesini tanımlamak üzere verilmektedir. Beyaz noktalı çizgi sonradan içini kaplamak balıkların karın parçasının gösterir. Ok websitesi için iletilecek ponksiyon ve enjeksiyon omurga doğru düzgün yönünü gösterir. Yüzme kesesi yeşil hat tarafından atanır. Zebra balığı böbrek organlar ve vücut duvarın kaldırılması aşağıdaki (C) görselleştirme. Bir ok gövde böbrek merkezi şişlik için işaret eder. (D) yetişkin balıkların iç organları Genel anatomi D. rerio sagittal histolojik bölümünü gösterir (H & E leke). (E) test bir balık böbrek (noktalı) posterior Kardinal ven lümen için işaret bir ok ile (D) ölçekli. Yıldız yüzme kesesi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Enjeksiyon yordamı başarısı denetlemek için hızlı bir görsel denetim solungaçları düşük büyütmede (x10-20 amaç) balık gill kapak (Şekil 3A) kesim sonrası yapılmalıdır. Enjeksiyon yerinde kalan veya vücut boşluğuna (Şekil 3B), dökülmesini microcapsules çoğunu rağmen enjeksiyon doğru gerçekleştirilirse, serbestçe yüzen gill kılcal damarlar floresan microcapsules gözlemlemek mümkündür Hemen enjeksiyon (Şekil 3 c) sonra denuded balık solungaçları. Solungaçları yok floresan parçacıklar algıladıysa, aynı ponksiyon enjeksiyon tekrar mümkündür. Kan dolaşımına başarılı teslim toplam enjekte balık yaklaşık % 70-90 alınmalıdır.
Şekil 3 : Microcapsules daha fazla gill kılcal görselleştirme ile böbrek enjeksiyon. (A) microcapsule teslim zebra balığı kan dolaşımına genel düzeni. (B) bir zebra balığı (ponksiyon site bir okla gösterilen) yeşil FITC-BSA boya ile microcapsules enjeksiyon sonra floresan görüntü. (C) bu resmi (B), ölçekli balıkların solungaçları microcapsules başarılı teslimini böbrek iğne ile gösterir (vahşi tipi zebra balığı Solungaçlarım var hiç autofluorescence). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Balık gövde böbrek içine doğrudan enjeksiyon sırasında geniş normalde morarma ponksiyon site altında parankimi kılcal veya böbrek damarlarının zarar gösteren oluşturur. Hızlı bir şekilde sözleşme için delik görünür çünkü vücut dışında hiçbir kan sızıntı vardır. İç kanama rağmen bireylerin hala yaklaşık % 80-90 (Tablo 1) yordamında size hayatta kalmak ile kurtarabilirsiniz. Da bilinen balık türlerinin ın de novo yaralanma13,14sonrası yeniden oluşturabilirsiniz. Balık % 20'den fazla ölüyor, bir anesthetization düzgün yapılır emin olmalısınız.
| Kapsüllenmiş floresan boya | n | Konsantrasyon, microcapsules başına µL | Enjeksiyon hacmi, µL | Microcapsules, µm ortalama çapı | Balık kan dolaşımına, başarılı teslim % | Enjeksiyon sonra ölüm oranı % | |
| 1 h | 1 gün | ||||||
| Gövde böbrek içine enjeksiyon | |||||||
| FITC-BSA | 36 | 4 x 106 | 1.6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| SNARF-1-dextran | 29 | 3-6 x 105 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| RITC-dextran | 20 | 6 x 106 | 2 | 2.0 | 70 | 0 | 0 |
| % 0,9 NaCl | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| Retro-orbital ekleme | |||||||
| FITC-BSA | 9 | 1 x 105 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| RITC-dextran | 11 | 6 x 106 | 1 | 2.0 | 9 | 18 | 0 |
Tablo 1. Güvenlik ve verimliliği microcapsules teslimat zebra balığı kan dolaşımına. Yordamı başarısı varlığı balık gill kılcal floresan malzemeler ile belirlenir.
Enjekte microparticles konsantrasyonu yeterli değilse, çok az parçacıklar hızla balık solungaçları görüntülenmeyecektir mevcut olabilir. Aynı zamanda, bir süspansiyon çok yüksek bir konsantrasyon ile iğne yapışmasına neden olabilir. Medyan çapı ~ 2-5 µm ile katman katman monte microcapsules durumunda yaklaşık 4 * 105-6 * 106 microcapsules µL başına bir konsantrasyon balık solungaçları zahmetsiz algılaması balık böbrek (tablo içine enjeksiyon sonra görüntülemek için 2).
| Konsantrasyon, microcapsules başına µL | Bir mikroskop görüş alanı (× 20 amaç) solungaçları farklı bireylerin içinde microcapsules sayısı (n = 7 konsantrasyon başına) | ||||||
| 4 x 106 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 x 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 x 104 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 x 103 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tablo 2. Kayıt microcapsules FITC BSA içeren görsel sayma D. rerio solungaçları sonra enjeksiyon (1.6 µL) gövde böbrek içine.
Microparticles implantasyon balık dolaşım sistemi içine önerilen yöntem, zebra balığı kan pH vivo izlemek için mikroenkapsüle floresan sondası tarafından SNARF-1 (Şekil 4) uygulanabilir. SNARF-1 protonated ve deprotonated boya (4A rakam) emisyon için karşılık gelen iki zirveleri ile bir spektrum vardır, böylece farklı pH medya tepeler arasındaki oran eğrileri olabilir kalibrasyon (4B rakam) çizilen. Kan bileşenlerinin kapsüllenmiş SNARF-eşzamanlı kan pH ölçümü tarafından microcapsules ve pH-metre bir cam elektrot ile deneysel olarak değerlendirilebilecek 1 (Şekil 4B), okuma etkiler. Bir sözde kalibrasyon eğrisi microcapsules zebra balığı kan için deneysel olarak ölçülen pH farkı eşit katsayı tarafından arabellekleri eğrisi değişen tarafından çizilen (Borvinskaya ve ark. 20175 Ayrıntılar için bakınız).
Zebra balığı gill kılcal kan pH en az birkaç saat sonra microcapsules (Şekil 4 c) enjeksiyon sırasında sabit kalır. Aynı zamanda, bir kısa hypercapnic maruz kalma uygulanabilirliği üzerinde küçük balıklar vivo içinde araştırma yöntemi gösterir kan pH istatistiksel olarak anlamlı bir azalma yol açar.
Şekil 4 : Zebra balığı kan izleme temsilcisi örnek Kayıt mikroenkapsüle boya SNARF-1 floresans spectra ürününün tarafından рН. (A) hazırlanan microcapsules Spectra farklı pH sodyum fosfat arabelleklerindeki SNARF-1 ile dolu. (B) kalibrasyon eğrileri hazır pH duyarlı microcapsules sodyum fosfat tampon ve ayıklanan zebra balığı kan. Tüm ölçümler için Ortalama ± standart sapma tasvir edilir. (C) bir temsili örnek, zebra balığı gill kılcal kapsüllenmiş floresan SNARF-1 boya tarafından izleme vivo içinde zebra balığı kan рН. 5 dakika pozlama şiddetli hypercapnia (çözünmüş CO2900-1000 mg/L) altında asitleştirme balık kan neden olur iken kontrol koşullarda kan pH 4 saat sonra microcapsules, enjeksiyon sırasında sabit kalır. Yıldız işareti p < 0,01 (Mann-Whitney U testi) ile paralel kontrol grubundan istatistiksel olarak anlamlı fark gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microparticles enjeksiyon zebra balığı böbrek içine göstermek için yarı geçirgen microcapsules bir göstergesi boya ile yüklenen kullanılmıştır. Böylece, iletişim kuralı kullanarak katman katman derleme ters şarj edilmiş polyelectrolytes7,8,15,16,17 microcapsules imalatı için yönergeler içerir ,18 (Şekil 1A). Bu teknolojinin bir avantaj elde edilebilir Labaratuar donanımları ile gerçekleştirmek kolay olmasıdır. Koşullar ve kullanılan bileşikler bağlı olarak, uydurma microcapsules 0,5 nanometre kalınlığında Polielektrolit Kabuk15ile 100 µm değişebilir. Sentez parametreleri elastik microcapsules polimerler (yanı sıra son biyouyumlu kat) 12 kat oluşan bu el yazması sonucu yaklaşık 2-6 µm boyutunda (Şekil 1B ve 1 C) açıklanmıştır. Microcapsules boyutunu belirleyen en önemli adımdır şablon microcores oluşumu. Bu işlem kendiliğinden kalsiyum karbonat kristalleri oluşumu içerir ve bu nedenle, elde edilen parçacıklar üniform olmayan. Bu nedenle, microcapsule boyutu dağıtım karakterizasyonu her toplu işlem için yapılmalıdır.
Önemli bu protokol optimizasyon microparticles teslimat embriyolardan teknikleri kullanmaya gerek kalmadan zebra balığı dolaşım sistemine aşamasıdır. Retro-orbital iğne ile tüm hücreleri yönetimini daha önce detay3' te tanımlanmıştır. Ancak, deneyim, çünkü retro-orbital sinüs çok küçük ve farinks ve gill kemerler, yanlışlıkla bir iğne ile yaralama kolaydır yakındır yazarlar tarafından açıklanan enjeksiyon verimliliği elde etmek acemi kullanıcılar için kolay değil. Bir milimetre beri doğruluk gereklidir için enjeksiyon, düzgün enjekte oldukça zor bir iştir. Eşit hızlı ve daha verimli alternatif (Tablo 1) doğrudan balık böbrek parankimi enjekte etmektir. Enjeksiyon sırasında iğne mekanik böbrek kılcal damar ve kan damarları (Örneğin, en büyük posterior Kardinal ven), dolaşım sistemi (Şekil 2E) microparticles girişi sağlayan zarar veriyor. Son olarak, Yetişkin zebra balığı gövde böbrek merkezi şişlik büyük yeterli (ilâ 2 mm) için el ile bir enjeksiyon mikrocerrahi aletler olmadan.
Enjeksiyon iğne uygun konumlandırma başarılı bir el ile yönetilmesi için önemlidir. Alt ışık Şekil 2A ve 2B'yiiçinde gösterildiği gibi kullanarak transilluminating balıklar tarafından olduğu gibi hayvanlarda gövde böbrek bulmak pratik yapabilirsiniz. Şekil 2B düzeninde düzgün enjeksiyon gerçekleştirmek gösterilmiştir. Microparticles kan akışı içine yönetmek yordamı başarısız olursa, yeniden enjeksiyon bireylerin sağkalım oranı üzerinde neredeyse hiçbir etkisi ile bir kısa süre içerisinde aynı ponksiyon yapılabilir.
Yetişkin zebra balığı (de başarıyla test edilmiştir yetişkin guppy Poecilia reticulata) gövde böbrek içine enjeksiyon microparticle teslimat izin verilen bir hayvan mortalite ile balık kan dolaşımına etkili bir yöntemdir; Ancak, mükemmel enjekte birimi farklılığı nedeniyle ilaç idaresi için uygun değildir. Bu tekniğin bir zayıf nokta karın içine böbrek dışında çözümün önemli bir kaçak nedeniyle hızlı ilçedir. Yine de, kan dolaşımına enjekte maddenin göreli miktarı kabaca görselleştirme gill kılcal (Tablo 2) kullanarak tahmin edilebilir. Enjeksiyon biriminin katı sınır yoktur ama süspansiyon daha--dan 1 µL yönetim etkisiz gibi görünüyor. En iyi cam kılcal damarlar için Mikroenjeksiyon uygulanabilir; Ancak, çok sayıda microcapsules toplama teşvik eğilimindedir çünkü 31-29 G kullanımı önerilir (Ø 0,33-0,25 mm) çelik iğne iğne lümen takunya önlemek için.
Microcapsule teslim böbrek enjeksiyonuyla kan dolaşımına başarısı solungaçları floresan parçacıkları varlığı için hızlı denetim kullanılarak izlenmelidir. Solungaçları vivo gözlemler için kolayca erişilebilir organları vardır. Gill filamentler kan kılcal damarlar (bir çeşit doğal optik pencere) solungaçları geçici intravital görüntüleme kan akışı özellikle uygun solunum epitel ince bir tabaka ile kaplı bir şebekesidir. Gözlem yapmak için kıkırdak gill kapak filamentler ortaya çıkarmak için kesilebilir. Bu yordamı bir azalma yaşam beklentisi olmadan de Gazlı su denuded solungaçları ile yaşayabilir balık için güvenlidir. Ayrıca, büyük balık solungaçları mikroskop altında sadece operculum şekilde19dışına iterek incelenebilir. Başarılı bir enjeksiyon durumunda, floresan microparticles hemen solungaçları (Şekil 3) görüntülenir. Not implante microparticles önemli ölçüde dolaşımdaki kan hacmindeki çözülür ve parçacıklar azaltılmış bir dizi gill kılcal ulaşmak, böylece microparticles yeterli konsantrasyonu balık solungaçları sonra algılaması için seçilen Enjeksiyon içine balık böbrek (Tablo 2).
İmplantasyon için önerilen yordam küçük balıklar farklı türler ile ilgili çalışmalar geniş bir alanda uygulanabilir. Rağmen geliştirilmiş ve floresan microparticles enjeksiyon içine dolaşım sistemi için en iyi duruma getirilmiş tekniği, renkli mikro/nano tanecikleri implantasyonu için uygulanabilir veya çözünmüş maddeler; Ancak, bu durumda enjeksiyon verimliliğini başka bir şekilde doğrulanmış olmalıdır. Şu anda açıklanan adımları bu tür amaçlar için en iyi durumda gibi fizyolojik farklı optik mikro - veya nanosensors, damarlara görselleştirme, aşı ya da ilaç teslim bazı optik görünür taşıyıcıları ve implantasyonu kullanarak izleme Genetiği değiştirilmiş hücreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar büyük ölçüde Bogdan Osadchiy ve Evgenii Protasov (Irkutsk State University, Rusya) yardımıyla video Protokolü hazırlanmasında kabul etmiş oluyorsunuz. Bu araştırma için temel araştırma (#15-29-01003) Rus Bilim Vakfı (#15-14-10008) ve Rus Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
