Summary
Здесь мы представляем протокол для модуляции трансген выражения, с помощью переключателя единственного гена pEUI(+), tebufenozide лечение.
Abstract
Точный контроль трансген выражение желательно в биологических и клинических исследований. Однако поскольку функцию двоичного применяемым в настоящее время гена коммутаторов требует передачи двух единиц терапевтических выражение одновременно в одну ячейку, ограничен практическое применение системы для генной терапии. Чтобы упростить выражение системы трансген, мы создали ген переключатель, как pEUI(+), охватывающих полный набор трансген выражение модулей в один вектор. В составе домена GAL4 ДНК-связывающих и модифицированных EcR (GvEcR), минимальным VP16 активации домена сливается с GAL4 дна-связывая домене, а также изменение дрозофилы экдистероидов рецептор (ККМ), недавно разработанный единственного гена переключатель является высоко реагировать администрации химического индуктор в зависимости от времени и дозировки. PEUI(+) вектор является потенциально мощным инструментом для улучшения управления трансген выражения в биологических исследований и доклинические исследования. Здесь мы представляем подробный протокол для модуляции преходящими и стабильные трансген выражения с использованием вектора pEUI(+) лечения tebufenozide (Teb). Кроме того мы разделяем важные руководящие принципы для использования Teb в качестве химического индуктором.
Introduction
Несколько коммутаторов различных генов были изучены для их способности точно регулировать трансген выражение в культуре клеток и моделях животных, с различной степенью успеха1,2,3. Потенциал системы коммутатора генов должны встретиться несколько строгих критериев, в том числе: точное выражение направления трансген, зависит от дозы и времени учет индукторов, незначительной утечки промоутер, обратимость трансген Активация через индуктор удаления и уровни токсичности индуктором терпимый клеточных линий и лабораторных животных1,2,3. Были использованы несколько малых молекул индукторов, включая тетрациклин4,5, rapamycin6,7,8, мифепристон9,10, и экдистероидов11,12,,1314. В общем эти системы требуют, по крайней мере два плазмид, содержащие два или три дискретных выражение единицы, один или два из которых составляют элемент регулирования (индуктор плазмида), который связывает малые молекулы индуктором получить транскрипционный анализ деятельности; и еще один плазмида (эффекторных плазмида) содержащий трансген под контролем регулирования региона ДНК, которая позволяет доступ индуктором привязанных элементов регулирования. Основным недостатком двоичной системе является, что она требует сочетанной введение двух векторов (индуктор и эффектор) в целевой ячейке. В экспериментах выражение переходных трансген одновременное трансфекции двух плазмид неизбежно производит популяция клеток, которые поодиночке transfected с индуктором или эффекторных, или совместно transfected неравномерно. Кроме того двойная система требует по крайней мере двух раундов антибиотика выбора для установления стабильных клеточных линий, который является длительным и трудоемким. Таким образом комбинируя все компоненты необходимые для трансген выражения и регулирование в единый вектор будет идеальным гарантировать соответствующее выражение все необходимые элементы в одну ячейку и регуляцию экспрессии трансген лечение с малых молекул индукторов.
Для преодоления недостатков, бинарных гена коммутаторов, мы недавно разработали единственного гена переключатель, с помощью Drosophila melanogaster на основе EcR генов системы индуцибельной15. Экдистероидов опосредует экспрессии генов, когда он привязывается к гетеродимера EcR/ultraspiracle (USP), который в свою очередь вызывает привязку EcR ДНК регуляторных элементов3,11. Рецептор позвоночных ретиноидов X (RXR), ortholog насекомых USP, новобранцев EcR сформировать активную transcriptional активатор16. Таким образом для целевого выражения трансген в позвоночных клетки или ткани, EcR и RXR должны быть совместно выразили одновременно до того, стимулируется экдистероидов или его агонистов. Поскольку гетеродимерная особенностью коммутатора на основе EcR ген может быть под влиянием эндогенного RXR уровня, Padidam и др. заменены гетерологичных GAL4 ДНК-связывающих, vmw65 белков вируса простого герпеса EcR ДНК-привязки и активации домены домены активации (VP16) сливается с EcR лиганд связывающий домен, который затем стал отвечать на эндогенных RXR и сформировал Антуану чтобы получить транскрипционный анализ деятельности17. Переключатель на основе EcR гена далее была улучшена путем создания химерных белок, состоящий из минимальной активации домена VP16, в сочетании с GvEcR, который сформировал Антуану и локализуется в цитозоле в отсутствие агониста экдистероидов Teb16, 18. Путем привязки к Teb, GvEcR изменил его субцеллюлярные локализации от цитозоль к ядру признать гибрид промоутер, состоящая из данио рерио E1b минимальным промоутер в сочетании с десяти тандем повторил вверх по течению последовательностей (UASs) инициировать Транскрипция целевого гена16.
Чтобы упростить сообщалось ранее на основе EcR гена выключатели16,18, мы объединили в один вектор оснащены всеми необходимыми элементами для стимулирования трансген выражение и затем назначил двоичных функции системы вновь созданный вектор, pEUI(+) (GenBank присоединения число: KP123436, рис. 1A)15. Эффектор, отвечая на GvEcR (далее драйвер) состоит из десяти тандем, который UAS повторяет рядом с E1b минимальным промоутер, последовали несколько клонирования сайта (MCS) с EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, АФМП и AflII признание последовательностей (Рисунок 1B). Кроме того, чтобы облегчить выбор transfected клеток, puromycin, промоутер driven SV40 N-ацетил-трансферазы (PAC) ген был помещен между водителем и эффекторных регионами для поддержания стабильных клеточных линий (рис. 1).
Мы описываем подробный протокол для переходных и стабильные модуляции трансген выражения с помощью pEUI(+). Кроме того мы предоставляем подробные инструкции для успешного использования Teb как агониста экдистероидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. трансген Subcloning
- Выберите соответствующий энзима ограничения распознавания сайта (или сайтов) в MCS pEUI(+) и subclone гена интереса в нужном направлении (рис. 1).
Примечание: Флаг или EGFP epitope тегами Анкирины повторить домена 13А трансген (ANKRD13A) был subcloned в EcoRI сайте pEUI(+) вектора с использованием T4 ДНК-полимеразы в последовательности и перевязка независимый клонирования метод19. - Линеаризации pEUI(+) с EcoRI в течение 1 ч при 37 ° C. Mix 50 нг/мкл линеаризованных pEUI(+) с 40 нг/мкл ПЦР усиливается EGFP или ANKRD13A и реагируют с T4 ДНК-полимеразы (1 U) за 1 мин при комнатной температуре (RT) до инкубации на льду для 10 минут добавить 10 мкл реакционной смеси непосредственно на 100 мкл Эксперимент DH10B сведущие клетки для следующих преобразований.
Примечание: Хотя несколько сайтов энзима ограничения распознавания были добавлены в MCS pEUI(+) (рис. 1B), мы рекомендуем subcloning целевого гена в EcoRI сайт, перевязка независимые клонирования технологии19,20. - Проверка вставки путем sequencing и затем очистить с помощью ДНК очистки комплект, который подходит для transfection ДНК.
2. Переходное Transfection и Teb лечение
- Подготовьте четыре блюда культуры клеток (диаметром 60 мм), содержащих свежую пассированный HEK293 клетки в 5 мл среды Дульбекко изменение орла (DMEM) с 5-10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и антибиотиков (100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл). Далее «клетки культуры среднего» или просто «культура среднего» представляет DMEM, дополненная FBS и антибиотики. Сохранить HEK293 клетки на 37 ° C.
- Transfect 1 мкг очищенная ДНК в клетки HEK293 на 50-60% плотности с помощью 3 мкл Реагента transfection. Добавьте трансфекции реагент 200 мкл растворителя (DMEM без FBS и антибиотиков) содержащий ДНК. После инкубации реакционной смеси для 30 мин на RT добавьте смесь на ГЭС-293 ячейки культуры блюдо. Используйте два блюда для transfection и оставить другие два не лечить как элементы управления.
- После 12-24 ч трансфекции добавьте Teb (окончательный концентрации, 0,2 - 10 мкмоль) к одному из transfected образцов и один из не transfected управления. Оставьте других двух выборок, лечить как экспериментальных элементов управления.
Примечание: Teb Стоковый раствор (растворяют в диметилсульфоксида 50 мм) могут быть ослаблены в ячейке питательной среды, DMEM или фосфат амортизированное saline (PBS) в соответствующей концентрации перед добавлением культивируемых клеток в зависимости от экспериментальных параметры. Однако из-за низкой растворимости Teb в водном растворе, Избегайте подготовки мастер смеси с высокой концентрацией Teb в среде; Вместо этого замените полный клетки культуры среднего свежие носитель, содержащий Teb в нужной концентрации. - Культивировать Teb обработанных и необработанных клетки для 12-48 ч при 37 ° C.
- Если с помощью EGFP , анализировать EGFP выражение под микроскопом флуоресцентные ( рис. 2). В противном случае урожай клетки для immunoblotting assay.
- Для immunoblotting assay промойте клетки дважды с ледяной PBS и очистите их с помощью скребка ячейки.
- Для укладки клетки, уменьшается урожай в 15 мл конические пробки на 21 000 x g для 2 минут при 18-25 ° C (RT).
- После отмены PBS полностью, добавить 0,5 мл ледяной млекопитающих белка добычу реагента (M-за), вместе с ингибитором протеазы (5 мкл 100 x ингибитор протеазы коктейль), Пелле, если клетки культивировали в блюдо 60 мм.
- Вновь приостановить клетки с нескольких раундов закупорить, затем и инкубировать и подвесной клетки для 15 мин при температуре 18-25 ° C (RT).
- Спиновые ячейки lysate на 21 000 x g 10 мин при 4 ° C.
- Передача водный супернатант в пробки microcentrifuge свежие 1,5 мл.
- Анализировать супернатанта, immunoblotting, следующие стандартные протоколы с соответствующим антител.
3. поколение стабильной HEK293 клеточных линий с геномной интеграции pEUI(+) гена переключатель
- Transfect 5-10 мкг очищенный pEUI(+) с трансген в HEK293 клетки, которые являются 50-60% притока в 90 мм диаметр клетки культуры блюдо, используя 15-30 мкл Реагента transfection. Добавьте трансфекции реагент 500 мкл растворителя (DMEM без FBS и антибиотиков) содержащий ДНК. После инкубации реакционной смеси для 30 мин на RT добавьте смесь на ГЭС-293 ячейки культуры блюдо.
- После трансфекции позволяют transfectants расти и выразить продукты гена puromycin сопротивление под неизбирательной питательной среды (без puromycin) за 24-48 ч при 37 ° C.
- Отделить клетки от культуры блюда по trypsinization. После отмены питательной среды, промойте transfectants с подогретым PBS (37 ° C), добавляют 1 мл 0,25% трипсина/Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и инкубировать в течение 1 мин при температуре 37 ° C. После закалки трипсина/ЭДТА, добавив подогретым культуры среднего (10 мл, 37 ° C), урожай клетки, скребком ячейки, а затем центрифугированием в 15 мл конические пробки на 21 000 x g 2 минут при 18-25 ° C.
- Вновь приостановите transfectants в 50 мл подогретым питательной среды (37 ° C), и передачи 10 мл клеток в 90 мм свежие клетки культуры блюда. Культура клетки при 37 ° C до 50-60% confluency перед началом лечения puromycin (в общем, это занимает около 24-48 ч).
- Культивируйте transfectants при 37 ° C в среде культуры клеток, дополненный 3 мкг/мл puromycin для 3-4 недели. Период отбора измените среднего культуры клеток, содержащих puromycin (3 мкг/мл) каждые 2-3 дня для поддержания давление отбора. Когда клетки становятся полностью вырожденная, разделить их после процедуры, описанные в шагах 3.3-3.4, с puromycin содержащих питательной среды. Отменить оставшиеся ячейки в среде культуры, если не требуется.
Примечание: Условия отбора Puromycin необходимо экспериментально установлено для типов конкретных ячеек. Мы использовали 3 мкг/мл puromycin в среде культуры клеток; Это было достаточно, чтобы вызвать смерть клетки в не transfected HEK293. - Урожай клетки от отдельных колоний, с помощью клонирования цилиндр и следуйте инструкциям производителя.
- Отказаться от среднего культуры клеток. Промойте пластины дважды с подогретым (37 ° C) PBS для удаления плавающих клеток.
- С помощью стерильный пинцет, установите клонирования цилиндров над отдельными колониями.
- Добавьте 0,2 мл 0,35% трипсина/ЭДТА в каждый цилиндр.
- Инкубируйте блюдо при 37 ° C за 1 мин до тех пор, пока клетки отдельно, а затем добавьте несколько капель подогретым (37 ° C) питательной среды к цилиндрам.
- Передать клетки от каждого цилиндра отдельных скважин 6-ну плиты, с 2 мл питательной среды и 1 мкг/мл puromycin в каждой скважине.
Примечание: Когда клетки становятся вырожденная, масштабирование культуры. Теперь clone(s) может быть установлено.
- Поддержание отдельных клонов в среде культуры клеток, дополнены 1 мкг/мл puromycin.
- Проверка отдельных колоний путем проверки их чувствительность к Teb лечения (конечная концентрация, 10 мкм) для 24 h. тест реакции клонов Teb, анализируя уровень экспрессии трансген с immunoblotting. Выберите желаемый клон (или клоны). Культивируйте Teb лечение и необработанных образцов в питательную среду для 12-48 ч при 37 ° C прежде чем анализировать уровень индукции трансген. Уровень экспрессии трансген может быть измерена путем immunoblotting, следуя процедурам, описанным в шагах 2.5.1 - 2.5.7.
4. истощение Teb
- Утолите Teb раздражители, заменив Teb содержащие клетки культуры среднего Teb свободной среде.
Примечание: Рекомендуется заменить роста СМИ без первого повторного заполнения ячеек на новой культуры блюдо. Остаточные Teb появляется цепляться за пластиковые тарелки и вызовут сильную предпосылку, проявление трансген. До повторного заполнения ячейки на новой культуры пластины, промойте заготовленных клеток несколько раз с питательной среды или PBS.- Отделить клетки от культуры блюда по trypsinization. После отмены Teb, содержащие питательной среды, промойте Teb стимулирует клетки дважды с подогретым PBS (37 ° C), добавляют 1 мл 0,25% трипсина/ЭДТА и инкубировать в течение 1 мин при температуре 37 ° C. После закалки трипсина/ЭДТА, добавив подогретым Teb свободной культуры среднего (10 мл, 37 ° C), урожай клетки, скребком ячейки, а затем центрифугированием в 15 мл конические пробки на 21 000 x g 2 минут при 18-25 ° C.
- Вновь приостановите клетки в 50 мл подогретым Teb свободной культуры среднего (37 ° C), и передачи 5 мл клеток в три блюда культуры свежие клетки 60 мм. Культура клетки при 37 ° C за 24, 48 и 72 ч соответственно.
- Урожай клетки в разное время точках и измерить уровень экспрессии трансген, используя immunoblotting.
Примечание: В этих экспериментальных условиях, трансген выражение стало обнаружить около 3 дней после культуры клеток в культурной среде, Teb бесплатно (рис. 3). Уровень экспрессии трансген может быть измерено immunoblotting, согласно шаги 2.5.1 - 2.5.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Переключатель GvEcR-на основе единственного гена изображен на рисунке 1A. PEUI(+) вектор был оптимизирован для регулируемых трансген выражение путем обращения с Teb. Эффектор регион pEUI(+) включает в себя 10xUAS и E1b, минимальным промоутер следуют MCS, содержащие EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, АФМП и AflII энзима ограничения распознавания объектов. Сигнал poly(A) SV40 был добавлен за MCS (рис. 1B). Гена Пак был вставлен между водителем и эффекторных регионами pEUI(+) придать устойчивость к puromycin.
Для оценки деятельности и негерметичности pEUI(+), мы subcloned EGFP в EcoRI сайт MCS (pEUI(+)-EGFP), временно transfected плазмидные конструкции в HEK293 клетки и ведении Teb в различных концентрациях для 24 h ( ) Рисунок 2). В то время как макет вектор, transfectants не показывают флуоресцентные сигналы независимо от лечения Teb (Рисунок 2а, Б), pEUI (+)-EGFP transfectants стал постепенно ознакомлены возросшее количество Teb (рис. 2 c–F ). Что еще более важно, pEUI (+)-transfectants EGFP без лечения Teb не вызывают каких-либо обнаружить сигналы EGFP под микроскопом флуоресцентные (рис. 2 c).
Для дополнительной проверки реакции pEUI(+) Teb, мы subcloned гена ANKRD13A epitope тегами флаг в EcoRI сайт pEUI(+), передана конструкцию в HEK293 клетки и затем подвергается puromycin выбор для 3 недель, чтобы установить линия с ANKRD13A трансген нужной ячейки. Мы проанализировали выражение ANKRD13A трансген после 24 ч лечения с Teb и установленным клеточная линия ответил хорошо (рис. 3). Далее мы продемонстрировали обратимости коммутатора гена pEUI(+), разрушающих Teb от культурных средств массовой информации. Как показано на рисунке 3, ANKRD13A выражение было обнаружить когда мы культивируемых клеток в Teb свободных средств массовой информации.
Рисунок 1 . Схематическая диаграмма pEUI(+). (A) векторная карта pEUI(+) был построен. Промоутер ЦМВ диски учредительный выражение GvEcR. Teb прыгните GvEcR будет перемещать в ядре и привязать 10xUAS СНГ-действующих нормативных последовательности, чтобы стимулировать проявление трансген, вставляется в MCS. (B) последовательности информации между квадратные скобки в (A) содержит весь эффекторных последовательности pEUI(+). Стрелки обозначают отдельные энзима ограничения распознавания сайты, включенные в MCS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Переключатель GvEcR-на основе единственного гена реагирует на лечение Teb. HEK293 клетки были transfected с указанным ДНК конструкции. После 24 ч трансфекции клетки были стимулируется за 24 ч в показанную концентрацию с Teb. EGFP трансген активность наблюдалась под микроскопом флуоресцентные. Макет transfectants с pEUI(+) не показывают каких-либо обнаруживаемой флуоресценции с (A) или без лечения Teb (B). (EC–) Интенсивности флуоресценции в pEUI (+)-EGFP-transfected клеток увеличивается в зависимости от дозировки Teb. Шкалы, 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . HEK293 клетки стабильно укрывательстве pEUI (+) / флаг-ANKRD13A обратимо реагировать администрации Teb. ФЛАГ с тегами epitope ANKRD13A выражение было вызвано Teb лечения (1,5 мкм). После 24 часов лечения с Teb клетки были переключается Teb отсева СМИ для указанного количества времени. Относительное количество ANKRD13A был измерен Западный blotting с антитела анти флаг. Эндогенный уровень экспрессии α-тубулина была измерена с антитела анти α-тубулина как элемент управления. Белая звездочка указывает неопознанных cross-reactive видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Главный недостаток с помощью переключателя выражения двоичного гена является необходимость одновременно доставить два отдельных плазмид (водитель и эффектор) в целевой ячейке. Это может привести к неравного распределения плазмиды и результат в несогласованном ответ переключателя индукторов1,2,3. Еще одним недостатком системы двух вектор является то, что как минимум двух раундов антибиотика выбора для выявления перспективных линий клеток. Таким образом ген индуцибельной кассеты, состоящий из одной единицы давно была запрошена для использования в биологических исследованиях. PEUI(+) переключатель сингулярные трансген выражение содержится в единый вектор оснащены всеми регулирования подразделений, необходимых для стимуляции трансген. Таким образом индукция уровень трансген, subcloned в pEUI(+), зависит от количества ДНК transfected в переходных трансфекции эксперимент и дозировки химических индуктором. Кроме того мы далее испытания использование pEUI(+) вектора, создавая стабильные ячейку строки, содержащей одну копию трансген ANKRD13A 15. Установленным клеточная линия показал высокую чувствительность к Teb лечения (рис. 3). Коллективно его высокая чувствительность, обратимость и низкой негерметичности15, наряду с ограниченным различия в уровне выражения делают pEUI(+) ценные молекулярной и клеточной инструмент для манипулирования целевого выражения гена.
Среди различных системы индуцибельной генов мы выбрали GvEcR зависимых генов индукции кассеты. GvEcR имеет ряд преимуществ перед другими системами: во-первых, липофильности нескольких экдистероидов аналогов, используется как химический индукторов (включая Teb) является выгодным для эффективного проникновения клеточных мембран21; Во-вторых существует не EcR Ортологи позвоночных, поэтому агонистов экдистероидов не влияют на функции эндогенно выразили ядерные рецепторы21,22; в-третьих Экдистероиды безобидные позвоночных и быстро очищается от циркуляции системы в естественных условиях21,23; и в-четвертых, поскольку многочисленные агонистов экдистероидов были разработаны до настоящего времени, выбора оптимального размера малых молекул, исследователи могут избежать нежелательных осложнений13,22,24. Хотя pEUI(+) показывает высокую чувствительность к Teb, тестирование реакции pEUI(+) в другие агонистов экдистероидов может оказаться ценным. Существование нестероидные EcR агонисты, например methoxyfenozide, которые являются более растворим в воде, чем Teb24 может расширить сферу применения pEUI(+). Хотя выражение трансген в pEUI(+) относительно слабее, чем в системы тет-на15, уровень трансген индукции может быть увеличена добавлением нескольких копию домена transactivation VP16 (данные не показаны). Последние генной терапии приложения были сосредоточены на безопасной доставки целевых генов в клетки или ткани, которые не имеют соответствующих функциональных генов продукта благодаря генетическим заболеванием25,,2627. Однако нерегулируемые трансген под контролем ткани конкретных или вирусный учредительный промоутеров может вызывать гипер выражение гена целевого объекта, который повышает возможности местных тканей ущерб28,29. Таким образом применение надежной гена переключатель для генной терапии может избежать нежелательных осложнений. PEUI(+) вектор предоставляет удобный и мощный инструмент для управления трансген выражение в биологических и клинических исследований. В настоящее время мы разрабатываем сингулярные лентивирусные вектора на основе GvEcR увеличить диапазон применения нашей системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.
Acknowledgments
Авторы благодарят S-Y Чой (университета Национальный университет) за ценные замечания и тщательное чтение нашей рукописи. Эта работа была поддержана научный фонд Чхуннам национального университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. , InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
