Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אפנון הביטוי transgene באמצעות מתג יחיד ג'ין pEUI(+) על ידי טיפול tebufenozide.
Abstract
שליטה מדויקת של הביטוי transgene רצוי במחקרים ביולוגית וקלינית. אולם, בגלל התכונה בינארי של מתגים ג'ין מועסקים כיום דורשת ההעברה של שתי יחידות טיפוליות ביטוי במקביל לתא בודד, היישום המעשי של המערכת עבור ריפוי גנטי הוא מוגבל. כדי לפשט את המערכת ביטוי transgene, יצרנו מתג ג'ין כמנהל pEUI(+) המקיף ערכה מלאה של מודולי ביטוי transgene וקטור יחידה. הכוללת של התחום מחייב GAL4 DNA, ששונה EcR (GvEcR), תחום הפעלה מינימלית VP16 התמזגו עם תחום מחייב GAL4 DNA, כמו גם קולטן ecdysone דרוזופילה ששונתה (EcR), המתג פיתח גן מיוחד במינו הוא מאוד מגיבים אדמיניסטרטיבי משרן כימי באופן זמן ותלוי במינון. וקטור pEUI(+) הוא כלי רב עוצמה פוטנציאל לשיפור השליטה של הביטוי transgene המחקר הביולוגי והן מחקרים קליניים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור אפנון של ביטוי transgene ארעית ויציבה באמצעות וקטור pEUI(+) על ידי הטיפול של tebufenozide (טב). בנוסף, אנו חולקים חשוב הנחיות השימוש של טב משרן כימי.
Introduction
מספר הגן שונה מתגי נחקרו על יכולתם לווסת דווקא transgene ביטוי תרבית תאים, מודלים, בדרגות שונות של הצלחה-1,-2,-3 מערכות מתג גנים פוטנציאליים צריך לעמוד בקריטריונים מחמירים שונים, כולל: ביטוי כיווני מדויק של transgene, המינון ותלוי זמן ההיענות inducers, leakiness זניח של האמרגן, הפיכות של transgene הפעלה באמצעות הסרת משרן משרן רמות רעילות נסבלת שורות תאים ו2,1,חיות מעבדה3. מספר מולקולה קטנה inducers נוצלה, כולל טטרציקלין4,5, rapamycin6,7,8,9,mifepristone10, ecdysone11,12,13,14. באופן כללי, מערכות אלו דורשים לפחות שני פלסמידים המכיל שתיים או שלוש יחידות ביטוי דיסקרטית, אחד או שניים מהם לחבר רכיב תקינה (משרן פלסמיד) המאגד של משרן מולקולה קטנה כדי לזכות פעילות גנים ברמת השעתוק; פלסמיד אחר (אפקטור פלסמיד) המכיל את transgene תחת השליטה של אזור DNA תקינה המאפשרת את הגישה של רכיב מאוגד משרן רגולטוריות. החיסרון העיקרי של מערכת בינארית היא שזה דורש המבוא בו-זמני של שני וקטורים (משרן ו אפקטור) לתוך תא היעד. בניסויים ביטוי transgene ארעי, תרביות תאים בו זמנית של פלסמידים 2 מייצרת באופן בלתי נמנע אוכלוסיה של תאים ביחידים transfected עם משרן או את אפקטור, או שיתוף transfected ושליחותם. בנוסף, השיטה הבינארית מחייב לפחות שני סיבובים של הבחירה אנטיביוטי כדי ליצור שורות תאים יציב, וזו ההגדרה המפורטת. לפיכך, המשלב את כל הרכיבים הדרושים עבור הביטוי transgene, תקנה לתוך וקטור יחידה יהיה אידיאלי להבטיח את הביטוי בו-זמני של כל הרכיבים הנדרשים בתא יחיד ולאפשר ויסות ביטוי transgene דרך הטיפול עם inducers מולקולה קטנה.
כדי להתגבר על החסרונות של ג'ין בינארי מתגים, לאחרונה פיתחנו מתג יחיד ג'ין, באמצעות דרוזופילה melanogaster ג'ין מבוסס-EcR מערכת inducible15. Ecdysone שמתווכת ביטוי גנים כאשר הוא נקשר אל heterodimer EcR/ultraspiracle (USP), אשר בתורו גורם עקידת EcR ה-DNA גורמים רגולטוריים3,11. הקולטן חוליות retinoid X (RXR), ortholog של חרקים USP, מגייס EcR ליצירת מטוס activator תעתיק פעיל16. לפיכך, עבור הביטוי יישוב של transgene חוליות תאים או רקמות, EcR RXR חייב להיות שותף ביטוי בו זמנית לפני להיות מגורה על ידי ecdysone או אגוניסטים שלו. מאז התכונה heterodimeric של הבורר גנים מבוססת-EcR שיכול להיות מושפע אנדוגני RXR רמה, Padidam et al. מוחלף על התחומים EcR DNA מחייב והפעלה heterologous GAL4 DNA מחייב, vmw65 חלבון וירוס הרפס סימפלקס (VP16) הפעלת תחומים דבוקה התחום מחייב ליגנד EcR, אשר לאחר מכן הפך להגיב RXR אנדוגני, נוצר homodimer של כדי לזכות פעילות גנים ברמת השעתוק17. הבורר גנים מבוססת-EcR היה עוד יותר משופר על ידי בניית חלבון chimeric מורכב תחום הפעלה VP16 מינימלי, בשילוב עם GvEcR, אשר נוצרו homodimer מקומית ציטוזול בהיעדרו של ecdysone אגוניסט, טב16, 18. באמצעות קשירה טב, GvEcR שונה לוקליזציה subcellular שלה ציטוזול את הגרעין לזהות מקדם היברידית מורכבת דג זברה E1b יזם מינימלי בשילוב זוגיים עשר חזר על הפעלת במעלה רצפים (UASs) ליזום שעתוק של ה-ג'ין היעד16.
כדי לפשט את הגן מבוססת-EcR שדווחה בעבר מפסיקים16,18, שילבנו בין התכונות בינארי של המערכת לתוך וקטור יחידה מצויד עם כל הרכיבים הנדרשים עבור מגרה transgene ביטוי ולאחר מכן המיועד הווקטור החדש שנוצר, pEUI(+) (מספר גישה GenBank: KP123436, איור 1A)15. אפקטור להגיב על הנהג GvEcR (להלן-התקן) מורכב טנדם עשר UAS חוזר ליד יזם מינימלי E1b ואחריו אתר שיבוט מרובים (MCS) עם רצפי זיהוי EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ו- AflII (איור 1B). בנוסף, כדי להקל על הבחירה של transfected תאים, puromycin מונחה יזם Nשל SV40-אצטיל-טרנספראז (PAC) ג'ין הושם בין האזורים אפקטור ונהג כדי לשמור על שורות תאים יציב (איור 1).
אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור אפנון ארעית ויציבה של הביטוי transgene תוך שימוש pEUI(+). בנוסף, אנו מספקים הוראות מפורטות לשימוש מוצלח של טב כמו אגוניסט ecdysone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transgene Subcloning
- בחר אתר הכרה של אנזים הגבלה המתאים (או אתרים) MCS של pEUI(+), subclone את הגן עניין בכיוון הרצוי (איור 1).
הערה: ankyrin מתויג epitope EGFP או דגל חזור על תחום 13A transgene (ANKRD13A) היה subcloned EcoRI באתר של וקטור pEUI(+) באמצעות T4 DNA פולימראז ב רצף, מצדו-ללא תלות שכפול השיטה19. - Linearize את pEUI(+) עם EcoRI עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. מערבבים 50 ng/µL של לליניארית pEUI(+) עם 40 ng/µL מוגבר-PCR EGFP או ANKRD13A, ולא להגיב עם T4 DNA פולימראז (1 U) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לפני דגירה על קרח במשך 10 דקות להוסיף 10 µL של תערובת התגובה ישירות אל µL 100 של DH10B תאים המוסמכת לשינוי הבאים הניסוי.
הערה: למרות אנזים הגבלה במספר זיהוי אתרים נוספו של MCS של pEUI(+) (איור 1B), אנו ממליצים subcloning הגן היעד לאתר EcoRI, באמצעות מצדו תלויית-19,טכנולוגיה-שיבוט-20. - לאמת את תותב על ידי רצף, ואז לטהר את הדנ א באמצעות ערכת טיהור DNA מתאים תרביות תאים.
2. ארעי תרביות תאים וטיפול טב
- להכין ארבעה תאים תרבות מאכלים (קוטר 60 מ"מ) המכיל תאים HEK293 passaged טרי ב 5 מ הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) בתוספת 5-10% סרום שור עוברית (FBS) ואנטיביוטיקה (פניצילין U/mL 100, 100 סטרפטומיצין µg/mL). להלן, "תא תרבות בינונית" או פשוט "תרבות בינוני" מייצג את DMEM בתוספת FBS ואנטיביוטיקה. לשמור על התאים HEK293 ב 37 º C.
- Transfect µg 1 של ה-DNA מטוהרים לתוך התאים HEK293 בצפיפות של 50-60 אחוז שימוש µL 3 של ריאגנט תרביות תאים. להוסיף 200 µL של diluent (DMEM ללא FBS ואנטיביוטיקה) הכימית תרביות תאים המכילים את ה-DNA. לאחר הדגירה של תערובת התגובה למשך 30 דקות ב- RT, להוסיף את התערובת התאים HEK-293 על המנה תרבות. השתמש שתי מנות על תרביות תאים, ולהשאיר שני האחרים לא מטופל כפקדים.
- לאחר 12-24 h של תרביות תאים, להוסיף טב (סופי ריכוזים, 0.2 - 10 µmol) לאחד הדגימות transfected וכדי אחד מהפקדים שאינם transfected. יוצאים שני מדגמים אחרים מטופל כפקדי ניסיוני.
הערה: הפתרון מניות טב (50 מ"מ מומס דימתיל סולפוקסיד) יכול להיות מדולל תא תרבות בינוני, DMEM או באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב הריכוז המתאים לפני הוספת התאים בתרבית בהתאם לפרמטרים ניסיוני. עם זאת, בשל המסיסות נמוכה של טב ב תמיסה מימית, להימנע הכנת תערובת בסיס עם ריכוז גבוה של טב בינוני; במקום זאת, החלף המדיום התרבות התא מלא בינוני טריים המכילים טב-הריכוז הרצויה. - לטפח את התאים שטופלו טב ולא טופלו עבור h 12-48-37 מעלות צלזיוס.
- אם את EGFP באמצעות הוספת, לנתח את הביטוי EGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ( איור 2). אחרת, לקצור את התאים עבור וזמינותו immunoblotting.
- Immunoblotting וזמינותו, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח, ואז לגרד אותם החוצה באמצעות המגרד של התא.
- עבור לערום את התאים, ספין למטה יבולים צינור חרוטי 15 מ"ל ב g x 21,000 למשך 2 דקות ב 18-25 מעלות צלזיוס (RT).
- לאחר השמטת מגניב לגמרי, להוסיף 0.5 מ של ריאגנט החילוץ חלבון בתרבית של קרח (M-לכל), ביחד עם מעכב פרוטאז (5 µL של 100 x מעכב פרוטאז קוקטייל), בגדר אם התאים מתורבתים בקערה 60 מ מ.
- מחדש להשעות את התאים עם כמה סיבובים של pipetting ולאחר מכן דגירה התאים על תנאי למשך 15 דקות ב 18-25 מעלות צלזיוס (RT).
- לסובב את התא lysate ב 21,000 g x 10 דקות ב 4 º C.
- להעביר את תגובת שיקוע מימית לתוך צינור microcentrifuge mL 1.5 טריים.
- לנתח את תגובת שיקוע על-ידי immunoblotting, פרוטוקולים סטנדרטיים הבאים נוגדנים המתאימים.
3. הדור של שורות תאים HEK293 יציב עם אינטגרציה הגנומי של pEUI(+) מתג ג'ין
- Transfect µg 5-10 של pEUI(+) מטוהרים עם transgene לתוך תאים HEK293 confluent 50-60% בצלחת תרבות תא בקוטר 90 מ מ, באמצעות µL 15-30 מהתרכובת תרביות תאים. להוסיף 500 µL של diluent (DMEM ללא FBS ואנטיביוטיקה) הכימית תרביות תאים המכילים את ה-DNA. לאחר הדגירה של תערובת התגובה למשך 30 דקות ב- RT, להוסיף את התערובת לתאים HEK-293 על המנה תרבות.
- לאחר תרביות תאים, לאפשר את transfectants לגדול ולהביע את המוצרים ג'ין puromycin-התנגדות מתחת לבינוני תרבות לא בררניים (ללא puromycin) עבור h 24-48-37 מעלות צלזיוס.
- מביצועם תאים מן המנות תרבות על-ידי trypsinization. לאחר ביטול המדיום תרבות, לשטוף את transfectants עם PBS ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין/ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ולאחר תקופת דגירה של 1 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר שכבתה של טריפסין/EDTA על-ידי הוספת בינוני תרבות ומחוממת מראש (10 מ"ל, 37 מעלות צלזיוס), לקצור את התאים באמצעות המגרד של תא, ואחריו צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל ב g x 21,000 למשך 2 דקות ב 18-25 º C.
- מחדש להשעות את transfectants ב 50 מ של תרבות מראש ומחוממת בינוני (37 מעלות צלזיוס), העברת 10 מ"ל של התאים 90 מ מ תא טריים תרבות מנות. התרבות התאים ב 37 ° C עד 50-60% confluency לפני הטיפול puromycin (באופן כללי, זה לוקח כ 24-48 שעות).
- לטפח את transfectants ב 37 מעלות צלזיוס במדיום התרבות תאים בתוספת 3 puromycin µg/mL במשך 3-4 שבועות. במהלך תקופת הבחירה, לשנות את המדיום התרבות התא המכיל את puromycin (3 µg/mL) כל 2-3 ימים כדי לשמור על הלחץ הבחירה. כאשר התאים הופכים באופן מלא confluent, לפצל אותן הפרוצדורות הבאות ב שלבים 3.3-3.4, המכילות puromycin תרבות בינונית. למחוק את התאים הנותרים במדיום תרבות, אם אין צורך.
הערה: תנאי הבחירה Puromycin חייב להקים השפעול לסוגי תאים מסוים. היינו 3 µg/mL של puromycin תא תרבות בינוני; זה היה מספיק כדי לגרום מוות של תאים ב- transfected HEK293. - קציר תאים מן מושבות בודדות, באמצעות צילינדר שיבוט, ובצע הוראות היצרן.
- למחוק את המדיום התרבות תאים. יש לשטוף את הצלחת פעמיים עם ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) PBS כדי להסיר תאים צף.
- בעזרת מלקחיים סטרילי, להגדיר את הצילינדר שיבוט על המושבות בודדים.
- להוסיף 0.2 מ של 0.35% טריפסין/EDTA כל גליל.
- דגירה המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה עד התאים תלושים, ולאחר מכן להוסיף כמה טיפות ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) תרבות בינוני הצילינדרים.
- להעביר את התאים כל גליל בארות בודדים של צלחת 6-ובכן, עם 2 מ של תרבות בינוני, 1 µg/mL של puromycin כל היטב.
הערה: כאשר התאים הופכים confluent, קנה המידה של התרבות. עכשיו אפשר להקים clone(s).
- לשמור על שיבוטים בודדים במדיום התרבות תאים בתוספת 1 µg/mL של puromycin.
- אמת מושבות בודדות על-ידי בדיקת את רגישותם טיפול טב (הריכוז הסופי, 10 מיקרומטר) 24 ח' במבחן התגובה של השיבוטים כדי טב על-ידי ניתוח רמת הביטוי transgene עם immunoblotting. בחר שיבוט הרצוי (או שיבוטים). לטפח טב שטופלו ודגימת לא מטופל במדיום תרבות עבור h 12-48-37 מעלות צלזיוס לפני ניתוח הרמה אינדוקציה של transgene. ניתן למדוד את רמת הביטוי של transgene דרך immunoblotting, ביצוע הפרוצדורות בשלבים 2.5.1 - 2.5.7.
4. דלדול של טב
- להרוות את הגירויים טב על-ידי החלפת בינוני התרבות התא המכיל טב טב-חופשית בינוני.
הערה: מומלץ להחליף התקשורת צמיחה בלי הראשון reseeding את התאים על גבי צלחת תרבות חדשה. טב שיורית מופיע לדבוק המנה פלסטיק וירתקו ביטוי רקע חזק transgene. לפני reseeding את התאים על צלחת תרבות חדשה, יש לשטוף את התאים שנקטפו מספר פעמים עם תרבות בינוני או PBS.- מביצועם תאים מן המנות תרבות על-ידי trypsinization. לאחר השמטת את טב המכיל תרבות בינוני, לשטוף את התאים מגורה טב פעמיים עם PBS ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA ולאחר תקופת דגירה של 1 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר שכבתה של טריפסין/EDTA על-ידי הוספת ומחוממת מראש ללא טב תרבות בינוני (10 מ"ל, 37 מעלות צלזיוס), לקצור את התאים באמצעות המגרד של תא, ואחריו צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל ב g 21,000 x למשך 2 דקות ב 18-25 º C.
- מחדש להשעות את התאים ב- 50 מ של טרום ומחוממת טב ללא תרבות בינוני (37 מעלות צלזיוס), העברת מ של התאים לתוך שלוש מנות תרבות של תא טריים 60 מ מ. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24, 48, 72 שעות בהתאמה.
- לקצור את התאים בנקודות זמן שונות, למדוד את רמת הביטוי transgene באמצעות immunoblotting.
הערה: בתנאים אלה ניסויית, הביטוי transgene הפך בלתי מורגשת תרבות שלאחר כ 3 ימים של התאים במדיום נטול טב תרבותית (איור 3). ניתן למדוד את רמת הביטוי של transgene מאת immunoblotting, לפי שלבים 2.5.1 - 2.5.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבורר מבוססי GvEcR ג'ין יחיד מתואר באיור 1A. וקטור pEUI(+) היה אופטימיזציה עבור הביטוי transgene מוסדר על ידי הטיפול עם טב. האזור אפקטור של pEUI(+) מורכב 10xUAS E1b יזם מינימלי ואחריו MCS המכיל אתרי זיהוי אנזים ההגבלה EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ו- AflII. אות poly(A) SV40 נוספה מאחורי MCS (איור 1B). גן PAC הוכנס בין האזורים אפקטור ונהג של pEUI(+) להתייעץ התנגדות puromycin.
כדי להעריך את פעילותן ואת leakiness של pEUI(+), אנו subcloned EGFP לתוך האתר EcoRI של MCS (pEUI(+)-EGFP), transiently transfected הבונה פלסמיד לתאים HEK293, וערך טב בריכוזים שונים עבור 24 שעות ( איור 2). בעוד וקטור מדומה transfectants לא הראה פלורסנט אותות בין טיפול טב (איור 2 א, ב'), pEUI (+)-EGFP transfectants הפך בהדרגה על ידי כמות מוגברת טב (איור 2C–F ). חשוב מכך, pEUI (+)-EGFP transfectants ללא טיפול של טב לא זכה סימנים לזיהוי EGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2C).
כדי לתת תוקף נוסף התגובה של pEUI(+) כדי טב, אנחנו subcloned גן דגל מתויג epitope ANKRD13A לתוך האתר EcoRI של pEUI(+), הועבר הבונה לתוך תאים HEK293, ועינו ואז לבחירה puromycin למשך 3 שבועות להקים קו התא הרצוי עם transgene ANKRD13A . ניתחנו את הביטוי של transgene ANKRD13A לאחר טיפול 24 שעות עם טב ו קו תא הוקמה הגיבו היטב (איור 3). עוד יותר להדגים את הפיכות הבורר גנים pEUI(+) מאת depleting טב מהתקשורת תרבותית. כפי שמוצג באיור3, ביטוי ANKRD13A לא היו יותר לזיהוי כאשר אנחנו תרבותי התאים בתקשורת ללא טב.
איור 1 . תרשים סכמטי של pEUI(+). (א) מפת וקטור pEUI(+) נבנה. מקדם CMV כוננים ביטוי המכונן של GvEcR. GvEcR טב מכורך translocate לתוך הגרעין ותקשור את 10xUAS ציס-מתנהג רצפים רגולטוריות לעורר הבעת transgene מוכנס לתוך MCS. מידע (ב') הרצף בין הסוגריים המרובעים ב (א) מכיל את רצפי אפקטור שלמה של pEUI(+). החצים מייצגים האתרים זיהוי אנזים הגבלה בודדים הכלולים של MCS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . מתג מבוססי GvEcR ג'ין יחיד מגיב לטיפול טב. HEK293 התאים היו transfected עם ה-DNA שצוין בונה. לאחר 24 שעות של תרביות תאים, התאים היו מגורה במשך 24 שעות ביממה עם טב-ריכוז המצוין. פעילות transgene EGFP נצפתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Transfectants מדומה עם pEUI(+) לא הראה שום קרינה פלואורסצנטית לזיהוי עם (A) (B) טב טיפול או בלעדיו. (C–E) עוצמת פלורסנט ב- pEUI (+)-EGFP-תאים transfected מגביר באופן תלוי מינון טב. סולם בר, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . HEK293 תאים stably מחסה pEUI (+) / דגל-ANKRD13A הפיכה להגיב הממשל של טב. דגל מתויג epitope ANKRD13A ביטוי נגרמה ע י טיפול טב (1.5 מיקרומטר). לאחר 24 שעות של טיפול עם טב, התאים הוחלפו למדיה הנשירה טב לסכום המצוין של הזמן. הכמות היחסית של ANKRD13A נמדדה על ידי סופג המערבי עם נוגדן אנטי-דגל. רמת ביטוי אנדוגני של α-טובולין נמדדה עם נוגדן anti-α-טובולין כפקד. הכוכבית לבן מציין זן cross-reactive לא מזוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
החיסרון העיקרי של שימוש בבורר ביטוי גנים בינארי הוא הצורך להעביר בו זמנית בשני פלסמידים נפרד (מנהל ההתקן ואת אפקטור) לתוך תא היעד. זה יכול להוביל שוויונית של פלסמידים ולהוביל והתגובה לא עקבי של המתג inducers1,2,3. חסרון נוסף של מערכת דו-וקטור הוא מינימום של שני סיבובים של הבחירה אנטיביוטי נדרשים לזהות מבטיח שורות תאים. לכן, קלטת ג'ין-inducible הכוללת יחידה אחת יש דומה לשימוש במחקר הביולוגי. הבורר ביטוי יחיד transgene pEUI(+) הכלול וקטור יחידה מצויד עם כל היחידות הרגולטוריות נדרש לגירוי transgene. לכן, רמת אינדוקציה של transgene, subcloned, pEUI(+), הוא תלוי כמות ה-DNA transfected ניסוי ארעי תרביות תאים, המינון של משרן כימי. בנוסף, בהמשך בדקנו את השימוש של וקטור pEUI(+) על ידי יצירת קו יציב תא המכיל עותק יחיד של transgene ANKRD13A 15. שורת התאים הוקמה הראו רגישות גבוהה לטיפול טב (איור 3). באופן קולקטיבי שלה רגישות גבוהה, הפיכות, leakiness נמוכה15, יחד עם וריאציה מוגבל ברמת הביטוי הופכים pEUI(+) כלי רב ערך מולקולרית, תאית מניפולציות היעד גנים.
בין המערכות השונות inducible ג'ין, בחרנו את הקלטת אינדוקציה של גנים תלויי-GvEcR. GvEcR יש כמה יתרונות על פני מערכות אחרות: ראשית, הטבע lipophilic של מספר תחליפי ecdysone משמש inducers כימי (כולל טב) יש יתרון לחדירה יעיל של ממברנות הסלולר21; שנית, ישנם אין orthologs EcR גולגולת, כך ecdysteroid אגוניסטים משפיעה לבטא את הפונקציה של endogenously רצפטורים גרעיניים21,22; שלישית, ecdysteroids הם לא מזיק גולגולת ואי במהירות מ זרימת הדם במערכת ויוו21,23; רביעית, מאז אגוניסטים ecdysone רבים פותחו עד כה, על-ידי בחירת מולקולות קטנות בגודל בצורה אופטימלית, חוקרים יכול למנוע סיבוכים בלתי רצויות13,22,24. למרות pEUI(+) מראה רגישות גבוהה כדי טב, בוחן את יכולת התגובה של pEUI(+) כדי אגוניסטים ecdysteroid אחרים שעשויים להועיל. קיומו של אגוניסטים EcR לא סטרואידיות, כגון methoxyfenozide, כי הם יותר מסיס במים מאשר טב24 עשוי להרחיב את היקף יישומים של pEUI(+). למרות הביטוי של transgene ב pEUI(+) הוא יחסית חלש יותר מאשר ב- ט-ב מערכת15, הרמה של אינדוקציה transgene יכול להיות מרובדת על ידי הוספת עותק מרובה של התחום transactivation VP16 (נתונים לא מוצג). יישומים טיפול גנטי האחרונות התמקדו בטוח המסירה של גן המטרה לתוך תאים או רקמות חסרי המוצר בהתאמה גן פונקציונלי בשל מחלה גנטית25,26,27. עם זאת, שאינו מוסדר transgene תחת השליטה של היזמים מכוננת רקמות ספציפיות או ויראלי יכול להפיק hyper-ביטוי של הגן היעד, אשר מעלה את האפשרות של רקמות מקומיות-נזק-28,-29. לפיכך, היישום של מתג ג'ין אמין עבור ריפוי גנטי יכול למנוע סיבוכים בלתי רצויים. וקטור pEUI(+) מספק כלי נוח ורב עוצמה כדי לשלוט transgene ביטוי במחקרים ביולוגית וקלינית. כיום, אנו מפתחים וקטור lentiviral ייחודי המבוסס על GvEcR כדי להגדיל את טווח היישום של המערכת שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו שאין ניגודי אינטרסים הקשורים בדו ח זה.
Acknowledgments
המחברים מודים S-Y צ'וי (האוניברסיטה הלאומית Chonnam) על קריאה יסודית של כתב היד והערות יקרי ערך. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של האוניברסיטה הלאומית Chungnam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. , InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
