Summary
Här presenterar vi ett protokoll för moduleringen av transgenens uttryck pEUI(+) singular gen växeln av tebufenozide behandling.
Abstract
Exakt kontroll av transgenens uttryck är önskvärt i biologiska och kliniska studier. Eftersom funktionen binära av för närvarande anställd gen växlar kräver överföring av två terapeutiska uttryck enheter samtidigt till en enda cell, begränsas emellertid den praktiska tillämpningen av systemet för genterapi. För att förenkla systemet transgenens uttryck, genererade vi en gen switch betecknas som pEUI(+) omfattar en komplett uppsättning av transgenens uttryck moduler i en enda vektor. Bestående av GAL4 DNA-bindande domänen och modifierade REG (GvEcR), en minimal VP16 aktiveringen domän smält med en GAL4 DNA-bindande domän, samt en modifierad Drosophila ecdysone receptor (EcR), växeln nyutvecklade singular genen är mycket lyhörd för administrationen av en kemisk inducerare på ett sätt som tid - och dos-beroende. PEUI(+) vektorn är ett potentiellt kraftfulla verktyg för att förbättra kontrollen av transgenens uttryck i både biologisk forskning och kliniska studier. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för modulering av ett övergående och stabil transgenens uttryck med pEUI(+) vector genom behandling av tebufenozide (Teb). Dessutom delar vi viktiga riktlinjer för användningen av Teb som en kemisk inducerare.
Introduction
Flera olika gen växlar har undersökts för sin förmåga att just reglera transgenens uttryck i cellkultur och djurmodeller, med varierande framgång1,2,3. Potentiella gen switch system bör uppfylla flera stränga kriterier, inklusive: exakt riktad uttryck av transgenens, dos - och tidsberoende lyhördhet för inducerare, försumbar leakiness av arrangören, reversibilitet av transgen aktivering genom inducerare borttagning, och inducerare toxicitet nivåer tolerabla cellinjer och laboratorium djur1,2,3. Flera små molekyler inducerare har utnyttjats, inklusive tetracyklin4,5, rapamycin6,7,8, mifepriston9,10, och ecdysone11,12,13,14. I allmänhet dessa system kräver minst två plasmider som innehåller två eller tre enheter som diskret uttryck, en eller två som komponera ett föreskrivande element (inducerare plasmid) som binder en liten molekyl inducerare att få transkriptionell aktivitet; och en annan plasmid (effektor plasmid) som innehåller transgenens under kontroll av en regulatoriska DNA-region som tillåter åtkomst av elementet inducerare-bunden tillsyn. Den största nackdelen med det binära systemet är att det kräver samtidig införandet av två vektorer (inducerare och effektor) i målcellen. I övergående transgenens uttryck experiment producerar den samtidiga transfection av två plasmider oundvikligen en population av celler som ensamma transfekterade med antingen induceraren eller effektor eller samtidig transfekterade ojämnt. Det binära systemet kräver dessutom minst två rundor av antibiotika urval att upprätta stabila cellinjer, vilket är tidskrävande och mödosam. Alltså att kombinera alla komponenter krävs för transgenens uttryck och förordning i en enda vektor skulle vara perfekt att garantera samtidig uttryck för alla element som krävs i en enda cell och möjliggöra reglering av transgenens uttryck genom behandling med liten molekyl inducerare.
För att övervinna bristerna i binärt gen växlar, utvecklade vi nyligen en singular gen switch, med en Drosophila melanogaster REG-baserade gen inducerbara system15. Ecdysone förmedlar genuttryck när det binder till den REG/ultraspiracle (USP) heterodimer, som i sin tur inducerar bindande REG till DNA reglerande element3,11. Ryggradsdjur retinoid X receptorn (RXR), en ortholog av insekt USP, rekryterar REG för att bilda en aktiv transkriptionell aktivator16. Således av riktade uttryck för en transgen i ryggradsdjur celler eller vävnad, REG och RXR skall vara co uttryckt samtidigt innan stimuleras av ecdysone eller dess agonister. Eftersom funktionen heterodimeriskt av växeln REG-baserade genen kan påverkas av den endogena RXR nivå, Padidam et al. ersatte de REG DNA-bindning och aktivering domänerna med heterologt GAL4 DNA-bindande, herpes simplex virus protein vmw65 (VP16) aktiveringen domäner smält till REG ligand-bindande domänen, som sedan blev okänslig för endogena RXR och bildade en homodimer att få transkriptionell aktivitet17. Växeln REG-baserade gen förbättrades ytterligare genom att konstruera en chimär protein består av minimal VP16 aktiveringen domän kombinerat med GvEcR, som bildade en homodimer och lokaliserade i cytosolen i avsaknad av den ecdysone agonist, Teb16, 18. Genom bindning till Teb, GvEcR ändrade dess subcellulär lokalisering från cytosolen till kärnan att känna igen en hybrid promotor består av zebrafisk E1b minimal arrangören kombinerat med en tio tandem upprepade uppströms aktiveringen sekvenser (högskolor) att inleda det transkription av genen mål16.
För att förenkla den tidigare rapporterade REG-baserade genen växlar16,18, vi kombinerat binära funktioner i systemet i en enda vektor utrustad med alla element som krävs för stimulerande transgenens uttryck, och sedan designerat den nyligen genererade vektorn, pEUI(+) (GenBank anslutningen nummer: KP123436, figur 1A)15. De effektor som svarar på den GvEcR drivrutinen (nedan) består av tio tandem UAS upprepar bredvid en E1b minimal arrangören följt av en flera kloning site (MCS) med mina, PmlI, NheI, BmtI, AfeI och AflII erkännande sekvenser (figur 1B). Dessutom att underlätta urvalet av transfekterade celler, en SV40 arrangören-driven puromycin N-acetyl-transferas (PAC) genen placerades mellan regionerna driver och effektor att upprätthålla stabil cellinjer (figur 1).
Vi beskriver ett detaljerat protokoll för övergående och stabil moduleringen av transgenens uttryck med pEUI(+). Dessutom, tillhandahåller vi detaljerade instruktioner för en framgångsrik användning av Teb som ecdysone agonist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transgenens subkloning
- Välj en lämplig restriktionsenzym erkännande webbplats (eller webbplatser) i MCS av pEUI(+) och subclone genen sevärdheter i önskad riktning (figur 1).
Obs: Den andra eller flagga epitop-taggade ankyrin upprepa domän 13A (ANKRD13A) transgenens var subcloned i mina webbplats pEUI(+) vektorns med T4 DNA polymeras i en sekvens - och ligation-oberoende kloning metod19. - Linjär pEUI(+) med mina för 1 h vid 37 ° C. Blanda 50 ng/µL av linearized pEUI(+) med 40 ng/µL av PCR-förstärkta andra eller ANKRD13A, och reagera med T4 DNA-polymeras (1 U) för 1 min i rumstemperatur (RT) före inkubering på is för 10 min. Tillsätt 10 µL av reaktionsblandningen direkt till 100 µL DH10B behöriga celler för efter omformningen experimentera.
Obs: Även om flera restriktionsenzym erkännande platser lades till MCS av pEUI(+) (figur 1B), rekommenderar vi subkloning målgenen in mina webbplatsen, med ligering-oberoende kloning teknik19,20. - Verifiera skäret genom sekvensering och sedan rena DNA med ett kit av DNA-rening som är lämplig för transfection.
2. övergående Transfection och Teb behandling
- Förbereda fyra cell kultur rätter (60 mm diameter) som innehåller färska överförda HEK293 celler i 5 mL Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) kompletteras med 5-10% fetalt bovint serum (FBS) och antibiotika (100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin). Härefter representerar ”cellodlingsmedium” eller helt enkelt ”odlingsmedium” den DMEM kompletteras med FBS och antibiotika. Upprätthålla HEK293 cellerna vid 37 ° C.
- Transfect 1 µg av renade DNA in i de HEK293 cellerna på 50-60% densitet med 3 µL transfection reagens. Lägga till transfection reagenset i 200 µL spädningsvätska (DMEM utan FBS och antibiotika) som innehåller DNA. Efter inkubering av reaktionsblandningen för 30 min vid RT, tillsätt blandningen till HEK-293 celler i kultur skålen. Använd två rätter för transfection och lämna de andra två obehandlade som kontroller.
- Efter 12-24 h av transfection, lägga till Teb (slutliga koncentrationer, 0,2 - 10 µmol) till en av de transfekterade proverna och till en av de icke-transfekterade kontrollerna. Lämna de andra två prover som obehandlade som experimentella kontroller.
Obs: Teb stamlösning (50 mM upplöst i dimetyl sulfoxid) kan spädas i cellodlingsmedium, DMEM eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på en lämplig koncentration innan du lägger till de odlade cellerna beroende på de experimentella parametrarna. Men på grund av den låga lösligheten av Teb i vattenlösning, undvika förbereder en master mix med en hög koncentration av Teb i medium; i stället ersätta den komplett cellodlingsmedium med färska medium innehållande Teb på önskad koncentration. - Odla Teb-behandlade och obehandlade cellerna för 12-48 timmar vid 37 ° C.
- Om sätt med den andra , analysera andra uttryck i fluorescerande Mikroskop ( figur 2). Annars skörda cellerna för ett immunoblotting test.
- För immunoblotting analysen, skölj cellerna två gånger med iskall PBS och sedan skrapa dem ut med en cell skrapa.
- För pålning cellerna, snurra ner skördarna i en 15 mL koniska rör vid 21 000 x g under 2 minuter vid 18-25 ° C (RT).
- Efter kasta PBS helt, tillsätt 0,5 mL iskallt däggdjursprotein utvinning reagens (M-PER), tillsammans med proteashämmare (5 µL av 100 x proteashämmare cocktail), att pelleten om cellerna odlas i en 60 mm maträtt.
- Slamma upp cellerna med flera omgångar av pipettering, och sedan Inkubera suspenderade celler under 15 minuter vid 18-25 ° C (RT).
- Snurra cellen lysate vid 21 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Överföra aqueous supernatanten till en fräsch 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Analysera supernatanten genom immunoblotting, följande standardprotokoll med lämpliga antikroppar.
3. generation av stabila HEK293 cellinjer med genomiska integrationen av pEUI(+) genen Switch
- Transfect 5-10 µg av den renade pEUI(+) med transgenens i HEK293 celler som är 50-60% konfluenta i en 90 mm diameter cell kultur maträtt, med 15-30 µL av transfection reagens. Lägga till transfection reagenset i 500 µL spädningsvätska (DMEM utan FBS och antibiotika) som innehåller DNA. Efter inkubering av reaktionsblandningen för 30 min vid RT, tillsätt blandningen till HEK-293 celler i kultur skålen.
- Efter transfection, Tillåt transfectants att växa och uttrycka de puromycin-motstånd gen produkterna under icke-selektivt odlingsmedium (utan puromycin) för 24-48 timmar vid 37 ° C.
- Separera celler från kultur rätterna av trypsinization. Efter kasta odlingsmediet, skölj transfectants med pre värmde PBS (37 ° C), tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin/etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och inkubera i 1 min vid 37 ° C. Efter kylning i trypsin/EDTA genom att lägga till pre värmde odlingsmedium (10 mL, 37 ° C), skörda de celler som använder en cell skrapa, följt av centrifugering i en 15 mL koniska rör vid 21 000 x g under 2 minuter vid 18-25 ° C.
- Återsuspendering transfectants i 50 mL före värmde odlingsmedium (37 ° C) och överför 10 mL av cellerna i 90 mm frisk cell kultur rätter. Odla cellerna vid 37 ° C fram till 50-60% konfluens innan puromycin behandling (i allmänhet, detta tar ca 24-48 h).
- Odla i transfectants vid 37 ° C i cellodlingsmedium kompletteras med 3 µg/mL puromycin för 3-4 veckor. Under urvalsperioden, ändra den cellodlingsmedium som innehåller puromycin (3 µg/mL) varje 2-3 dagar för att upprätthålla selektionstryck. När cellerna blir fullt konfluenta, dela dem efter procedurerna i steg 3.3-3.4, med puromycin-innehållande odlingsmedium. Kassera återstående cellerna i odlingsmediet, om inte behövs.
Obs: Puromycin urval villkor måste fastställas experimentellt för specifika celltyper. Vi använde 3 µg/mL puromycin i cellodlingsmedium; Detta räckte för att inducera celldöd i icke-transfekterade HEK293. - Skörda cellerna från enskilda kolonier, använder en kloning cylinder, och följ tillverkarens anvisningar.
- Kassera cellodlingsmedium. Skölj plattan två gånger med pre värmde (37 ° C) PBS ta bort flytande celler.
- Med steril pincett, ställa kloning cylindern över enskilda kolonierna.
- Tillsätt 0,2 mL 0,35% trypsin/EDTA till varje cylinder.
- Inkubera skålen vid 37 ° C i 1 min tills cellerna är fristående, och sedan lägga till några droppar före värmde (37 ° C) odlingsmedium i cylindrarna.
- Överföra cellerna från varje cylinder till enskilda brunnar i en 6-well platta, med 2 mL odlingsmedium och 1 µg/mL puromycin i varje brunn.
Obs: När cellerna blir konfluenta, skala upp kulturen. Nu kan clone(s) fastställas.
- Bibehålla enskilda kloner i cellodlingsmedium kompletteras med 1 µg/mL puromycin.
- Validera enskilda kolonier genom att testa deras känslighet för Teb behandling (slutlig koncentration, 10 µM) för 24 h. Test klonerna att Teb lyhördhet genom att analysera vilka uttryck transgenens med immunoblotting. Välj en önskad klon (eller kloner). Odla en Teb-behandlade och ett obehandlat prov i odlingsmedium för 12-48 timmar vid 37 ° C innan analysera induktion nivån på transgenens. Nivån på transgenens uttryck kan mätas genom immunoblotting, följa instruktionerna i steg 2.5.1 - 2.5.7.
4. utarmning av Teb
- Släcka de Teb stimuli genom att ersätta Teb innehållande cellodlingsmedium med Teb-fri medium.
Obs: Det rekommenderas att ersätta tillväxt medier utan första omläggning cellerna på en ny maträtt som kultur. Kvarstående Teb verkar cling till plast skålen och kommer framkalla en stark bakgrund uttryck för transgenens. Innan omläggning cellerna på en ny kultur-tallrik, skölj skördade cellerna flera gånger med antingen odlingsmedium eller PBS.- Separera celler från kultur rätterna av trypsinization. Efter att kasta den Teb innehållande odlingsmedium, skölj Teb-stimuleras cellerna två gånger med pre värmde PBS (37 ° C), tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin/EDTA och inkubera i 1 min vid 37 ° C. Efter kylning i trypsin/EDTA genom att lägga till pre värmde Teb-fri odlingsmedium (10 mL, 37 ° C), skörda de celler som använder en cell skrapa, följt av centrifugering i en 15 mL koniska rör vid 21 000 x g under 2 minuter vid 18-25 ° C.
- Slamma upp cellerna i 50 mL före värmde Teb-fri odlingsmedium (37 ° C), och överföring 5 mL av cellerna i tre 60 mm frisk cell kultur rätter. Odla cellerna vid 37 ° C för 24, 48 och 72 h respektive.
- Skörda cellerna vid olika tidpunkter och mäta transgenens uttryck med hjälp av immunoblotting.
Obs: Under dessa försöksbetingelser, transgenens uttryck blev omätbara cirka 3 dagar efter kultur av cellerna i det Teb-fria kulturella mediet (figur 3). Nivån på transgenens uttryck kan mätas genom immunoblotting, enligt steg 2.5.1 - 2.5.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GvEcR-baserade singular gen växeln avbildas i figur 1A. PEUI(+) vector var optimerad för reglerade transgenens uttryck genom behandling med Teb. Effector regionen av pEUI(+) består av en 10xUAS och en E1b minimal arrangören följt av en MCS-server som innehåller mina, PmlI, NheI, BmtI, AfeI och AflII restriktionsenzym erkännande platser. En SV40 poly(A) signal lades bakom MCS (figur 1B). En PAC -gen sattes in mellan föraren och effektor regionerna i pEUI(+) att ge motstånd mot puromycin.
För att utvärdera verksamheten och leakiness av pEUI(+), subcloned vi andra ut mina platsen för MCS (pEUI(+)-EGFP), övergående transfekterade den plasmid bygga i HEK293 celler och administreras Teb vid olika koncentrationer för 24 h ( ) (Se figur 2). Medan mock vektor transfectants inte visade fluorescerande signaler oavsett Teb behandling (figur 2A, B), pEUI (+)-andra transfectants blev gradvis medveten om den ökade mängden Teb (figur 2 c–F ). Viktigare, pEUI (+)-andra transfectants utan behandling av Teb gav inte upphov till några påvisbara andra signaler i fluorescerande Mikroskop (figur 2 c).
Ytterligare validera lyhördheten för pEUI(+) till Teb, vi subcloned en flagga epitop-taggade ANKRD13A gen ut mina platsen för pEUI(+), överförs konstruktionen i HEK293 celler och sedan genomgå dem puromycin urval i 3 veckor för att upprätta en önskad cell fodrar med det ANKRD13A transgenens. Vi analyserade de ANKRD13A transgenens uttryck efter en 24 h behandling med Teb och den etablerade cellinje svarade väl (figur 3). Vi visat ytterligare reversibiliteten av växeln pEUI(+) gen av ozonnedbrytande Teb från kulturella media. I figur 3visas ANKRD13A uttryck var inte längre detekterbar när vi odlade celler i Teb-fria medier.
Figur 1 . Schematisk bild av pEUI(+). (A), vektor karta över pEUI(+) konstruerades. En CMV promotor driver konstitutiva uttryck för GvEcR. Den Teb-bundna GvEcR kommer translocate in i cellkärnan och binda 10xUAS cis-agerar reglerande sekvenser för att stimulera uttryck för den transgenens infogas i MCS. (B), sekvensen information mellan hakparenteserna (a) innehåller den hela effektor sekvenser av pEUI(+). Pilarna representerar de enskilda restriktionsenzym erkännande webbplatser ingår i MCS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . GvEcR-baserade singular gen switch svarar på behandling av Teb. HEK293 celler var transfekterade med angivna DNA konstruerar. Efter 24 h av transfection stimuleras cellerna för 24 h med Teb vid den avlästa koncentrationen. Andra transgenens aktivitet observerades i fluorescerande Mikroskop. Håna transfectants med pEUI(+) visade inte några påvisbara fluorescens med (A) eller utan (B) Teb behandling. (C–E) Fluorescerande intensiteten i pEUI (+)-andra-transfekterade celler ökar på ett sätt som Teb dos-beroende. Skala bar, 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 . HEK293 celler stabilt hysande pEUI (+) / flagga-ANKRD13A svarar reversibelt till administrationen av Teb. FLAGGA epitop-taggade ANKRD13A uttryck utlöstes av Teb (1,5 µM) behandling. Efter 24 h behandling med Teb, var cellerna bytte till Teb avhopp media för den angivna mängden tid. Den relativa mängden ANKRD13A mättes av Western blotting med anti-Flag antikropp. Den endogena uttryck nivån av α-tubulin mättes med anti-α-tubulin antikropp som kontroll. Vita asterisken indikerar en oidentifierad korsa-reactive art. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den största nackdelen med binära gen uttryck växel är behovet att samtidigt leverera två separata plasmider (föraren och effektor) i målcellen. Detta kan leda till en ojämlik fördelning av plasmider och leda till en inkonsekvent svar av växeln till inducerare1,2,3. En annan brist i två-vector-systemet är att minst två rundor av antibiotika urval krävs att identifiera lovande cellinjer. En gen-inducerbara kassett som består av en enhet har därför länge sökts för användning inom biologisk forskning. PEUI(+) singular transgenens uttryck växeln finns i en enda vektor utrustad med alla rättsliga enheter som krävs för transgenens stimulering. Således, induktion av transgenens, subcloned i pEUI(+), är beroende av mängden DNA transfekterade i övergående transfection experiment och dosering av den kemiska induceraren. Dessutom testade vi ytterligare användningen av pEUI(+) vektor genom att generera en stabil cellinje som innehåller en enda kopia av ANKRD13A transgenens15. Den etablerade cellinje visade hög känslighet för Teb behandling (figur 3). Kollektivt gör dess hög känslighet, reversibilitet och låg leakiness15, tillsammans med begränsad variation i uttrycket nivå pEUI(+) ett värdefullt molekylära och cellulära verktyg för att manipulera mål genuttryck.
Bland olika inducerbara gen systems valt vi GvEcR-beroende gen induktion kassett. GvEcR har flera fördelar jämfört med andra system: första lipofila beskaffenhet flera ecdysone analoger används som kemiska-inducerare (inklusive Teb) är fördelaktigt för effektiv penetration av cellulära membran21; andra, det finns inga REG orthologs hos ryggradsdjur, så ecdysteroid agonister inte påverkar funktionen av uttryckt endogent kärnreceptorer21,22. det tredje är ecdysteroid ofarlig i ryggradsdjur och snabbt rensas från cirkulation system i vivo21,23; och för det fjärde, eftersom många ecdysone agonister har utvecklats hittills, genom att välja optimalt medelstora små molekyler, forskare kan undvika oönskade komplikationer13,22,24. Även pEUI(+) visar hög känslighet till Teb, kan testning lyhördheten för pEUI(+) till andra ecdysteroid agonister vara värdefulla. Förekomsten av icke-steroida REG-agonister, såsom metoxifenozid, som är mer löslig i vatten än Teb24 kan utvidga tillämpningsområdet för tillämpningar av pEUI(+). Men uttrycket av transgenens i pEUI(+) är relativt svagare än i en Tet-On system15, kunde nivån på transgenens induktion vara förstärkt genom tillsats av en flera exemplar av domänen VP16 transkription (inga data anges). Senaste gen terapi program har fokuserat på säker distribution av en målgenen i celler eller vävnader som saknar respektive funktionella genen produkten på grund av genetisk sjukdom25,26,27. Icke-reglerade transgenens under kontroll av vävnadsspecifika eller viral konstituerande initiativtagare kan dock framkalla hyper-uttryck av målgenen, vilket höjer risken för lokala vävnad skada28,29. Tillämpningen av en tillförlitlig gen switch för genterapi kunde således undvika oönskade komplikationer. PEUI(+) vektorn ger ett bekvämt och kraftfullt verktyg för att styra transgenens uttryck i biologiska och kliniska studier. För närvarande utvecklar vi en singular lentiviral vektor utifrån GvEcR att öka användningsområdet av vårt system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga intressekonflikter som relaterade till detta betänkande.
Acknowledgments
Författarna vill tacka S-Y Choi (Chonnam National University) för värdefulla kommentarer och grundlig läsning av våra manuskript. Detta arbete stöds av en forskningsfond för 남도 National University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. , InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
