Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação da expressão do transgene usando pEUI(+) singular gene interruptor por tebufenozide tratamento.
Abstract
Controle preciso da expressão do transgene é desejável em estudos clínicos e biológicos. No entanto, porque o recurso binário de interruptores de gene empregado atualmente requer a transferência de duas unidades de expressão terapêutica simultaneamente em uma única célula, a aplicação prática do sistema de terapia genética é limitada. Para simplificar o sistema de expressão do transgene, geramos um interruptor de gene designado como pEUI(+), englobando um conjunto completo de módulos de expressão do transgene em um único vetor. Compreendendo o domínio GAL4 DNA-ligando e col modificado (GvEcR), um mínimo domínio de ativação VP16 fundido com um domínio de ligação a GAL4 DNA, bem como um receptor de isoinokosterone de Drosophila modificado (EcR), o interruptor do recém-desenvolvido gene singular é altamente responsivos à administração de um indutor químico de maneira tempo e dose-dependente. O vetor de pEUI(+) é uma ferramenta potencialmente poderosa para melhorar o controle da expressão do transgene em pesquisas biológicas e estudos pré-clínicos. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a modulação de uma expressão do transgene transitória e estável usando vetor de pEUI(+) pelo tratamento de tebufenozide (Teb). Além disso, partilhamos diretrizes importantes para o uso de Teb como um indutor químico.
Introduction
Vários genes diferentes switches tem sido explorados por sua capacidade de regular precisamente a expressão do transgene em cultura de células e modelos animais, com diferentes graus de sucesso1,2,3. Sistemas de interruptor de gene potencial devem conhecer vários critérios rigorosos, incluindo: precisão direcional expressão do transgene, capacidade de resposta de dosagem e tempo-dependente para indutores, leakiness insignificante do promotor, reversibilidade do transgene ativação através da remoção de indutor e níveis de toxicidade do indutor toleráveis para linhas celulares e animais de laboratório a1,2,3. Indutores de várias pequenas moléculas têm sido explorados, incluindo tetraciclina4,5, rapamicina6,7,8, mifepristone9,10, e isoinokosterone11,12,13,14. Em geral, estes sistemas exigem pelo menos dois plasmídeos contendo duas ou três unidades discretas de expressão, um ou dois dos quais compõem um elemento regulatório (plasmídeo indutor) que vincula um indutor de pequenas moléculas para obter atividade transcricional; e outro plasmídeo (plasmídeo efetoras) contendo o transgene sob o controle de uma região de DNA reguladora que permite o acesso do elemento indutor-limite regulamentar. A principal desvantagem do sistema binário é que ele requer a introdução concomitante dos dois vetores (indutor e efetoras) na célula alvo. Em experimentos de expressão do transgene transitória, o transfection simultâneo de dois plasmídeos inevitavelmente produz uma população de células que isoladamente é transfectadas com o indutor ou o efetor, ou co transfectadas desigualmente. Além disso, o sistema binário requer pelo menos duas rodadas de seleção antibiótica para estabelecer linhas de célula estável, que é demorado e trabalhoso. Assim, combinar todos os componentes necessários para a expressão do transgene e regulamento em um único vetor seria o ideal para garantir a expressão concomitante de todos os elementos necessários em uma única célula e permitir a regulação da expressão do transgene através do tratamento com indutores de pequenas moléculas.
Para superar as deficiências do gene binário switches, recentemente desenvolvemos um interruptor de gene singular, usando uma Drosophila melanogaster gene Col-baseado sistema inducible15. Isoinokosterone Medeia a expressão genética quando se liga ao heterodímero Col/ultraspiracle (USP), que por sua vez induz a vinculação da colectânea de DNA dos elementos reguladores3,11. O receptor de vertebrados retinoide X (RXR), um ortholog de insecto USP, recrutas EcR para formar um ativador transcricional ativo16. Assim, a expressão orientada de um transgene em células de vertebrados ou tecido, o EcR e RXR devem ser co expressa simultaneamente antes de ser estimulado por isoinokosterone ou seus agonistas. Desde que o recurso heterodimérica dSwitch gene Col-baseado pode ser influenciado pela endógena RXR nível, Padidam et al. substituídos os domínios DNA EcR-vinculação e ativação com ligação de GAL4 DNA heteróloga, herpes simplex vírus proteína vmw65 domínios de ativação (VP16) fundiram-se ao domínio de ligação ligante EcR, que depois tornou-se insensível ao RXR endógena e formou um homodímero para ganhar a atividade transcricional17. O interruptor de gene Col-baseado foi melhorado através da construção de uma proteína quimérico composta por domínio de ativação VP16 mínimo combinado com GvEcR, que formou um homodímero e localizadas no citosol na ausência do agonista isoinokosterone, Teb16, 18. Por ligação a Teb, o GvEcR mudou sua localização subcellular do citosol para o núcleo de reconhecer um promotor híbrido composto de zebrafish E1b promotor mínimo combinado com um conjunto de dez repetidas sequências de ativação upstream (UASs) para iniciar o transcrição do gene alvo16.
Para simplificar o gene Col-baseado anteriormente relatado muda16,18, nós combinamos os recursos binários do sistema em um único vetor equipado com todos os elementos necessários para estimular expressão do transgene e então designado o vetor recém-gerado, pEUI(+) (número de adesão GenBank: KP123436, figura 1A)15. O efetor respondendo para o driver de GvEcR (doravante driver) consiste em dez em tandem UAS repete ao lado de um promotor de E1b mínimo seguido de um local de clonagem múltipla (MCS) com EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII sequências de reconhecimento (figura 1B). Além disso facilitar a seleção de transfectadas cells, uma puromicina orientada por promotor de SV40 N-acetil-gene transferase (PAC) foi colocada entre as regiões de driver e efetoras para manter a linha celular estável (Figura 1).
Descreveremos um protocolo detalhado para a modulação transitória e estável da expressão do transgene usando pEUI(+). Além disso, nós fornecemos instruções detalhadas para o uso bem sucedido de Teb como um agonista isoinokosterone.
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Protocol
1. o Transgene Subcloning
- Escolha um local de reconhecimento de enzima de restrição apropriada (ou sites) em MCS de pEUI(+) e subclone o gene de interesse na direção desejada (Figura 1).
Nota: O ankyrin epítopo-tag EGFP ou bandeira repete domínio 13A (ANKRD13A) transgene foi subcloned no sítio de EcoRI do vetor pEUI(+) usando T4 DNA polimerase em uma sequência e ligadura-independente de clonagem método19. - Linearizar o pEUI(+) com EcoRI durante 1 h a 37 ° C. Mix 50 ng / µ l de linearizada pEUI(+) com 40 ng / µ l de PCR amplificados EGFP ou ANKRD13A e reagir com T4 DNA polimerase (1 U) por 1 min à temperatura ambiente (RT) antes de incubação no gelo durante 10 min. adicionar 10 µ l da mistura diretamente a 100 µ l de reação DH10B células competentes para a transformação seguinte experimentam.
Nota: Embora vários sites de reconhecimento da enzima de restrição foram adicionados para o MCS do pEUI(+) (figura 1B), recomendamos subcloning gene do alvo para o site da EcoRI, independente da ligadura clonagem tecnologia19,20. - Verificar a inserção de sequenciação e depois purificar o DNA usando um kit de purificação de DNA que é apropriado para transfeccao.
2. transientes do Transfection e tratamento Teb
- Prepare quatro pratos cultura celular (60 mm de diâmetro) contendo recém passadas HEK293 células em 5 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) suplementadas com 5-10% de soro fetal bovino (FBS) e antibióticos (100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL). Daqui em diante, "meio de cultura celular" ou simplesmente "meio de cultura" representa o DMEM suplementado com FBS e antibióticos. Manter as células HEK293 a 37 ° C.
- Transfect 1 µ g de DNA purificado dentro das células HEK293 com densidade de 50-60% usando 3 µ l de reagente de transfeccao. Adicionar o reagente de Transfeccao para 200 µ l de diluente (DMEM sem FBS e antibióticos) que contém o DNA. Após a incubação da mistura reacional durante 30 min à RT, adicione a mistura de células HEK-293 sobre o prato de cultura. Usar dois pratos para transfeccao e deixar os outros dois não tratada como controles.
- Após 12-24 h de transfeccao, adicione Teb (concentrações finais, 0.2 - 10 µmol) para uma das amostras transfectadas e um dos controles não-transfectadas. Deixe as outras duas amostras não tratadas como controles experimentais.
Nota: A solução estoque Teb (50mm dissolvido em Dimetilsulfóxido) pode ser diluída em meio de cultura celular, DMEM ou fosfato salino (PBS) a uma concentração adequada antes de adicionar a culturas de células de acordo com os parâmetros experimentais. No entanto, devido a baixa solubilidade de Teb em solução aquosa, evite preparar uma mistura de mestre com uma alta concentração de Teb no meio; em vez disso, substitua o meio de cultura de célula completa com meio fresco contendo Teb na concentração desejada. - Cultivar as células Teb-tratados e não tratadas por 12-48 h a 37 ° C.
- Se usar o EGFP inserir, analise a expressão EGFP sob um microscópio fluorescente ( Figura 2). Caso contrário, colhem as células para um ensaio de immunoblotting.
- Para o ensaio de immunoblotting, enxágue as células duas vezes com PBS gelado e depois raspá-los com uma espátula de célula.
- Para empilhar as células, spin para baixo as colheitas em um tubo cônico de 15 mL a 21.000 x g por 2 min em 18-25 ° C (RT).
- Após descartar a PBS completamente, adicionar 0,5 mL do reagente de extração de proteínas de mamíferos gelada (M-PER), juntamente com o inibidor da protease (5 µ l de 100 x coquetel de inibidor de protease), para a pelota se as células são cultivadas em um prato de 60 mm.
- Ressuspender as células com várias rodadas de pipetagem e então incubar as células suspensas por 15 min a 18-25 ° C (RT).
- Girar a célula lisada a 21.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
- Transferi o sobrenadante aquoso para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Analise o sobrenadante por immunoblotting, seguintes protocolos padrão com anticorpos apropriados.
3. geração de linhas de células HEK293 estável com integração Genomic do Gene Switch pEUI(+)
- Transfect 5-10 µ g do pEUI(+) purificado com o transgene em células HEK293 confluente de 50-60% em uma placa de cultura de célula de diâmetro 90mm, usando 15-30 µ l de reagente de transfeccao. Adicionar o reagente de Transfeccao para 500 µ l de diluente (DMEM sem FBS e antibióticos) que contém o DNA. Após a incubação da mistura reacional durante 30 min à RT, adicione a mistura de células HEK-293 sobre o prato de cultura.
- Após o transfeccao, permitir que o transfectants a crescer e expressar os produtos de genes de resistência a puromicina em meio de cultura não-seletivo (sem puromicina) por 24-48 h a 37 ° C.
- Dissocia as células desde os pratos de cultura por tripsinização. Após descartar o meio de cultura, enxágue o transfectants com PBS pré-aquecido (37 ° C), adicionar 1 mL de ácido de 0,25% tripsina/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incube por 1 min a 37 ° C. Após têmpera o tripsina/EDTA pela adição de meio de cultura previamente aquecido (10 mL, 37 ° C), colher as células com uma espátula de célula, seguida de centrifugação em um tubo cônico de 15 mL a 21.000 x g por 2 min 18-25 ° c.
- Ressuspender o transfectants em 50 mL de meio de cultura previamente aquecido (37 ° C) e 10 mL de células de transferência em pratos de cultura de células frescas de 90 mm. Cultura de células a 37 ° C até 50-60% confluência antes a puromicina (em geral, isso leva cerca de 24-48 h).
- Cultive a transfectants a 37 ° C em meio de cultura celular suplementado com 3 puromicina µ g/mL, por 3-4 semanas. Durante o período de seleção, altere o meio de cultura celular contendo puromicina (3 µ g/mL) a cada 2-3 dias para manter a pressão de seleção. Quando as células se tornam totalmente confluentes, dividi-los seguindo os procedimentos em etapas 3.3-3.4, com meio de cultura contendo puromicina. Descarte as células restantes do meio de cultura, se não necessária.
Nota: As condições de seleção puromicina devem ser estabelecidas experimentalmente para tipos específicos de célula. Usamos 3 µ g/mL de puromicina em meio de cultura celular; Isso foi o suficiente para induzir a morte celular em HEK293 não transfectadas. - Colher as células das colônias individuais, usando um cilindro de clonagem e siga as instruções do fabricante.
- Descarte o meio de cultura celular. Lave a placa duas vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS para remover células flutuantes.
- Usando uma pinça estéril, conjunto cilindro de clonagem sobre as colónias individuais.
- Adicione 0,2 mL de 0.35% tripsina/EDTA para cada cilindro.
- Incube o prato a 37 ° C por 1 min, até que as células são desanexadas e em seguida, adicione algumas gotas de meio de cultura previamente aquecido (37 ° C) para os cilindros.
- Transferi as células de cada cilindro individual aos poços de uma placa de 6, com 2 mL de meio de cultura e 1 µ g/mL de puromicina em cada poço.
Nota: Quando as células se tornam confluentes, ampliar a cultura. Agora clone(s) pode ser estabelecida.
- Manter os clones individuais em meio de cultura celular suplementado com 1 µ g/mL de puromicina.
- Valide as colônias individuais testando sua sensibilidade ao tratamento Teb (concentração final, 10 µM) por 24 h. teste a capacidade de resposta dos clones para o Teb, analisando o nível de expressão do transgene com immunoblotting. Selecione um clone desejado (ou clones). Cultive um Teb-tratados e uma amostra não tratada em meio de cultura para 12-48 h a 37 ° C antes de analisar o nível de indução do transgene. O nível de expressão do transgene pode ser medido através de immunoblotting, seguindo os procedimentos em etapas 2.5.1 - 2.5.7.
4. depleção de Teb
- Saciar os estímulos Teb, substituindo Teb contendo meio de cultura celular com meio Teb-livre.
Nota: Recomenda-se substituir a mídia de crescimento sem primeiro repropagação as células em um prato de cultura nova. Teb residual aparece aferrar-se ao prato plástico e irá provocar uma expressão forte background do transgene. Antes repropagação as células numa placa de cultura nova, enxágue as células colhidas diversas vezes com meio de cultura ou PBS.- Dissocia as células desde os pratos de cultura por tripsinização. Após descartar o Teb contendo meio de cultura, enxágue as células Teb-estimulada duas vezes com PBS pré-aquecido (37 ° C), adicionar 1 mL de 0,25% tripsina/EDTA e incubar durante 1 min a 37 ° C. Após têmpera o tripsina/EDTA adicionando pré-aquecido Teb-livre meio de cultura (10 mL, 37 ° C), colher as células com uma espátula de célula, seguida de centrifugação em um tubo cônico de 15 mL a 21.000 x g por 2 min 18-25 ° c.
- Ressuspender as células em 50 mL de meio cultura pré-aquecido Teb-free (37 ° C) e transferir 5ml das células para três pratos de cultura de células frescas de 60mm. Cultura de células a 37 ° C por 24, 48 e 72 h, respectivamente.
- As células em pontos diferentes do tempo da colheita e medir o nível de expressão do transgene usando immunoblotting.
Nota: Nestas condições experimentais, a expressão do transgene tornou-se indetectável pós-cultura de aproximadamente 3 dias das células no meio cultural Teb-livre (Figura 3). O nível de expressão do transgene pode ser medido pelo immunoblotting, conforme etapas 2.5.1 - 2.5.7.
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Representative Results
O interruptor de gene singular GvEcR-baseado é retratado na figura 1A. O vetor pEUI(+) foi otimizado para a expressão do transgene regulamentado pelo tratamento com Teb. A região de efetor de pEUI(+) inclui um 10xUAS e um E1b promotor mínimo seguido por um MCS contendo sites de reconhecimento de enzima de restrição EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII. Um sinal de poli SV40 foi adicionado para trás os MCS (figura 1B). Um gene do PAC foi inserido entre as regiões de driver e efetoras de pEUI(+) para conferir resistência a puromicina.
Para avaliar a atividade e leakiness de pEUI(+), nós subcloned EGFP no site do MCS EcoRI (pEUI(+)-EGFP), transitoriamente transfectadas construção de plasmídeo em células HEK293 e administrado Teb em diferentes concentrações para 24 h ( A Figura 2). Enquanto vector simulado transfectants não mostrou fluorescente sinais independentemente do tratamento Teb (Figura 2A, B), pEUI (+)-EGFP transfectants tornou-se progressivamente sensibilizada para o aumento da quantidade de Teb (Figura 2–F ). Mais importante, pEUI (+)-EGFP transfectants sem tratamento de Teb não eliciar detectáveis sinais EGFP sob um microscópio fluorescente (Figura 2).
Para validar ainda mais a capacidade de resposta do pEUI(+) para Teb, nós subcloned um gene de ANKRD13A bandeira epítopo-marcados para o sítio de EcoRI de pEUI(+), transferido a construção em células HEK293 e então, sujeitou-os a puromicina por 3 semanas para estabelecer uma linha de celular desejado com o transgene de ANKRD13A . Analisamos a expressão do transgene ANKRD13A após um tratamento de 24 h com Teb e a linha de celulares estabelecidas respondeu bem (Figura 3). Mais demonstrámos a reversibilidade do gene pEUI(+) interruptor por esgotar Teb da mídia cultural. Como mostrado na Figura 3, a expressão ANKRD13A não era mais detectável quando nós cultivadas as células em media Teb-free.
Figura 1 . Diagrama esquemático da pEUI(+). (A), o mapa do vetor de pEUI(+) foi construído. Um promotor CMV conduz a expressão constitutiva de GvEcR. O GvEcR Teb-limite será translocar para o núcleo e vincular o 10xUAS cis-agindo sequências reguladoras para estimular a expressão do transgene inserido no MCS. (B) a sequência de informações entre os colchetes no (A) contém as sequências de efetor inteira de pEUI(+). As setas representam os locais de reconhecimento de enzima de restrição individual incluídos em MCS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Interruptor de gene singular com base em GvEcR responde ao tratamento de Teb. Células HEK293 foram transfectadas com o DNA especificado constrói. Após 24h de transfeccao, as células foram estimuladas por 24 h com Teb na concentração indicada. EGFP transgene atividade foi observada sob um microscópio fluorescente. Transfectants simulado com pEUI(+) não mostrou qualquer fluorescência detectável com (A) ou sem tratamento de Teb (B). (C–E) A intensidade fluorescente em pEUI (+)-EGFP-células transfectadas aumenta de forma dose-dependente Teb. Escala da barra, 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . HEK293 células estàvel abrigando pEUI (+) / bandeira-ANKRD13A responder reversivelmente para a administração de Teb. BANDEIRA epítopo-tag ANKRD13A expressão foi provocada por tratamento de Teb (1,5 µM). Após 24 h de tratamento com Teb, as células foram trocadas para mídia de abandono Teb durante o tempo indicado. A quantidade relativa de ANKRD13A foi medida pela mancha ocidental com anticorpo anti-FLAG. O nível de expressão endógena de α-tubulina foi medido com anticorpo anti-α-tubulina como um controle. O asterisco branco indica uma espécie de cross-reactive não identificada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A principal desvantagem do uso de um interruptor de expressão do gene binário é a necessidade de entregar simultaneamente dois plasmídeos separados (motorista e efetoras) para a célula de destino. Isso pode levar a uma distribuição desigual de plasmídeos e resultam em uma resposta inconsistente do interruptor para o indutores1,2,3. Outra deficiência do sistema de dois vetores é que um mínimo de duas rodadas de seleção antibióticos são necessários para identificar promissores linhas celulares. Portanto, uma gene-inducible gaveta que compõem uma unidade há muito tempo tem sido procurada para uso em pesquisas biológicas. O interruptor de expressão do transgene singular pEUI(+) está contido em um único vetor, equipado com todas as unidades regulamentares necessárias para estimulação do transgene. Assim, o nível de indução do transgene, subcloned em pEUI(+), é dependente da quantidade de DNA transfectada no experimento de transfecção transiente e dosagem do indutor de química. Além disso, testamos ainda mais o uso do vetor pEUI(+), gerando uma linha de celular estável, contendo uma única cópia do transgene ANKRD13A 15. A linha de celulares estabelecidas mostrou alta sensibilidade ao tratamento Teb (Figura 3). Coletivamente, sua alta sensibilidade, reversibilidade e baixa leakiness15, juntamente com limitada variação no nível de expressão fazem pEUI(+) uma ferramenta valiosa molecular e celular para manipular a expressão do gene alvo.
Entre os vários sistemas de gene inducible, selecionamos a gaveta de indução do gene GvEcR-dependente. O GvEcR tem várias vantagens sobre outros sistemas: em primeiro lugar, a natureza lipofílica de vários análogos de isoinokosterone usado como indutores químicos (incluindo Teb) é vantajosa para penetração eficiente das membranas celulares,21; em segundo lugar, não há nenhum Col orthologs em vertebrados, então ecdiesteroide agonistas não influenciam a função de endogenamente expressa receptores nucleares21,,22; em terceiro lugar, ecdiesteroide é inócuos em vertebrados e rapidamente apuradas entre a circulação sistema na vivo21,23; e em quarto lugar, já que numerosos agonistas isoinokosterone foram desenvolvidas até o momento, escolhendo o tamanho ideal de moléculas pequenas, pesquisadores podem evitar complicações indesejáveis13,22,24. Embora o pEUI(+) mostra alta sensibilidade para Teb, testando a capacidade de resposta dos pEUI(+) aos outras agonistas ecdiesteroide pode revelar valiosa. A existência dos agonistas de EcR não-esteroides, tais como metoxifenozida, que são mais solúveis em água do Teb24 pode alargar o âmbito das aplicações de pEUI(+). Embora a expressão do transgene em pEUI(+) é relativamente mais fraca do que em um sistema Tet-On15, o nível de indução de transgene pode ser aumentado pela adição de uma multi cópia do domínio de transactivation VP16 (dados não mostrados). Aplicações recentes da terapia do gene têm focado a entrega segura de um gene alvo em células ou tecidos que não possuem o produto respectivo gene funcional devido a doença genética25,26,27. No entanto, não regulamentados transgene sob o controle dos promotores constitutivos tecido-específica ou virais pode provocar hiperexpressão do gene do alvo, o que eleva a possibilidade de dano de tecido local28,29. Assim, a aplicação de um interruptor de gene confiável para a terapia do gene pode evitar complicações indesejadas. O vetor de pEUI(+) fornece uma ferramenta conveniente e poderosa para controlar a expressão do transgene em estudos clínicos e biológicos. Atualmente, estamos desenvolvendo um vetor de Lentivirus singular com base em GvEcR para aumentar o leque de aplicação do nosso sistema.
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Disclosures
Temos sem conflitos de interesse relacionados a este relatório.
Acknowledgments
Os autores agradecer S-Y Choi (Universidade Nacional de Chonnam) comentários valiosos e leitura minuciosa de nosso manuscrito. Este trabalho foi financiado por um fundo de pesquisa da Universidade Nacional de Chungnam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
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