Summary
Nous présentons ici un protocole pour la modulation de transgene expression à l’aide de pEUI(+) du singulier gène interrupteur par traitement tébufénozide.
Abstract
Un contrôle précis de l’expression du transgène est souhaitable dans les études cliniques et biologiques. Cependant, parce que la fonction binaire d’interrupteurs de gène actuellement employé exige le transfert de deux unités d’expression thérapeutique simultanément en une seule cellule, l’application pratique du système pour la thérapie génique est limitée. Pour simplifier le système d’expression de transgènes, nous avons généré un commutateur de gène dénommé pEUI(+) qui englobe un ensemble complet de modules d’expression du transgène dans un vecteur unique. Comprenant le domaine de liaison à l’ADN de GAL4 et mis à jour le recueil (GvEcR), un domaine d’activation minimal VP16 fusionné avec un domaine de liaison à l’ADN de GAL4, mais aussi un mis à jour le récepteur de l’ecdysone Drosophila (EcR), le commutateur de gène du singulier nouvellement mis au point est très sensible à l’administration d’un inducteur chimique d’une manière dépendante du temps et dosage. Le vecteur pEUI(+) est un outil potentiellement puissant pour améliorer le contrôle de l’expression du transgène en recherche en biologie et en études précliniques. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la modulation d’une expression du transgène transitoire et stable en utilisant le vecteur pEUI(+) par le traitement de tébufénozide (Teb). En outre, nous partageons des orientations importantes pour l’utilisation de Teb comme un inducteur chimique.
Introduction
Plusieurs gènes différents commutateurs ont été étudiés pour leur capacité à précisément régulent l’expression de transgènes dans les cultures cellulaires et des modèles animaux, avec des degrés de succès1,2,3. Des systèmes de commutation de gènes potentiels se réunisse plusieurs critères stricts, notamment : précise directionnelle expression du transgène, réactivité de la fonction du dosage et temps à inducteurs, de perméabilité négligeable du promoteur, de réversibilité du transgène activation par le biais de suppression de l’inducteur et des niveaux de toxicité inducteur tolérables de lignées cellulaires et les animaux de laboratoire1,2,3. Plusieurs inducteurs de petites molécules ont été exploitées, y compris la tétracycline4,5, la rapamycine6,7,8, mifépristone9,10, et l’ecdysone11,12,13,14. En général, ces systèmes nécessitent au moins deux plasmides contenant deux ou trois unités discrètes d’expression, un ou deux qui composent un élément régulateur (plasmide inducteur) qui lie un inducteur de petite molécule d’acquérir l’activité transcriptionnelle ; et un autre plasmide (plasmide effecteur) contenant le transgène sous le contrôle d’une région régulatrice de l’ADN qui permet l’accès de l’élément réglementaire lié aux inducteur. Le principal inconvénient du système binaire est qu’il exige l’introduction concomitante de deux vecteurs (inducteur et effectrices) dans la cellule cible. Dans les expériences d’expression transitoire transgène, la transfection simultanée des deux plasmides produit inévitablement une population de cellules qui est transfectées avec l’inducteur ou l’effecteur isolément ou conjointement transfectées inégalement. En outre, le système binaire nécessite au moins deux tours de sélection antibiotique d’établir des lignées cellulaires stables, qui est longue et laborieuse. Ainsi, combinant tous les composants requis pour l’expression du transgène et de réglementation dans un unique vecteur serait idéale pour garantir l’expression simultanée de tous les éléments requis dans une seule cellule et permettre la régulation de l’expression du transgène Grâce à un traitement avec des inducteurs de petites molécules.
Pour remédier aux insuffisances des commutateurs de gène binaire, nous avons développé récemment un commutateur de gène du singulier, utilisant un Drosophila melanogaster axée sur les EcR gène inductible système15. L’ecdysone intervient dans l’expression des gènes, lorsqu’il se lie à l’hétérodimère EcR/ultraspiracle (USP), qui induit à son tour la liaison du recueil d’ADN des éléments régulateurs3,11. Le récepteur de vertébrés retinoid X (RXR), un orthologues d’insecte USP, recrute des EcR pour former un actif activateur de la transcription16. Ainsi, pour l’expression ciblée d’un transgène dans les cellules de vertébrés ou d’un tissu, le recueil et le RXR doivent être conjointement exprimé simultanément avant étant stimulée par l’ecdysone ou ses agonistes. Étant donné que la fonctionnalité d’hétérodimères du commutateur génique à base EcR peut être influencée par paquet niveau, RXR endogène et al. remplacé les domaines de liaison à l’ADN de l’EcR et l’activation avec le liant à l’ADN de GAL4 hétérologue, herpès simplex virus protéine vmw65 domaines d’activation (VP16) fondu vers le domaine de liaison du ligand EcR, qui ensuite devenue insensible aux RXR endogène et forme un homodimère pour obtenir de l’activité transcriptionnelle17. Le commutateur de gène axée sur les EcR a été encore amélioré par la construction d’une protéine chimérique composée d’un minimum domaine d’activation VP16 combiné avec GvEcR, qui forme un homodimère et localisée dans le cytosol en l’absence de l’agoniste de l’ecdysone, Teb16, 18. En se liant à Teb, le GvEcR a changé sa localisation subcellulaire du cytosol vers le noyau de reconnaître un promoteur hybride composé du poisson-zèbre E1b promoteur minimal combiné avec un tandem dix répété séquences d’activation en amont (HES) pour initier la transcription du gène cible16.
Pour simplifier le gène axée sur les EcR rapporté antérieurement commutateurs16,18, nous avons combiné les dispositifs binaires du système dans un vecteur unique équipé de tous les éléments requis pour stimuler l’expression transgénique et ensuite désignée le vecteur généré récemment, pEUI(+) (nombre de GenBank accession : KP123436, la Figure 1 a)15. Le processeur d’effets en réponse à la GvEcR (ci-après pilote) se compose de dix tandem SAMU répète à côté d’un promoteur minimal E1b suivi d’un site multiple de clonage (MCS) avec des séquences de reconnaissance EcoRI PmlI, NheI, société, AfeI et AflII (Figure 1 b). En outre, pour faciliter la sélection des transfecté des cellules, une puromycine de pilotée par le promoteur SV40 N-acétyl-transférase (PAC) a été placée entre le pilote et effecteur de maintenir les lignées cellulaires stables (Figure 1).
Les auteurs décrivent un protocole détaillé pour la modulation transitoire et stable de transgene expression à l’aide de pEUI(+). En outre, nous fournissons des instructions détaillées pour l’utilisation réussie de Teb comme un agoniste de l’ecdysone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transgène Subcloning
- Choisir un site de reconnaissance appropriée des enzymes de restriction (ou sites) à la STM de pEUI(+) et subclone du gène d’intérêt dans la direction désirée (Figure 1).
Remarque : L’ankyrin épitope-tag EGFP ou drapeau répéter domaine 13 a (ANKRD13A) transgène a été sous-cloné dans site EcoRI du vecteur pEUI(+) à l’aide de T4 ADN polymérase dans un séquence ligature indépendant et19de la méthode de clonage. - Linéariser la pEUI(+) avec EcoRI pendant 1 h à 37 ° C. Mélanger 50 ng/µL de linéarisé pEUI(+) 40 ng/µl d’amplifié par PCR EGFP ou ANKRD13A et réagissent avec la polymérase ADN T4 (1 U) pendant 1 min à température ambiante (RT) avant incubation sur la glace pendant 10 min. Ajouter 10 µL du mélange réactionnel directement à 100 µL de DH10B cellules compétentes pour la transformation suivante experiment.
Remarque : Bien que plusieurs sites de reconnaissance d’enzyme de restriction ont été ajoutés à la STM de pEUI(+) (Figure 1 b), nous recommandons subcloning gène ciblé dans le site EcoRI, indépendant de la ligature clonage technologie19,20. - Vérifier l’insert par séquençage et ensuite purifier l’ADN à l’aide d’un kit de purification de l’ADN qui convient pour la transfection.
2. transitoire Transfection et traitement de Teb
- Préparer quatre récipients de culture cellulaire (60 mm de diamètre) contenant fraîchement repiquées cellules HEK293 dans 5 mL de milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) additionnés de 5 à 10 % sérum fœtal (SVF) et antibiotiques (100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine). Ci-après, « milieu de culture cellulaire » ou simplement « milieu de la culture » représente le DMEM additionné de FBS et antibiotiques. Maintenir les cellules HEK293 à 37 ° C.
- Transfecter 1 µg d’ADN purifié dans les cellules HEK293 à densité de 50-60 % avec 3 µL de réactif de transfection. Ajouter le réactif de transfection à 200 µL de diluant (DMEM sans FBS et antibiotiques) contenant l’ADN. Après l’incubation du mélange réactionnel pour 30 min à ta, ajouter le mélange aux cellules HEK-293 sur la boîte de Pétri. Utilisez deux plats pour la transfection et laisser les deux autres n’est pas traité en tant que contrôles.
- Après 12 à 24 heures de la transfection, ajoutez Teb (concentration finale, 0,2 - 10 µmol) à l’un des échantillons transfectés et à des contrôles non transfectées. Laissez les deux autres échantillons n’est pas traités en tant que contrôles expérimentaux.
Remarque : La solution mère de Teb (50 mM dissous dans le diméthylsulfoxyde) peut être diluée dans un milieu de culture cellulaire, DMEM ou solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration appropriée avant d’ajouter dans les cellules cultivées selon les paramètres expérimentaux. Toutefois, en raison de la faible solubilité de Teb en solution aqueuse, éviter de préparer un mélange maître avec une forte concentration de Teb dans le milieu ; au contraire, remplacer le milieu de culture cellulaire complet avec un milieu frais contenant Teb à la concentration désirée. - Cultiver les cellules Teb-traités et non traités pendant 12 à 48 heures à 37 ° C.
- Si à l’aide de l' EGFP insert, analyser l’expression EGFP sous un microscope à fluorescence ( Figure 2). Dans le cas contraire, récolter les cellules pour un dosage immunoblotting.
- Pour le dosage d’immunoblotting, rincer les cellules deux fois avec du PBS glacée et puis les gratter à l’aide d’un grattoir de cellules.
- Pour empiler les cellules, tournez en bas des récoltes dans un tube conique de 15 mL à 21 000 x g pendant 2 min à 18-25 ° C (RT).
- Après avoir jeté le PBS complètement, ajouter 0,5 mL de réactif d’extraction de protéines de mammifères glacee (M-par), ainsi que l’inhibiteur de la protéase (5 µL de 100 x cocktail inhibiteur de protéase), au culot si les cellules sont cultivées dans un plat de 60 mm.
- Remettre en suspension les cellules avec plusieurs cycles de pipetage et puis incuber les cellules en suspension pendant 15 min à 18-25 ° C (RT).
- Faire tourner la cellule lysate à 21 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Transvaser le surnageant aqueux dans un tube de microcentrifuge frais de 1,5 mL.
- Analyser le liquide surnageant par immunoblotting, suivant des protocoles standard avec des anticorps appropriés.
3. génération des lignées de cellules HEK293 Stable avec intégration génomique de la pEUI(+) Gene Switch
- Transfecter 5-10 µg de le pEUI(+) purifié avec le transgène dans les cellules HEK293 anastomosé 50 à 60 % dans une boîte de Petri cellule de diamètre 90 mm, à l’aide de 15 à 30 µL de réactif de la transfection. Ajouter le réactif de transfection de 500 µL de diluant (DMEM sans FBS et antibiotiques) contenant l’ADN. Après l’incubation du mélange réactionnel pour 30 min à ta, ajouter le mélange aux cellules HEK-293 sur la boîte de Pétri.
- Après la transfection, permettre les transfectants à croître et à exprimer les produits des gènes puromycine-résistance dans le milieu de culture non sélectif (sans la puromycine) pendant 24 à 48 heures à 37 ° C.
- Dissocier les cellules de la vaisselle de la culture par trypsinisation. Après avoir jeté le milieu de culture, rincer les transfectants avec PBS préchauffé (37 ° C), ajouter 1 mL d’acide de 0,25 % trypsine/tétraacétique (EDTA) et incuber pendant 1 min à 37 ° C. Après la trempe la trypsine/EDTA en ajoutant le milieu de culture pré chauffé (10 mL, 37 ° C), récolter les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules, suivi par centrifugation dans un tube conique de 15 mL à 21 000 x g pendant 2 min à 18-25 ° C.
- Remettre en suspension les transfectants dans 50 mL de milieu de culture pré chauffé (37 ° C) et transfert 10 mL des cellules dans les récipients de culture de cellules fraîches 90 mm. La culture des cellules à 37 ° C jusqu'à la confluence de 50 à 60 % avant le traitement de la puromycine (en général, cela prend environ 24-48 h).
- Cultiver les transfectants à 37 ° C en milieu de culture cellulaire, additionné de la puromycine 3 µg/mL pendant 3-4 semaines. Au cours de la période de sélection, changer le milieu de culture cellulaire contenant la puromycine (3 µg/mL) tous les 2-3 jours pour maintenir la pression de sélection. Lorsque les cellules deviennent entièrement confluentes, divisez-les en suivant les procédures de mesures 3.3-3.4, avec milieu de culture contenant la puromycine. Jeter les cellules restantes dans le milieu de culture, si ne pas nécessaire.
Remarque : Les conditions de sélection puromycine doivent être établies expérimentalement pour des types spécifiques de cellules. Nous avons utilisé 3 µg/mL de puromycine dans un milieu de culture cellulaire ; Cela était suffisant pour induire la mort cellulaire dans HEK293 non transfectées. - Récolter les cellules provenant des colonies individuelles, à l’aide d’un cylindre de clonage et suivez les instructions du fabricant.
- Jeter le milieu de culture cellulaire. Rincez la plaque deux fois avec pré chauffé (37 ° C) PBS pour éliminer les cellules flottantes.
- À l’aide d’une pince stérile, remettre la bouteille de clonage les colonies individuelles.
- Ajouter 0,2 mL de 0,35 % trypsine/EDTA pour chaque cylindre.
- Incuber le plat à 37 ° C pendant 1 min, jusqu'à ce que les cellules sont détachés et puis ajoutez quelques gouttes de milieu de culture pré chauffé (37 ° C) pour les cylindres.
- Transférer les cellules de chaque cylindre à chaque puits d’une plaque 6 puits, avec 2 mL de milieu de culture et 1 µg/mL de puromycine dans chaque puits.
Remarque : Lorsque les cellules deviennent confluentes, intensifier la culture. Clone(s) peut maintenant être établie.
- Maintenir des clones individuels en milieu de culture cellulaire, additionné de 1 µg/mL de puromycine.
- Valider les colonies individuelles en testant leur sensibilité au traitement de Teb (concentration finale, 10 µM) pendant 24 h. Test de la réactivité des clones à l’ETB en analysant le niveau d’expression du transgène avec immunoblotting. Sélectionner un clone désiré (ou clones). Cultiver un Teb-traité et un échantillon non traité dans le milieu de culture pendant 12 à 48 heures à 37 ° C avant d’analyser le niveau d’induction du transgène. Le niveau d’expression du transgène peut être mesuré par immunoblotting, suivant les procédures de mesures 2.5.1 - 2.5.7.
4. l’appauvrissement de Teb
- Étancher les stimuli Teb en remplaçant Teb contenant un milieu de culture cellulaire avec un milieu sans Teb.
Remarque : Il est recommandé de remplacer les milieux de culture sans premier réensemencement des cellules sur une nouvelle boîte de Pétri. Teb résiduel semble s’accrocher à la vaisselle en plastique et va susciter une expression forte expérience du transgène. Avant le réensemencement des cellules sur une plaque de culture nouvelle, rincer les cellules récoltées plusieurs fois avec milieu de culture ou PBS.- Dissocier les cellules de la vaisselle de la culture par trypsinisation. Après avoir jeté l’ETB contenant le milieu de culture, rincer les cellules stimulées par Teb deux fois avec du PBS préchauffé (37 ° C), ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine/EDTA et incuber pendant 1 min à 37 ° C. Après la trempe la trypsine/EDTA en ajoutant préchauffé Teb-free culture medium (10 mL, 37 ° C), récolter les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules, suivi par centrifugation dans un tube conique de 15 mL à 21 000 x g pendant 2 min à 18-25 ° C.
- Remettre en suspension les cellules dans 50 mL de milieu de culture pré chauffé exempt de Teb (37 ° C) et transfert 5 mL des cellules dans trois récipients de culture de cellules fraîches de 60 mm. La culture des cellules à 37 ° C pendant 24, 48 et 72 h respectivement.
- Récolter les cellules à des moments différents et mesurer le niveau d’expression du transgène en utilisant immunoblotting.
Remarque : Dans ces conditions expérimentales, l’expression du transgène est devenu indétectable environ 3 jours après la culture des cellules dans le milieu culturel sans Teb (Figure 3). Le niveau d’expression du transgène peut être mesuré par immunoblotting, comme par les Etapes 2.5.1 - 2.5.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le commutateur axée sur les GvEcR du singulier gène est représenté dans la Figure 1 a. Le vecteur de pEUI(+) a été optimisé pour l’expression de transgènes réglementés par le traitement avec Teb. La région d’effecteur des pEUI(+) comprend un 10xUAS et un E1b promoteur minimal suivie d’une MCS contenant les sites de reconnaissance d’enzyme de restriction EcoRI, PmlI, NheI, société, AfeI et AflII. Un signal de poly SV40 a été ajouté derrière le MCS (Figure 1 b). Un gène de la PAC a été inséré entre les régions de pEUI(+) de conférer la résistance à la puromycine pilote et effectrices.
Pour évaluer l’activité et la perméabilité de pEUI(+), nous sous-cloné EGFP dans le site EcoRI des MCS (pEUI(+)-EGFP), transitoirement transfecté la construction de plasmide dans les cellules HEK293 et administré Teb à différentes concentrations pendant 24 h ( ) La figure 2). Tandis que le simulacre vecteur transfectants n’a pas montré fluorescent signale quel que soit le traitement Teb (Figure 2 a, B), pEUI (+)-EGFP transfectants devint progressivement sensibilisés à la plus grande quantité de Teb (Figure 2–F ). Plus important encore, pEUI (+)-EGFP transfectants sans traitement de Teb ne pas permis d’obtenir des signaux EGFP détectables sous un microscope à fluorescence (Figure 2).
Afin de valider davantage la réactivité des pEUI(+) de Teb, nous sous-cloné un gène de ANKRD13A drapeau épitope-tag dans le site EcoRI de pEUI(+), transférés de la construction dans les cellules HEK293 et puis soumis à la sélection de la puromycine pendant 3 semaines établir une lignée de cellules désiré avec le transgène de ANKRD13A . Nous avons analysé l’expression du transgène ANKRD13A après un traitement de 24 h avec Teb et la lignée cellulaire établie bien réagi (Figure 3). Plus loin, nous avons démontré la réversibilité de l’interrupteur du gène pEUI(+) par appauvrissant Teb des médias culturels. Comme illustré à la Figure 3, expression ANKRD13A n’était plus détectable quand nous avons cultivé les cellules dans des milieux sans Teb.
Figure 1 . Schéma de principe de pEUI(+). (A), la carte de vecteur de pEUI(+) a été construit. Un promoteur de CMV entraîne l’expression constitutive de GvEcR. Le GvEcR de Teb lié sera translocation dans le noyau et lier l' 10xUAS cis-agissant de séquences régulatrices pour stimuler l’expression du transgène inséré dans la MCS. (B), la séquence d’information entre les crochets en (A) contient les séquences d’effecteur tout de pEUI(+). Flèches représentent les sites de reconnaissance individuelle des enzymes de restriction inclus dans la MCS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Commutateur de gène du singulier axée sur la GvEcR répond au traitement de Teb. Les cellules HEK293 ont été transfectées avec l’ADN spécifié construit. Après 24h de la transfection, les cellules sont stimulées pendant 24 h avec Teb à la concentration indiquée. Activité de transgene EGFP a été observée sous un microscope à fluorescence. Transfectants simulé avec pEUI(+) n’ont montré aucune fluorescence détectable avec (A) ou sans traitement de Teb (B). (C–E) L’intensité de fluorescence en pEUI (+)-EGFP-cellules transfectées augmente de façon dose-dépendante de Teb. Balance bar, 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Les cellules HEK293 pEUI stablement hébergeant (+) / pavillon-ANKRD13A répondre réversiblement à l’administration de Teb. DRAPEAU épitope-le tag ANKRD13A expression a été déclenchée par un traitement Teb (1,5 µM). Après 24 h de traitement avec Teb, les cellules sont passés aux médias abandon Teb pendant le temps indiqué. La quantité relative de ANKRD13A a été mesurée par Western Blot avec anticorps anti-drapeau. Le niveau d’expression endogène de α-tubuline a été mesuré avec un anticorps anti-α-tubuline comme un contrôle. L’astérisque blanche indique une espèce non identifiée d’une réaction croisée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le principal inconvénient de l’utilisation d’un commutateur d’expression de gène binaire est la nécessité d’offrir simultanément deux plasmides distincts (pilote et effectrices) dans la cellule cible. Cela peut conduire à une répartition inégale des plasmides et aboutir à une réponse incohérente du commutateur pour les inducteurs1,2,3. Une autre lacune du système deux-vecteur est qu’un minimum de deux tours de sélection antibiotique sont tenus d’identifier des lignées prometteuses. Par conséquent, une gène inductible cassette comprenant une unité a longtemps été cherchée devant servir à la recherche biologique. Le commutateur d’expression du transgène du singulier pEUI(+) est contenu dans un vecteur unique équipé de toutes les unités réglementaires requises pour la stimulation du transgène. Ainsi, le niveau d’induction du transgène, sous-cloné dans pEUI(+), dépend de la quantité d’ADN transfecté dans l’expérience de transfection transitoire et le dosage de l’inducteur chimique. En outre, nous avons testé plus loin l’utilisation du vecteur pEUI(+) en générant une lignée cellulaire stable contenant une seule copie du transgène ANKRD13A 15. La lignée cellulaire établie a montré une sensibilité élevée au traitement Teb (Figure 3). Sa haute sensibilité, réversibilité et faible perméabilité15, avec une variation limitée au niveau d’expression constituent à pEUI(+) un précieux outil moléculaire et cellulaire pour manipuler l’expression des gènes cibles.
Parmi les différents systèmes de gène inductible, nous avons choisi la cassette de l’induction du gène GvEcR-dépendante. Le GvEcR a plusieurs avantages par rapport aux autres systèmes : tout d’abord, le caractère lipophile de plusieurs analogues de l’ecdysone, utilisés comme inducteurs chimiques (y compris Teb) est avantageux pour une pénétration efficace des membranes cellulaires,21; Deuxièmement, il n’y a aucun EcR orthologues chez les vertébrés, donc les agonistes des ecdystéroïdes n’influencent pas la fonction d’exprimés récepteurs nucléaires21,22; Troisièmement, les ecdystéroïdes sont inoffensifs chez les vertébrés et rapidement dégagé de la circulation système in vivo21,23; et Quatrièmement, puisque nombreux agonistes de l’ecdysone ont été développés jusqu’ici, en choisissant la taille optimale de petites molécules, les chercheurs peuvent éviter complications indésirables13,22,24. Bien que le pEUI(+) présente une sensibilité élevée de Teb, tester la réactivité des pEUI(+) aux autres agonistes des ecdystéroïdes peut s’avérer précieux. L’existence des non-stéroïdiens EcR agonistes, tels que méthoxyfénozide, qui sont plus solubles dans l’eau que Teb24 peut élargir le champ d’applications de pEUI(+). Bien que l’expression du transgène dans pEUI(+) est relativement plus faible que celle dans un système Tet15, le niveau d’induction de transgene pourrait être augmenté par l’ajout d’une copie multiple du domaine de transactivation VP16 (données non présentées). Les applications récentes de thérapie génique ont mis l’accent sur l’accouchement d’un gène cible dans des cellules ou tissus qui n’ont pas le produit de gène fonctionnel respectifs en raison de la maladie génétique25,26,27. Cependant, transgene non réglementés sous le contrôle des promoteurs constitutifs tissu-spécifiques ou virales peut susciter des hyper-l’expression du gène cible, qui augmente la possibilité du tissu local dommages28,29. Ainsi, l’application d’un commutateur de gène fiable pour la thérapie génique pourrait éviter des complications indésirables. Le vecteur de pEUI(+) fournit un outil pratique et puissant pour contrôler l’expression de transgènes dans les études cliniques et biologiques. Actuellement, nous développons un vecteur lentiviral singulier basé sur GvEcR d’augmenter le champ d’application de notre système.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nous n’avons aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.
Acknowledgments
Les auteurs remercient S-Y Choi (Université nationale de Chonnam) pour les précieux commentaires et de la lecture attentive de notre manuscrit. Ce travail a été soutenu par un fonds de recherche de l’Université nationale de Chungnam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. , InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
