Summary
Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.
Abstract
Willekeurige mutagenese van een target-gen wordt vaak gebruikt om te identificeren van mutaties die opbrengst van het gewenste fenotype. Van de methoden die kunnen worden gebruikt om willekeurige mutagenese, foutgevoelige PCR is een handige en efficiënte strategie voor het genereren van een diverse pool van mutanten (dwz., een mutant bibliotheek). Vergissing-geneigd PCR is de methode van keuze wanneer een onderzoeker wil muteren van een vooraf gedefinieerde regio, zoals de codering regio van een gen terwijl andere genomic regio's onaangetast. Nadat de mutant bibliotheek wordt versterkt door foutgevoelige PCR, moet het worden gekloond in een geschikte plasmide. De grootte van de bibliotheek gegenereerd door foutgevoelige PCR wordt beperkt door de efficiëntie van de klonen stap. Echter in de kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe, kan de klonen stap worden vervangen door het gebruik van een zeer efficiënte one-step fusie PCR voor het genereren van constructies voor transformatie. Mutanten van gewenste fenotypen kunnen vervolgens worden geselecteerd met behulp van passende verslaggevers. Hier beschrijven we deze strategie in detail, nemen als voorbeeld, een verslaggever aan centromeric heterochromatin ingevoegd.
Introduction
Voorwaartse genetica is een klassieke methode waarin onderzoekers zoeken natuurlijk voorkomende mutanten die weer een bepaalde fenotype en genetische analyses uitvoeren. In omgekeerde genetica, mutaties worden ingevoerd in een gen van belang en het fenotype is onderzocht. In het laatste geval, wordt willekeurige mutagenese van een target-gen vaak gebruikt voor het genereren van een pool van mutanten die vervolgens voor de gewenste fenotypen, zoals temperatuur gevoeligheid zijn geselecteerd of gewijzigd enzymatische activiteit. Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om willekeurige mutagenese, met inbegrip van foutgevoelige PCR1; UV bestraling2; chemische mutagenen, zoals ethyl methanesulfonate (EMS) of waterstofnitriet3; het gebruik van tijdelijke mutator stammen, zoals die over het uitdrukken van mutD5 4; en DNA schuifelen5.
Hier beschrijven we een omgekeerde-genetica strategie waarin we gebruik maken van foutgevoelige PCR voor het genereren van mutant zwembaden voor een doel-gen in de kernsplijting gist. Zoals men wel kan van de naam raden, genereert deze methode mutaties doordat opzettelijk fouten tijdens PCR. In tegenstelling tot andere methoden mutagenese kan foutgevoelige PCR de gebruiker te definiëren van de regio te worden mutagenized. Dit maakt het handig bij inspanningen om te bestuderen van de functie van een eiwit/domein van belang.
Om aan te tonen deze procedure willekeurige mutagenese, wij hierin rpt4 +, die de 19S proteasoom subeenheid codeert, als voorbeeld gebruiken. Rpt4 heeft aangetoond dat proteolyse-zelfstandige functies in organismen met uitzondering van kernsplijting gist6,7,8,9, en een defect in proteolyse indirecte effecten kan veroorzaken door een wijziging van de eiwitten niveaus. Wij, daarom gescreend voor mutanten die geactiveerd proteolyse-onafhankelijke veranderingen, met het doel van het onderzoek naar de functie van het proteasoom op heterochromatin.
Vergissing-geneigd PCR kan worden toegepast op elk gen-gebied door het afstemmen van de locatie waarop de primers binden. Mutanten die de gewenste fenotypische verandering vertonen kunnen worden geïdentificeerd met passende verslaggevers. Hier, we gebruikt een ade6 + verslaggever ingevoegd op de centromeer 1 buitenste herhaling (otr) regio10. Constitutieve heterochromatin wordt gevormd om deze regio11, zodat de ade6 + -verslaggever is het zwijgen opgelegd in de voorwaarde van de wild-type; Dit wordt aangegeven door rode kolonies10. Een mutatie die de constitutieve heterochromatin op de centromeer destabiliseert zal leiden tot de uitdrukking van de ade6 + verslaggever, die als witte kolonies is gevisualiseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de Media
- Bereiden gistextract met supplementen (YES), ja zonder adenine (ja lage Ade), Pombe Glutamate medium (PMG12) en PMG zonder adenine (PMG-Ade) door het mengen van de componenten, zoals beschreven in tabel 1. Ja-Ade (lage Ade) en de PMG-Ade platen al dezelfde componenten, maar de adenine is weggelaten uit de laatste.
- Gebruik de volgende zout (50 x) voorraad: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na2dus4 in gedestilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een filter van 0.22-µm porie-grootte en bewaren bij 4 ° C.
- Gebruik de volgende vitamine (1, 000 x) voorraad: 1 g/L pantothenaat, 10 g/L inositol, nicotinezuur 10 g/L en 10 mg/L Biotine in gedestilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een filter van 0.22-µm porie-grootte en bewaren bij 4 ° C.
- Gebruik het volgende mineraal (10, 000 x) voorraad: 5 g/L boorzuur, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L citroenzuur in gedestilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een filter van 0.22-µm porie-grootte en bewaren bij 4 ° C.
Nota: Ja opgietvloeistof kan worden gemaakt door het weglaten van de agar.
- Autoclaaf het medium en het afkoelen tot onderstaande 60 ° C al roerend met een roer-bar, tegen het tarief van 200 rpm.
- Ja + G418 (geneticin) platen, voegt toe 1 mL/L G418-stockoplossing aan het ja-medium.
- Gebruik de volgende G418 (1, 000 x) voorraad: 100 mg/mL G418 in gedestilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een 0.22-µm poriegrootte filter, aliquoot om 1,5 mL centrifuge buizen, en sla bij-20 ° C.
- Roer voor een ander 5-10 min en aliquot de media in 90-mm petrischalen (1 L voor middellange aliquots tot ongeveer 40 petrischalen. Opslaan van de platen bij 4 ° C.
2. klonen van rpt4 + en zijn 5' / 3' UTRs
- Uitvoeren van PCR inleidingen p1 en p2 (figuur 1A) met behulp van kernsplijting gist genomic DNA (gDNA) als de sjabloon in een totaal volume van 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reactie buffer), en toepassing van de cycli van de reactie beschreven in tabel 2 van het versterken van een 3,315-base paar (bp) fragment bestaande uit rpt4 + en zijn 5' / 3' UTRs. Het zuiveren van het PCR-product met behulp van een zuivering kit13 volgens de aanwijzingen van de fabrikant (figuur 1A).
- Verteren de pBlueScript KS(-) vector14 en de versterkte fragment van DNA met rpt4 + met zijn 5' / 3' UTRs met BamH1 en Xho1 in een totaal volume van 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x spijsvertering buffer) bij 37 ° C in een waterbad voor 16-18 h (figuur 1B).
- Gel zuiveren de verteerd vector (1,2% agarose gel) en DNA invoegen door uitvoeren van TAE gebaseerde agarose gelelektroforese (100 V, 1 h), middendoor van de DNA-bands van de gewenste maten en het DNA met een gel extractie kit15isoleren.
- Afbinden van de vector en DNA invoegen met behulp van T4 DNA ligase door het uitvoeren van een 20-µL afbinding reactie met 50-100 ng van de vector DNA, een ~ 3-voudig molaire overmaat van het DNA invoegen, 400 U T4 DNA ligase en 1 x afbinding buffer. Incubeer dit mengsel bij 18 ° C gedurende 16-18 h.
- De ligaturen DNA transformeren in 100 µL van E. coli DH5α door het toepassen van warmte schok voor 70 s bij 42 ° C. Voeg 1 mL LB en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C voor herstel. Uitvoeren van centrifugeren (13,800 x-g), negeren de supernatant, plaat alle de getransformeerde E. coli cellen op LB-ampicilline (LA) platen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur.
- Kies 4-8 kolonies met tandenstokers en 's nachts groeien bij 37 ° C in 3 mL LA medium.
- De plasmiden isoleren met een plasmide zuivering kit16 gebruikt volgens protocol van de fabrikant en het uitvoeren van de spijsvertering van het beperkingsenzym analytische met 5 µL van het geïsoleerde plasmide, 5 U van elke restrictie-enzym (BamH1 en Xho1) en 1 x beperking buffer. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C in een waterbad voor 3 h. bevestigen het klonen door kandidaat-plasmiden sequencing.
3. invoering van de Stille Mutatie (Xho1 beperkingsplaats)
- Het ontwerp van een paar 33-bp inleidingen (p3 en p4) die de gewenste mutatie in de anders bijkomende opeenvolging bevatten.
- Uitvoeren van PCR met hifi-polymerase17 (Figuur 1 c) in een totaal volume van 25 µL (10 ng van gekloonde plasmide, 2 µL van 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reactie buffer) met de fietsen parameters vermeld in tabel 3.
- De sjabloon plasmide met Dpnik in een totaal volume van 20 µL (20 U enzym, 1 x spijsvertering buffer) bij 37 ° C in een water bad voor 1 h verteren.
- Transformeren, propageren, isoleren en het volgnummer van de plasmide met de Stille mutatie, zoals beschreven in stappen 2.5-2.7.
Opmerking: De Stille mutatie kan ook worden ingevoerd via een klonen methode die het mogelijk maakt voor het verbinden van meerdere fragmenten van DNA in een enkele reactie18.
4. de willekeurige mutagenese voor rpt4 + door foutgevoelige PCR
- Vergissing-geneigd PCR, met behulp van de plasmide met de Stille Mutatie (Xho1 website) uit te voeren als de sjabloon, inleidingen p5 en p6, een totaal volume van 50 µL (de hoeveelheid sjabloon gedefinieerd in stap 4.1.1, 2 µL van 10 pmol primer mix, 2.5 U enzym, 1 x reactie buffer) , en een speciale polymerase die is ontworpen voor het genereren van een hoge fout tarief19 (Figuur 1 d). PCR uitvoeren zoals beschreven in tabel 2.
- 4-5 µg sjabloon plasmide gebruiken om te controleren de mutatiefrequentie 1 bp/KB (kilobase).
Opmerking: Een hoge concentratie (> 500 ng/µL) van de plasmide, die kan worden verkregen met behulp van een mini prep kit20, vereist is.
- 4-5 µg sjabloon plasmide gebruiken om te controleren de mutatiefrequentie 1 bp/KB (kilobase).
- Gebruik de gelelektroforese van het te bevestigen van een PCR-product van 2670 bp (1,2% agarose gel). Gel zuiveren deze PCR-product zoals beschreven in stap 2.5.
5. bereiding van Fusion PCR fragmenten (KAN, 3' UTR)
- Het uitvoeren van PCR met behulp van pFA6a-KANMX621 als de sjabloon, de inleidingen p7 en de p8, en de voorwaarden vermeld in tabel 4 te verkrijgen van het fragment marker (KAN). Gel zuiveren het resulterende 1.480-bp-fragment, zoals beschreven in stap 2.5 (figuur 1E).
- Controleer als de stop codon van het gen voor mutatie en de codering regio van de aangrenzende gen gericht worden gescheiden door meer dan 500 bp. De endogene terminator mag niet worden gebruikt wanneer deze regio minder dan 500 is bp; de ADH -terminator moet daarentegen worden gebruikt in plaats van de endogene terminator. De wijzigingen van de protocol vereist voor het gebruik van de ADH -terminator worden gepresenteerd in tabel 5.
Opmerking: Deze wijzigingen zijn alleen van toepassing wanneer de ADH -terminator, die beschikbaar in het plasmide pFA6a-3 ha-KANMX6 is, wordt gebruikt in plaats van de endogene terminator.
- Controleer als de stop codon van het gen voor mutatie en de codering regio van de aangrenzende gen gericht worden gescheiden door meer dan 500 bp. De endogene terminator mag niet worden gebruikt wanneer deze regio minder dan 500 is bp; de ADH -terminator moet daarentegen worden gebruikt in plaats van de endogene terminator. De wijzigingen van de protocol vereist voor het gebruik van de ADH -terminator worden gepresenteerd in tabel 5.
- PCR uitvoeren met de gekloonde rpt4 +-met vector als sjabloon en inleidingen p9 en p10 in een totaal volume van 50 µL (20 ng van de gekloonde plasmide, 2 µL van 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reactie buffer), met behulp van de voorwaarden gepresenteerd in tabel 6. Gel zuiveren het verkregen 506-bp 3'-UTR fragment (figuur 1E).
6. generatie van de constructie van de transformatie door fusie PCR (figuur 1E)
- De 3 fragmenten (mutagenized rpt4 +KAN en de 3' UTR) op 50 ng/µL voor te bereiden.
- Uitvoeren van fusion die PCR van de drie met behulp van primers p11 en p12, fragmenten zoals beschreven in tabel 7. (Het protocol voor fusion PCR is een wijziging van het oorspronkelijke protocol22.) Het zuiveren van het grote 4,398-bp PCR product.
- Gebruik rpt4 +: KAN:3'UTR fragmenten in een verhouding van 1:3:1 voor optimale resultaten.
Opmerking: Het totale bedrag van het DNA invoegen mag niet hoger zijn dan 500 ng. De aanbevolen hoeveelheid rpt4 +: KAN:3'UTR is 50 ng:150 ng:50 ng. De mutagenized regio is ongeveer 1,6 kb, zodat het minimumaantal gist kolonies, dat zou goed zijn voor alle mogelijke combinaties van elke basis wordt gemuteerd tot de andere drie 1.600 x 3 = 4800 kolonies. Omdat een reactie van de transformatie levert meestal 400-500 kolonies, ten minste 10 Reacties waard van fusion PCR bouwen nodig is. Deze behoefte kan worden voldaan doordat gewoon de reactie bedrag (dat wil zeggen, het aantal PCR buisjes) met een factor tien.
- Gebruik rpt4 +: KAN:3'UTR fragmenten in een verhouding van 1:3:1 voor optimale resultaten.
7. transformatie van kernsplijting gist door Electroporation (figuur 1F)
- Inoculeer gist tot 10 mL van Ja middellange tot verzadiging door het voor meer dan 16 h aan het broeden.
- Verdun de cellen tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0.2 in 200 mL ja voedingsbodem en Incubeer bij 30 ° C met schudden voor 5-6 h, OD600 = 0,6 - 0,8.
- Concentreren cellen OD600 = 30, afzien vier 50 mL conische buizen en chill op het ijs gedurende 10 minuten.
- Oogsten van de cellen door het uitvoeren van centrifugeren bij 1.050 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Plaats de buizen en 10 electro-cuvettes op ijs. Voer de stappen uit 7.3-7,8 op ijs.
- Verwijder het supernatant en voeg toe 15 mL 1,2 M sorbitol. Voorzichtig schudden de buizen om resuspendeer de cellen.
- Centrifugeer de cellen bij 1050 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Herhaal stap 7.4 en 7.5. Verwijder het supernatant. 500 µL van 1,2 M sorbitol toevoegen aan elke buis en resuspendeer de cellen verzamelen van alle cellen in een 15-ml conische buis.
- Toevoegen van 1,2 M sorbitol tot 2,4 mL (OD600 = 10 per 0,2 mL). Houd de buis op ijs.
- Voeg 200 µL van sorbitol-geschorst cellen (zorg ervoor dat ze volledig zijn geschorst) een EP-buis met de fusion PCR construeren, meng goed en overbrengen van het monster naar een electro-cuvette.
- Electroporate de cellen met de volgende opties: schimmels, ShS (2.00kV, 1 puls).
- 600 µL van 1,2 M sorbitol toevoegen aan elke electro-cuvette voor een totaal volume van 800 µL, en verspreidde zich vervolgens de cellen op vier ja platen (200 µL/plaat). Tien electro-cuvettes zal afzien tot 40 Ja platen.
- Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 24 uur.
- Het uitvoeren van replica beplating aan ja + G418 en Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 3 dagen.
8. selectie van de Heterochromatin-destabiliserende mutanten en zoeken naar valse positieven
- Voor elke ja + G418 plaat, verrichten replica beplating aan ja-Ade (lage Ade) en de PMG-Ade (No Ade) platen. Incubeer de platen van de replica voor 1-2 dagen bij 30 ° C, tot enkele van de kolonies op de ja-Ade platen een rode verkleuring (figuur 1G tonen).
- Ja-Ade en PMG-Ade platen en selecteer de cellen die Toon roze of wit op de ja-Ade-plaat en groeien ook op de plaat PMG-Ade vergelijken. Selecteer kolonies zonder groei op PMG-Ade, niet zoals ze valse positieven (bijvoorbeeld als gevolg van zijn dat de cassette KAN is geïntegreerd op de site van een doelsoort elders in het genoom).
- Ongeveer 1 x 105 cellen kiezen uit elke kolonie en incubeer in 10 µL van SPZ oplossing bevattende 2,5 mg/mL zymolyase 100 T bij 37 ° C gedurende ten minste 30 min. gebruik 1 µL van deze oplossing uit te voeren als de startende sjabloon voor PCR (Figuur 1 H) van de kolonie.
- SPZ (50 mL) maken door het mengen van 30 mL 2 M sorbitol, 4.05 mL 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 en 15 mL gedestilleerd water (laatste pH, 7.5). Monsters (5 mL) kunnen worden aangevuld met zymolyase en opgeslagen in 500-µL aliquots bij-20 ° C tot gebruik.
- Uitvoeren van elektroforese van het gel (1,2% agarose gel, 180V, 20 min) om te visualiseren van de resultaten van + de PCR van de kolonie. Selecteer reacties die vertonen PCR bands van de juiste afmetingen en verteren 5 µL van elk reactieproduct met XhoI (4 U enzym, 1 x spijsvertering buffer, waterbad 37 ° C, 1 h) op het scherm uit valse positieven (Figuur 1 H).
- Voer de Elektroforese van het gel om te visualiseren van de XhoI -digests (1,2% Agarose gel, 180 V, 20 min). Mark de kolonies waarvan PCR producten worden gesneden door XhoI, en hen een patch aan ja + G418 platen (figuur 1I).
- GDNA uit de kernsplijting gistcellen isoleren en sequencing van het PCR producten23uit te voeren. Vergelijk de verkregen opeenvolging met de volgorde van de wild-type te identificeren van mutaties (figuur 1I).
- Direct opnieuw in te voeren de mutation(s) aan wild-type cellen door hen met fusion constructies versterkt door PCR van mutantcellen23om te zetten. Kunt spotten bevestigen het fenotype in de nieuw gemaakte mutantcellen (figuur 1J).
- Fusion transformatie construct kan gemakkelijk worden versterkt door PCR inleidingen p1 en p10 gebruik de genomic DNA van mutanten als de sjabloon in een totaal volume van 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reactie buffer), en de toepassing van de cycli van de reactie beschreven in tabel 2 . Transformatie van de constructie kan worden gedaan door het volgen van de stappen 7.1-7.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verworven mutanten van het Rpt4 door het volgen van de procedures die worden beschreven in afbeelding 1 kunnen door de beoordeling van de kleuren van de kolonies worden geanalyseerd. De kleuren van de kolonies zijn bevlekt op de relevante platen in het verminderen van het aantal cellen in Figuur 2. De ade6 + verslaggever ingevoegd op de heterochromatin regio in wild-type het zwijgen is opgelegd en toont rode kolonies in Ja-Ade plaat. Zodra de heterochromatin is gedestabiliseerd en de ade6 + -verslaggever wordt uitgedrukt, kunnen witte kolonies worden waargenomen in Ja-Ade plaat clr4Δ mutant. De afgeschermde Rpt4 mutanten worden getoond. rpt4-1 mutant toont de meest ernstige destabilisatie van de heterochromatin.
Figuur 1 : Schematische weergave van het protocol. (A) schematische weergave van het PCR product verkregen door de eerste ronde van PCR, die wordt uitgevoerd met inleidingen 1 en 2. (B) beperking gebaseerde klonen van het rpt4 + -fragment. (C) plaats-geleide mutagenese van de gekloonde vector wordt gebruikt om een stille mutatie die een XhoI beperkingsplaats toevoegt. (D) Random mutagenese voor de rpt4 + regio codering wordt uitgevoerd met behulp van foutgevoelige PCR. (E) het gemuteerde rpt4 + -fragment, het fragment KAN en het 3' UTR fragment worden vergezeld door fusie PCR voor het genereren van een transformatie-klaar-cassette. (F) Fission gistcellen worden omgezet met de fusie PCR constructie, die het endogene rpt4 + -reeks door homologe recombinatie vervangt. (G) KAN geselecteerde kolonies zijn replica verguld ja-Ade (lage Ade) en de PMG-Ade (No Ade) platen, en positieve kolonies zijn geselecteerd. (H) PCR en latere XhoI beperking van het PCR product worden gebruikt om te voorkomen dat valse positieven. (I) de mutatie waardoor het fenotype wordt geïdentificeerd door het patchen van de geselecteerde kolonies, de vermeerdering van cellen, winning van genomic DNA (gDNA), en de sequencing van het relevante gedeelte van rpt4 +. (J) oorzakelijke mutaties worden bevestigd (en valse positieven zijn uitgesloten) direct doordat de mutatie naar wild-type cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Heterochromatin ambtshalve repressie mutanten van Rpt4. Schematisch diagram van de otr1::ade6 + verslaggever (boven). 5-fold seriële verdunningen van select afgeschermde Rpt4 mutanten werden gespot op de aangegeven borden in volgorde van toenemende niveau van destabilisatie van de heterochromatin (onder). Dit cijfer is bewerkt uit het artikel 'de 19S proteasoom is rechtstreeks betrokken bij de regulering van heterochromatin verspreiden in kernsplijting gist' door Seo et al., 201724. De niet-bijgesneden figuur kan worden gevonden in het oorspronkelijke artikel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Component | Soort plaat | |
| JA | PMG | |
| Gistextract | 5 g/L | |
| Glucose | 30 g/L | 20 g/L |
| Adenine | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Histidine | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Leucine | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Uracil | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Kalium waterstof pthalate | 3 g/L | |
| NB2HPO4 | 2.2 g/L | |
| L-glutaminezuur | 3,75 g/L | |
| Zouten | 20 ml/L | |
| Vitaminen | 1 ml/L | |
| Mineralen | 0,1 ml/L | |
| Agar | 16 g/L | 16 g/L |
Tabel 1. Onderdelen van Ja en PMG platen
| Temperatuur | Tijd | Uitlaatgasnabehandelingssysteem |
| 95oC | 2 min | 1 cyclus |
| 95oC | 20 s | 30 cycli |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 cyclus |
| 8oC | Houd |
Tabel 2. Geadviseerde PCR programma voor plaats-geleide mutagenese
| Temperatuur | Tijd | Uitlaatgasnabehandelingssysteem |
| 95oC | 2 min | 1 cyclus |
| 95oC | 30 s | 19 cycli |
| 55oC | 1 min | |
| 72oC | 7 min | |
| 72oC | 10 min | 1 cyclus |
| 8oC | Houd |
Tabel 3. Geadviseerde PCR programma voor foutgevoelige PCR
| Temperatuur | Tijd | Uitlaatgasnabehandelingssysteem |
| 95oC | 2 min | 1 cyclus |
| 95oC | 20 s | 30 cycli |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 cyclus |
| 8oC | Houd |
Tabel 4. Aanbevolen PCR programma voor het verkrijgen van het fragment KAN
| Wijzigen | Aan | In het volgende voorbeeld geval van rpt4 + | |
| Sjabloon vector | pFA6a-3 ha-KANMX6 | ||
| Vector-bindende opeenvolging van p7 | ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | |
| Opknoping opeenvolging van p7 | De laatste 50bp-reeks, met inbegrip van de stop codon | ||
| Opknoping opeenvolging van p8 | De eerste reeks van de 50bp direct na de stop codon (bijkomende opeenvolging) | AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC | |
| Volgorde van p9 | Na de stop codon rechts starten | tgcacatatatccaaaaagccatgaa | |
| Volgorde van p10 | Produceren ~ 500bp fragment met p9 (aanvullende seqeucne) | TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC | |
Tabel 5. Veranderingen die nodig zijn wanneer de ADH-dag-nachtgrens wordt gebruikt in plaats van de endogene terminator
| Temperatuur | Tijd | Uitlaatgasnabehandelingssysteem |
| 95oC | 2 min | 1 cyclus |
| 95oC | 20 s | 30 cycli |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 1 min | |
| 72oC | 8 min | 1 cyclus |
| 8oC | Houd |
Tabel 6. Aanbevolen PCR programma voor het verkrijgen van de 3' UTR fragment
| Temperatuur | Tijd | Oprit | Uitlaatgasnabehandelingssysteem |
| 94oC | 2 min | 1 cyclus | |
| 94oC | 20 s | 10 cycli | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0.2 oC/s | |
| 94oC | 20 s | 5 cycli | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0.2 oC/s + 5 s/cyclus | |
| 94oC | 20 s | 10 cycli | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0.2 oC/s + 20 s/cyclus | |
| 72oC | 10 min | 1 cyclus | |
| 8oC | Houd |
Tabel 7. Geadviseerde PCR programma voor fusion PCR
| CBL1877 | h + | ade6-210 leu1-32 ura4-D18 otr1R (dg-glu) Sph1:ade6 |
Tabel S1: Stam gebruikt in deze studie
Tabel S2: Lijst van inleidingen gebruikt in deze studie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Willekeurige mutagenese via foutgevoelige PCR is een krachtig hulpmiddel voor het genereren van een diverse pool van mutanten in een bepaalde regio. Deze techniek is vooral handig voor studies die willen beoordelen van de functie van een eiwit onder een specifieke omstandigheden. Bijvoorbeeld, gebruikt wij hierin foutgevoelige PCR ter beoordeling van de functie van de 19S proteasoom subeenheid, Rpt4, in heterochromatin onderhoud. Door het variëren van de regio gericht door de foutgevoelige PCR en aanpassing van de voorwaarden van de screening, konden we muteren van cellen aan de genomic regio van belang en scherm voor het gewenste fenotype. Onlangs, een soortgelijke methode werd gebruikt voor het isoleren van kernsplijting gistcellen herbergen van mutaties in de spindel pole lichaam component25.
Het belangrijkste voordeel van willekeurige mutagenese is dat het kan worden toegepast op zowel niet-essentiële en essentiële genen. Willekeurige mutagenese van essentiële genen kan opleveren divers mutanten, zoals die met subtiele en/of gedeeltelijke functionele defecten waarmee de levensvatbaarheid van de cellen worden volgehouden, of mutanten waarvan de functies alleen onder een bepaalde voorwaarde worden beïnvloed. Een voorbeeld van dit laatste is een mutant temperatuurgevoelig. Dergelijke mutanten kunnen worden geïsoleerd met behulp van 5 mg/L-phloxine B, die stervende cellen in rode vlekken en laat langzaam groeiende cellen te onderscheiden van de stervende cellen26.
De kritieke stap van dit protocol is de gevoelig voor fouten PCR stap. Bij deze stap is het belangrijk om te controleren de mutatiefrequentie, die sterk afhankelijk van het aantal cycli van PCR en het aanvankelijke bedrag van sjabloon verschillen kan. Het is raadzaam dat de gebruiker het aantal cycli van PCR vaststellen en variëren van het aanvankelijke bedrag van de sjabloon, zoals we vonden dit een handiger strategie voor optimalisatie. Wij stellen vast dat de techniek van foutgevoelige PCR overal verkrijgbaar, voor decennia is. Als de gebruiker ervoor kiest, kunnen zij een methode voor het handmatig uitvoeren van foutgevoelige PCR27 zonder gebruik te maken van een commercieel beschikbare mutagenese kit inwinnen.
Als een waarschuwing is de valse positieve van dit protocol vrij hoog. Mutant kandidaten moeten dus, een aantal screenings bedoeld om onkruid uit de valse positieven ondergaan. We vonden dat de Stille opneming van een beperkingsplaats in het target-gen kan helpen te vermijden het onderwerp valse positieven met de relatief moeizaam stap van sequencing. Dit is kosteneffectief, aangezien de mutant kandidaten kunnen nummer in de honderden of zelfs buiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering van de steun voor dit project werd verstrekt door de fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap en ICT (2016R1A2B2006354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
- Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
- QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
- pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
- QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
- QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
- PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
- Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
- GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
- Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).
