Summary
Cet article décrit une méthodologie détaillée pour la mutagénèse aléatoire d’un gène cible chez la levure. À titre d’exemple, nous ciblons rpt4 +, qui code une sous-unité du protéasome 19 s et écran pour les mutations qui déstabilisent l’hétérochromatine.
Abstract
Mutagenèse aléatoire d’un gène cible est couramment utilisée pour identifier les mutations qui donnent le phénotype souhaité. Des méthodes qui peuvent être utilisés pour réaliser la mutagénèse aléatoire, erreurs PCR est une stratégie pratique et efficace pour générer un bassin diversifié des mutants (i.e., une bibliothèque mutante). Erreurs PCR est la méthode de choix quand un chercheur veut muter une région prédéfinie, comme la région codante d’un gène tout en laissant les autres régions génomiques pas affectée. Après que la bibliothèque mutante est amplifiée par PCR sujette aux erreurs, il doit être cloné dans un plasmide approprié. La taille de la bibliothèque générée par PCR erreurs est limitée par l’efficacité de l’étape de clonage. Toutefois, dans la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe, l’étape de clonage peut être remplacée par l’utilisation d’une fusion très efficace en une seule étape PCR pour générer des constructions pour la transformation. Mutants de phénotypes désirées peuvent sélectionner à l’aide de reporters appropriés. Nous décrivons ici cette stratégie en détail, par exemple, un journaliste inséré à l’hétérochromatine centromérique.
Introduction
La génétique vers l’avant est une méthode classique dans lequel chercheurs cherchent des mutants naturels qui présentent un phénotype particulier et effectuent des analyses génétiques. Dans la génétique inverse, les mutations sont introduites dans un gène d’intérêt et le phénotype est examiné. Dans ce dernier cas, la mutagénèse aléatoire d’un gène cible est souvent utilisé pour générer un groupe de mutants qui sont ensuite sélectionnés pour les phénotypes désirés, comme la sensibilité à la température ou modifié l’activité enzymatique. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour réaliser la mutagénèse aléatoire, y compris les erreurs PCR1; D’irradiation UV2; mutagènes chimiques, tels que le méthanesulfonate d’éthyle (EMS) ou l’acide nitreux3; l’utilisation de souches mutantes temporaire, telles que celles surexprimant mutD5 4; et ADN brassage5.
Nous décrivons ici une stratégie inverse-génétique dans laquelle nous utilisons Erreurs PCR pour générer des piscines mutantes d’un gène cible dans la levure de fission. Comme on pourrait le deviner de son nom, cette méthode génère des mutations en introduisant délibérément des erreurs pendant l’ACP. Contrairement aux autres méthodes de mutagenèse, erreurs PCR permet à l’utilisateur de définir la région à être mutagénisées tant. Ceci est particulièrement utile dans les efforts déployés pour étudier la fonction d’une protéine/domaine d’intérêt.
Pour illustrer cette procédure de mutagénèse aléatoire, dans les présentes utilisons-nous rpt4 +, qui code pour la sous-unité de protéasome 19 s, par exemple. Rpt4 a démontré avoir protéolyse indépendante des fonctions dans les organismes autres que fission levure6,7,8,9, et un défaut de protéolyse pourrait causer des effets indirects en altérant les protéines niveaux. Nous avons, par conséquent, projeté pour les mutants qui a déclenché les changements indépendants de protéolyse, dans le but d’étudier la fonction du protéasome sur hétérochromatine.
PCR erreurs peut être appliqué à n’importe quelle région du gène par le réglage de l’emplacement auquel lient les amorces. Mutants qui montrent le changement phénotypique souhaité peuvent être identifiés avec des journalistes appropriés. Ici, nous avons utilisé un journaliste ade6 + inséré au centromère 1 externe "répétition" (otr) région10. L’hétérochromatine constitutive est formé à cette région11, alors que le journaliste ade6 + est réduit au silence à l’état sauvage ; Ceci est indiqué par colonies rouges10. Une mutation qui déstabilise l’hétérochromatine constitutive au centromère donneront lieu à l’expression du reporter ade6 + qui est visualisée comme colonies blanches.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. préparation des médias
- Préparer extrait de levure avec suppléments (oui), oui sans adénine (Oui faible Ade), Pombe Glutamate moyen (PMG12) et PMG sans adénine (PMG-Ade) en mélangeant les composants tel que décrit dans le tableau 1. Oui-Ade (faible Ade) et plaques de PMG-Ade ont tous les mêmes composants, mais l’adénine est absent de ce dernier.
- Utiliser le stock de sel (50 x) suivants : 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L de KCl, 2 g/L Na2donc4 dans de l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.
- Utiliser la vitamine suivante (1, 000 x) stock : pantothénate de 1 g/L, 10 g/L d’acide nicotinique, inositol de 10 g/L, biotine de 10 mg/L dans l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.
- Utiliser le minéraux suivant (10, 000 x) stock : 5 g/L d’acide borique, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L d’acide citrique dans l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.
NOTE : Milieu Oui liquide est possible en omettant l’agar.
- Stériliser le milieu et refroidir en dessous de 60 ° C en remuant avec une barre de remuer, à raison de 200 tr/min.
- Pour plaques Oui + G418 (G418), ajouter 1 mL/L G418 solution stock au milieu Oui.
- Utilisez le G418 suivants (1, 000 x) stock : 100 mg/mL G418 dans l’eau distillée. Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm pores, aliquot à tubes à centrifuger 1,5 mL et magasin à-20 ° C.
- Remuez pendant un autre 5-10 min et partie aliquote les médias en Pétri de 90 mm (1 L de moyennes aliquotes à peu près 40 boîtes de Pétri. Stocker les plaques à 4 ° C.
2. clonage de rpt4 + et ses 5' / 3' UTR
- Effectuer des PCR avec des amorces p1 et p2 (Figure 1 a) à l’aide de fission yeast ADN génomique (ADNg) comme le modèle dans un volume total de 50 µL (~ 1 µg ADN, enzymes de U 20, 1 x tampon de réaction), et appliquant les cycles de réaction décrites dans le tableau 2 pour amplifier une base de 3 315 fragment de paires (bp) comprenant rpt4 + et ses 5' / 3' UTR. Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit de purification13 comme indiqué par le fabricant (Figure 1 a).
- Digérer les pBlueScript KS(-) vector14 et le fragment d’ADN amplifié contenant rpt4 + avec ses 5' / 3' UTR avec BamH1 et Xho1 dans un volume total de 20 µL (~ 1 µg d’ADN, 20 U enzyme, 1 tampon de digestion x) à 37 ° C dans un bain d’eau pour les 16-18 h (Figure 1 b).
- Gel de purifier le vecteur digéré (gel d’agarose de 1,2 %) et l’ADN insérer par électrophorèse sur gel d’agarose TAE-basé (100 V, 1 h), exciser les bandes d’ADN de la taille désirée et isoler l’ADN avec un gel extraction kit15.
- Ligaturer le vecteur et l’insert d’ADN à l’aide de T4 DNA ligase en effectuant une réaction de ligature de 20 µL contenant de 50 à 100 ng du vecteur ADN, un ~ 3 fois excès molaire de l’ADN de l’insert, 400 U T4 DNA ligase et 1 x tampon de ligature. Incuber le mélange à 18 ° C pendant 16-18 h.
- Transformer l’ADN ligaturé dans 100 µL d’e. coli DH5α en appliquant un choc thermique pour 70 s à 42 ° C. Ajouter 1 mL de LB et incuber pendant 1 heure à 37 ° C pendant la récupération. Effectuer la centrifugation (13 800 x g), jeter la surnageante, plaque tous les transformé e. coli cellules sur plaques LB-ampicilline (LA) et incuber à 37 ° C pendant 16 h.
- Prélever des colonies de 4-8 avec des cure-dents et cultiver une nuit à 37 ° C dans un milieu 3 mL LA.
- Isoler les plasmides avec un plasmide purification kit16 utilisés selon le protocole du fabricant et effectuez les digestions 5 µl analytique des enzymes de restriction du plasmide isolé, 5 U de chaque enzyme de restriction (BamH1 et Xho1) et 1 x tampon de restriction. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C au bain-marie pendant 3 h. confirmer le clonage en séquençant les plasmides de candidat.
3. introduction de la Mutation silencieuse (Site de Restriction deXho1 )
- Concevoir une paire d’amorces 33-bp (p3 et p4) qui contiennent la mutation souhaitée dans la séquence complémentaire dans le cas contraire.
- Effectuer des PCR avec haute fidélité polymérase17 (Figure 1) dans un volume total de 25 µL (10 ng de plasmide cloné, 2 µL de 10 mix amorce pmol, enzyme de U 2, 1 x tampon de réaction) en utilisant les paramètres répertoriés dans le tableau 3.
- Digérer le plasmide de modèle avec Dpnj’ai dans un volume total de 20 µL (20 enzyme U, 1 x tampon de digestion) à 37 ° C dans une eau de bain pour 1 h.
- Transformer, propager, isoler et séquencer le plasmide contenant la mutation silencieuse, tel que décrit dans les étapes 2,5-2,7.
Remarque : La mutation silencieuse peut également être introduite à l’aide d’une méthode de clonage qui permet d’assemblage des fragments d’ADN multiples en une seule réaction18.
4. aléatoire Mutagenesis of rpt4 + par PCR Erreurs
- Effectuer des erreurs PCR, utilisant le plasmide avec la mutation silencieuse (siteXho1 ) comme le modèle, amorces p5 et p6, un volume total de 50 µL (la quantité de modèle défini à l’étape 4.1.1, 2 µL du mélange de primer 10 pmol, 2,5 enzyme U, 1 tampon de réaction de x) , et une polymérase spéciale qui est conçue pour générer une erreur haute débit19 (Figure 1). Apportez PCR comme indiqué dans le tableau 2.
- 4-5 µg de plasmide modèle permettent de contrôler la fréquence de mutation de 1 bp/Ko (kilobases).
Remarque : Une concentration élevée (> 500 ng/µL) de plasmide, qui peut être obtenu à l’aide d’un kit de mini prep20, est nécessaire.
- 4-5 µg de plasmide modèle permettent de contrôler la fréquence de mutation de 1 bp/Ko (kilobases).
- Électrophorèse sur gel permet de confirmer un produit PCR de 2670 bp (1,2 % gel d’agarose). Gel de purifier ce produit de la PCR comme indiqué au point 2.5.
5. préparation de la Fusion des Fragments PCR (KAN, 3' UTR)
- Effectuer la PCR à l’aide de pFA6a-KANMX621 comme modèle, amorces p7 et p8, et les conditions énumérées dans le tableau 4 pour obtenir le fragment de marqueur (KAN). Gel de purifier le fragment 1 480-bp qui en résulte comme indiqué au point 2.5 (Figure 1E).
- Vérifiez si le codon du gène ciblé pour la mutation et de la région codante de ses gènes adjacents sont séparés par plus de 500 bp. Le terminateur endogène ne peut servir alors que cette région est inférieur à 500 bp ; plutôt, le terminateur d’ADH doit être utilisé au lieu de la terminaison endogène. Les modifications de protocole requises pour utiliser le terminateur ADH sont présentées au tableau 5.
Remarque : Ces modifications ne s’appliquent que lorsque le terminateur de l’ADH , qui est disponible dans le plasmide pFA6a-3 ha-KANMX6, est utilisé à la place le terminateur endogène.
- Vérifiez si le codon du gène ciblé pour la mutation et de la région codante de ses gènes adjacents sont séparés par plus de 500 bp. Le terminateur endogène ne peut servir alors que cette région est inférieur à 500 bp ; plutôt, le terminateur d’ADH doit être utilisé au lieu de la terminaison endogène. Les modifications de protocole requises pour utiliser le terminateur ADH sont présentées au tableau 5.
- Effectuer des PCR avec le cloné rpt4 +-contenant le vecteur comme le modèle et amorces p9 et p10 dans un volume total de 50 µL (20 ng de plasmide cloné, 2 µL de 10 mix amorce pmol, enzyme de U 2, 1 x tampon de réaction), en utilisant les conditions présentées dans le tableau 6. Gel de purifier le fragment d’UTR obtenu 506-bp 3' (Figure 1E).
6. la génération de la construction de la Transformation de Fusion PCR (Figure 1E)
- Préparer les 3 fragments (mutagénisé rpt4 +KAN et la région 3' UTR) à 50 ng/µL.
- Effectuer la fusion que PCR des trois fragments à l’aide d’amorces p11 et p12, tel que décrit dans le tableau 7. (Le protocole de fusion PCR est une modification du protocole original22.) Purifier le principal produit PCR 4 398-bp.
- Utilisez rpt4 +: KAN:3'UTR des fragments à un ratio de 1:3:1 pour des résultats optimaux.
Remarque : Le montant total de l’ADN de l’insert ne doit pas dépasser 500 ng. La quantité recommandée de rpt4 +: KAN:3'UTR est 50 ng:150 ng:50 ng. La région de mutagénisé est d’environ 1,6 Ko, donc le nombre de colonies de levures qui rendrait compte de toutes les combinaisons possibles de chaque base étant muté à trois autres minimum est de 1 600 x 3 = 4 800 colonies. Parce qu’une des réactions de transformation entraîne généralement des colonies de 400-500, au moins 10 réactions d’une valeur de fusion PCR construire est nécessaire. Ce besoin peut être vérifiée en augmentant tout simplement la quantité de réaction (c'est-à-dire, le nombre de tubes PCR) par un facteur de dix.
- Utilisez rpt4 +: KAN:3'UTR des fragments à un ratio de 1:3:1 pour des résultats optimaux.
7. transformation de levure par électroporation (Figure 1F)
- Inoculer levure à 10 mL de milieu Oui à saturation en incubant il pendant plus de 16 h.
- Diluer les cellules à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,2 dans 200 mL de milieu Oui et incuber à 30 ° C sous agitation pendant 5-6 h, à OD600 = 0,6 - 0,8.
- Concentrer les cellules à OD600 = 30, renoncer à quatre tubes coniques de 50 mL et refroidir sur glace pendant 10 min.
- Récolter les cellules en effectuant la centrifugation à 1 050 x g pendant 3 min à 4 ° C. Placer les tubes et 10 electro-cuves sur la glace. Effectuez les étapes 7.3 à 7,8 sur glace.
- Jeter le surnageant et ajouter 15 mL de 1,2 M sorbitol. Secouer doucement les tubes pour remettre en suspension les cellules.
- Centrifuger les cellules à 1050 x g pendant 3 min à 4 ° C.
- Répétez les étapes 7.4 et 7.5. Jeter le surnageant. Ajouter 500 µL de 1,2 M sorbitol dans chaque tube, remettre les cellules en suspension et recueillir toutes les cellules dans un tube conique de 15 ml.
- Ajouter 1,2 M sorbitol à 2,4 mL (OD600 = 10 / 0,2 mL). Maintenir le tube sur la glace.
- Ajouter 200 µL de cellules sorbitol-suspendu (Assurez-vous qu’ils sont totalement suspendus) dans un tube de EP contenant la fusion PCR construire, bien mélanger et transférer l’échantillon dans une cuvette-electro.
- Electroporate les cellules avec les options suivantes : champignons, ShS (2.00kV, 1 impulsion).
- Ajouter 600 µL de 1,2 M sorbitol à chaque electro-cuvette pour un volume total de 800 µL et s’étend ensuite les cellules sur quatre assiettes Oui (200 µL/plaque). Dix electro-cuvettes distribuera à 40 Oui plaques.
- Incuber les plaques à 30 ° C pendant 24 h.
- Exécuter l’électrodéposition de réplique pour YES + G418 et incuber les boîtes à 30 ° C pendant 3 jours.
8. sélection des Mutants hétérochromatine-déstabilisant et en recherchant les faux positifs
- Pour chaque plaque Oui + G418, effectuer le placage réplique à Oui-Ade (faible Ade) et plaques de PMG-Ade (N° Ade). Incuber les boîtes de répliques pendant 1 à 2 jours à 30 ° C, jusqu'à ce que certaines des colonies sur les plaques Oui-Ade montrent une coloration rouge (Figure 1).
- Comparer les plaques Oui-Ade et PMG-Ade et sélectionner des cellules qui montrent les rose ou gris sur la plaque de YES-Ade et poussent également sur la plaque de la PMG-Ade. Ne sélectionnez pas de colonies sans croissance sur PMG-Ade, car ils sont des faux positifs (par exemple, ce qui reflète que la cassette KAN a été intégrée à un site non visés ailleurs dans le génome).
- Prendre environ 1 x 105 cellules de chaque colonie et incuber à 10 µL de solution SPZ contenant 2,5 mg/mL zymolyase 100 T à 37 ° C pendant au moins 30 min. utilisation 1 µL de cette solution pour réaliser que le modèle de départ pour colony PCR (Figure 1 H).
- Faire SPZ (50 mL) en mélangeant 30 mL 2 M sorbitol, 4,05 mL 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 et 15 mL d’eau distillée (pH final, 7,5). Échantillons (5 mL) peuvent être complétées avec zymolyase et conservées en aliquotes de 500 µL à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Effectuer l’électrophorèse sur gel (gel d’agarose à 1.2 %, 180V, 20 min) pour visualiser les résultats de + la PCR sur colonie. Sélectionnez les réactions qui présentent des bandes PCR de taille correcte et digèrent 5 µL de chaque produit de la réaction avec XhoI (4 enzyme U, 1 tampon de digestion x, bain-marie à 37 ° C, 1 h) pour écarter les faux positifs (Figure 1 H).
- Effectuer l’électrophorèse sur gel pour visualiser les XhoI condensés (1,2 % gel d’Agarose, 180 V, 20 min). Marquer les colonies dont les produits PCR sont recoupées par XhoIet leur patch Oui + G418 plaques (Figure 1I).
- Isoler ADNg provenant des cellules de levure de fission et de réaliser le séquençage des produits PCR23. Comparer la séquence obtenue avec la séquence de type sauvage à identifier les mutations (Figure 1I).
- Directement ré-introduire le mutation(s) à cellules de type sauvage en les transformant avec fusion des constructions amplifiées par PCR à partir de cellules mutantes23. Utilisez le spotting pour confirmer le phénotype dans les cellules mutantes nouvellement formées (Figure 1J).
- Construction de transformation de fusion peut facilement être amplifiée par PCR avec des amorces p1 et p10 utilisant l’ADN génomique de mutants comme modèle dans un volume total de 50 µL (~ 1 µg ADN, enzymes de U 20, 1 x tampon de réaction) et en appliquant les cycles de réaction décrites dans tableau 2 . Transformation de la construction peut être faite en suivant les étapes 7.1-7.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les mutants Rpt4 acquises en suivant les procédures décrites dans la Figure 1 peuvent être analysés en évaluant les couleurs des colonies. Les couleurs des colonies sont repérées sur les plaques pertinentes en diminuant le nombre de cellules dans la Figure 2. Le journaliste ade6 + inséré dans la région de l’hétérochromatine est réduit au silence dans le type sauvage et montre des colonies rouges en plaque Oui-Ade. Une fois l’hétérochromatine est déstabilisé et le journaliste ade6 + s’exprime, colonies blanches peuvent être observés en plaque Oui-Ade comme clr4Δ mutant. Les mutants Rpt4 filtrés sont indiquées. mutant RPT4-1 montre la déstabilisation de l’hétérochromatine plus sévère.
Figure 1 : Représentation schématique du protocole. (A) représentation schématique du produit PCR obtenus par le premier tour de l’ACP, qui s’effectue avec des amorces 1 et 2. (B) Restriction clonage du fragment rpt4 + . (C) la mutagénèse dirigée du vecteur cloné est utilisée pour introduire une mutation silencieuse qui ajoute un site de restriction XhoI . (D) mutagenèse aléatoire du rpt4 + région codante est effectuée à l’aide de la PCR d’erreurs. (E) le fragment muté rpt4 + , le fragment de KAN et le fragment 3' UTR sont rejoints par fusion PCR pour générer une cassette de transformation orientée. (F) les cellules de levure de Fission sont transforment avec la fusion construct PCR, qui remplace la séquence endogène rpt4 + par recombinaison homologue. (G) colonies KAN sélectionnés sont réplique plaqué à Oui-Ade (faible Ade) et plaques de PMG-Ade (N° Ade) et colonies positives sont sélectionnés. (H) PCR et ultérieures XhoI restriction du produit PCR sont utilisés pour éviter les faux positifs. (I) la mutation qui cause le phénotype est identifiée par rapiéçage des colonies choisies, la propagation des cellules, extraction de l’ADN génomique (ADNg) et le séquençage de la part de rpt4 +. (J) les mutations causatifs sont confirmées (et faux positifs sont exclus) en introduisant directement la mutation de cellules de type sauvage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Des mutants de la répression de l’hétérochromatine de Rpt4. Diagramme schématique du reporter otr1::ade6 + (en haut). 5 fois des dilutions successives de sélection filtré Rpt4 mutants ont été repérées sur les plaques indiquées par ordre croissant de niveau de déstabilisation de l’hétérochromatine (en bas). Ce chiffre a été modifié de l’article « le protéasome 19 s est directement impliqué dans la régulation de l’hétérochromatine répand chez la levure » par Seo et coll., 201724. La figure non cultivées se trouvent dans l’article original. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Composant | Type de plaque | |
| OUI | PMG | |
| Extrait de levure | 5 g/L | |
| Glucose | 30 g/L | 20 g/L |
| Adénine | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Histidine | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Leucine | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Uracile | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Dipthalate d’hydrogène de potassium | 3 g/L | |
| Na2HPO4 | 2,2 g/L | |
| Acide L-glutamique | 3.75 g/L | |
| Sels de | 20 ml/L | |
| Vitamines | 1 ml/L | |
| Minéraux | 0,1 ml/L | |
| Agar | 16 g/L | 16 g/L |
Le tableau 1. Composants de YES et plaques PMG
| Température | Temps | Ou les cycles |
| 95oC | 2 min | 1 cycle |
| 95oC | 20 s | 30 cycles |
| 55oC | 30 s | |
| C 72o | 2 min | |
| C 72o | 8 min | 1 cycle |
| 8oC | Maintenez |
Le tableau 2. Programme recommandé de PCR pour la mutagénèse dirigée
| Température | Temps | Ou les cycles |
| 95oC | 2 min | 1 cycle |
| 95oC | 30 s | 19 cycles |
| 55oC | 1 min | |
| C 72o | 7 min | |
| C 72o | 10 min | 1 cycle |
| 8oC | Maintenez |
Tableau 3. Programme recommandé de PCR PCR Erreurs
| Température | Temps | Ou les cycles |
| 95oC | 2 min | 1 cycle |
| 95oC | 20 s | 30 cycles |
| 55oC | 30 s | |
| C 72o | 2 min | |
| C 72o | 8 min | 1 cycle |
| 8oC | Maintenez |
Tableau 4. Recommandé programme PCR pour obtenir le fragment KAN
| Changement | À | Exemple de cas de rpt4 + | |
| Template vecteur | pFA6a-3 ha-KANMX6 | ||
| Séquence de liaison de vecteur de p7 | ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | |
| Séquence de la pendaison de p7 | La dernière séquence de 50bp y compris le codon stop | ||
| Séquence de la pendaison de p8 | La première séquence de 50bp juste après le codon (séquence complémentaire) | AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC | |
| Séquence de p9 | Mettre à droite après le codon stop | tgcacatatatccaaaaagccatgaa | |
| Séquence de p10 | Produire ~ 500bp fragment avec p9 (seqeucne complémentaire) | TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC | |
Tableau 5. Changements nécessaires lorsque le terminator ADH est utilisé au lieu de la terminaison endogène
| Température | Temps | Ou les cycles |
| 95oC | 2 min | 1 cycle |
| 95oC | 20 s | 30 cycles |
| 55oC | 30 s | |
| C 72o | 1 min | |
| C 72o | 8 min | 1 cycle |
| 8oC | Maintenez |
Tableau 6. Recommandé programme PCR pour obtenir le fragment 3' UTR
| Température | Temps | Rampe | Ou les cycles |
| C 94o | 2 min | 1 cycle | |
| C 94o | 20 s | 10 cycles | |
| 70oC | 1 de 3 | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| C 68o | 02:30 min | 0,2 oC/s | |
| C 94o | 20 s | 5 cycles | |
| 70oC | 1 de 3 | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| C 68o | 02:30 min | 0,2 oC/s + 5 s/cycle | |
| C 94o | 20 s | 10 cycles | |
| 70oC | 1 de 3 | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| C 68o | 02:30 min | 0,2 oC/s + 20 s/cycle | |
| C 72o | 10 min | 1 cycle | |
| 8oC | Maintenez |
Tableau 7. Programme recommandé de PCR pour fusion PCR
| CBL1877 | h + | otr1R ADE6-210 leu1-32 ura4-D18 (dg-glu) Sph1:ade6 |
Tableau S1 : Souche utilisée dans cette étude
Tableau S2 : Liste des amorces utilisées dans cette étude
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutagenèse aléatoire via Erreurs PCR est un puissant outil pour générer un bassin diversifié de mutants dans une région donnée. Cette technique est particulièrement utile pour les études visant à évaluer la fonction d’une protéine dans une circonstance particulière. Par exemple, nous avons utilisé ici Erreurs PCR afin d’évaluer la fonction de la sous-unité de protéasome 19 s, Rpt4, dans l’entretien de l’hétérochromatine. En faisant varier la région ciblée par la PCR erreurs et ajuster les conditions de projection, nous avons pu muter des cellules à la région génomique d’intérêt et d’écran pour le phénotype souhaité. Récemment, une méthode similaire a été utilisée pour isoler les cellules de levure de fission hébergeant des mutations dans l’axe pôle corps composant25.
Le principal avantage de la mutagénèse aléatoire, c’est qu’elle peut s’appliquer à des gènes non essentiels et indispensables. Mutagenèse aléatoire des gènes essentiels peut produire divers mutants, comme ceux présentant des défauts fonctionnels subtiles et/ou partielles qui permettent la viabilité cellulaire de se maintenir, ou mutants dont les fonctions sont affectées uniquement dans des conditions spécifiques. Un exemple de ce dernier est un mutant sensible à la température. Ces mutants peuvent être isolés à l’aide de 5 mg/L phloxine B qui souille les cellules mourants en rouge et permet aux cellules de croissance lente à distinguer de cellules26en train de mourir.
L’étape critique du présent protocole est l’étape sujette de la PCR. À cette étape, il est important de contrôler la fréquence de mutation, qui peut varier considérablement en fonction du nombre de cycles PCR et le montant initial de modèle. Nous recommandons que l’utilisateur fixe le nombre de cycles PCR et modifier le montant initial du modèle, nous avons trouvé ceci pour être une stratégie plus commode pour l’optimisation. Nous notons que la technique de PCR Erreurs largement existe depuis des décennies. Si l’utilisateur choisit, ils peuvent chercher une méthode pour exécuter manuellement les erreurs PCR27 sans utiliser un kit de mutagenèse disponibles dans le commerce.
Comme une mise en garde, le taux de faux positifs de ce protocole est assez élevé. Ainsi, mutants candidats doivent subir une série de projections destinées à éliminer les faux positifs. Nous avons trouvé que l’incorporation silencieuse d’un site de restriction du gène cible peut aider à éviter la nécessité de faux positifs de sujet à l’étape relativement laborieuse de séquençage. C’est rentable, car les candidats mutants mai numéro des centaines ou même au-delà.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Soutien pour ce projet a été financé par le programme de recherche sciences fondamentales grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science et de la TIC (2016R1A2B2006354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
- Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
- QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
- pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
- QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
- QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
- PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
- Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
- GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
- Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).
