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Genetics

जीन लक्षित यादृच्छिक Mutagenesis का चयन करने के लिए Heterochromatin-स्थिर Proteasome म्यूटेंट विखंडन खमीर में

Published: May 15, 2018 doi: 10.3791/57499
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

Summary

यह लेख विखंडन खमीर में एक लक्ष्य जीन के यादृच्छिक mutagenesis के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन है । एक उदाहरण के रूप में, हम लक्ष्य rpt4 +, जो 19S proteasome के एक उपइकाई सांकेतिक शब्दों में बदलना, और स्क्रीन उत्परिवर्तनों कि heterochromatin अस्थिर करने के लिए ।

Abstract

यादृच्छिक एक लक्ष्य जीन के mutagenesis सामांयतः उत्परिवर्तनों कि वांछित phenotype उपज की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । तरीकों कि यादृच्छिक mutagenesis, त्रुटि प्रवण पीसीआर को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक विविध पूल म्यूटेंट (यानी, एक उत्परिवर्ती पुस्तकालय) पैदा करने के लिए एक सुविधाजनक और कुशल रणनीति है । त्रुटि-प्रवण पीसीआर पसंद की विधि है जब एक शोधकर्ता एक पूर्व निर्धारित क्षेत्र, जैसे एक जीन की कोडिंग क्षेत्र के रूप में बदलना चाहता है, जबकि अंय जीनोमिक क्षेत्रों छोड़ने अप्रभावित । उत्परिवर्ती पुस्तकालय त्रुटि-प्रवण पीसीआर द्वारा परिलक्षित होता है के बाद, यह एक उपयुक्त प्लाज्मिड में क्लोन किया जाना चाहिए । त्रुटि प्रवण पीसीआर द्वारा उत्पन्न पुस्तकालय का आकार क्लोनिंग कदम की दक्षता से विवश है ।. हालांकि, विखंडन खमीर में, Schizosaccharomyces pombe, क्लोनिंग कदम एक अत्यधिक कुशल एक कदम फ्यूजन पीसीआर के उपयोग के लिए परिवर्तन के लिए निर्माण उत्पंन करने के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है । वांछित phenotypes के म्यूटेंट उपयुक्त पत्रकारों का उपयोग कर चुने जा सकते हैं । यहां, हम विस्तार से इस रणनीति का वर्णन, एक उदाहरण के रूप में ले, एक संवाददाता centromeric heterochromatin में डाला ।

Introduction

आगे जेनेटिक्स एक शास्त्रीय विधि है जिसमें शोधकर्ताओं ने स्वाभाविक रूप से होने वाली म्यूटेंट की तलाश है कि एक विशेष phenotype प्रदर्शन, और आनुवंशिक विश्लेषण करते हैं । रिवर्स आनुवंशिकी में, उत्परिवर्तनों ब्याज की एक जीन में पेश कर रहे है और phenotype की जांच की है । उत्तरार्द्ध मामले में, एक लक्ष्य जीन के यादृच्छिक mutagenesis अक्सर म्यूटेंट के एक पूल है कि बाद में इस तरह के तापमान संवेदनशीलता या बदल एंजाइमी गतिविधि के रूप में वांछित phenotypes, के लिए चुना जाता है उत्पंन किया जाता है । यादृच्छिक mutagenesis प्राप्त करने के लिए विभिन्न विधियों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें त्रुटि-प्रवण पीसीआर1; यूवी विकिरण2; रासायनिक mutagens, जैसे एथिल methanesulfonate (ईएमएस) या नाइट्रस एसिड३; ऐसे उन पर व्यक्त mutD5 4के रूप में अस्थाई रूपांतरक उपभेदों, का उपयोग करें; और डीएनए फेरबदल5.

यहां, हम एक रिवर्स आनुवंशिकी रणनीति जिसमें हम त्रुटि प्रवण पीसीआर का उपयोग करने के लिए विखंडन खमीर में एक लक्ष्य जीन के लिए उत्परिवर्ती पूल उत्पंन का वर्णन । के रूप में एक अपने नाम से लगता है कि हो सकता है, इस विधि जानबूझकर पीसीआर के दौरान त्रुटियों को शुरू करने से उत्परिवर्तनों उत्पंन करता है । अन्य mutagenesis तरीकों के विपरीत, त्रुटि प्रवण पीसीआर उपयोगकर्ता mutagenized होने के लिए क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है । यह एक प्रोटीन के समारोह का अध्ययन करने के प्रयासों में यह विशेष रूप से उपयोगी बनाता है/

इस यादृच्छिक mutagenesis प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए, हम इस के साथ साथ rpt4 +का उपयोग करें, जो 19S proteasome उपइकाई encodes एक उदाहरण के रूप में । Rpt4 विखंडन खमीर6,7,8,9, और प्रोटियोलिसिस में एक दोष के अलावा अंय जीवों में प्रोटियोलिसिस-स्वतंत्र कार्य किया है दिखाया गया है अप्रत्यक्ष प्रभाव में फेरबदल के कारण हो सकता है प्रोटीन स्तर. हम इसलिए, म्यूटेंट के लिए जांच की है कि प्रोटियोलिसिस-स्वतंत्र परिवर्तन ट्रिगर, heterochromatin पर proteasome के समारोह की छानबीन के लक्ष्य के साथ ।

त्रुटि प्रवण पीसीआर किसी भी जीन क्षेत्र में स्थान है जिस पर प्राइमरों बांध ट्यूनिंग द्वारा लागू किया जा सकता है । म्यूटेंट कि वांछित phenotypic परिवर्तन प्रदर्शन उचित पत्रकारों के साथ पहचाना जा सकता है । यहां, हम एक ade6 + centromere 1 बाहरी दोहराने (ओटीआर) क्षेत्र10में डाला रिपोर्टर का उपयोग किया । गठित heterochromatin इस क्षेत्र में11है, तो ade6 + रिपोर्टर जंगली प्रकार की हालत में मौन है का गठन किया है; यह लाल कालोनियों से संकेत मिलता है10. एक उत्परिवर्तन है कि centromere में गठित heterochromatin को अस्थिर ade6 + रिपोर्टर, जो सफेद कालोनियों के रूप में visualized है की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व करेंगे ।

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Protocol

1. मीडिया की तैयारी

  1. खुराक के साथ खमीर निकालने तैयार (हां), हां बिना adenine (हां कम Ade), Pombe ग्लूटामेट मध्यम (पीएमजी12), और पीएमजी बिना adenine (पीएमजी-Ade) के घटकों को मिलाकर के रूप में 1 तालिकामें वर्णित है । हां-Ade (कम Ade) और पीएमजी-Ade प्लेट्स सभी एक ही घटक है, लेकिन adenine बाद से लोप है ।
    1. निम्न नमक (50x) शेयर का प्रयोग करें: ५२.५ g/l MgCl2· 6H2o, 2 g/l CaCl2· 2H2हे, ५० g/l KCl, 2 g/l ना2तो4 आसुत जल में । फ़िल्टर एक ०.२२-µm ताकना आकार फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    2. निंनलिखित विटामिन (1, 000x) स्टॉक: 1 g/l पैंटोफेनेट, 10 g/l कोर्टेक्स एसिड, 10 ग्राम/l inositol, 10 मिलीग्राम/l बायोटिन आसुत जल में उपयोग करें । फ़िल्टर एक ०.२२-µm ताकना आकार फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    3. निंनलिखित खनिज (10, 000x) स्टॉक का प्रयोग करें: 5 जी/l बोरिक एसिड, 4 जी/l MnSO4, 4 g/l ZnSO4· 7H2हे, 2 g/l FeCl2· 4H2o, ०.४ g/l मू3, 1 g/l KI, ०.४ g/l CuSO4· 5H2हे , आसुत जल में 10 ग्राम/एल साइट्रिक एसिड । फ़िल्टर एक ०.२२-µm ताकना आकार फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
      नोट: हाँ तरल माध्यम आगार का लोप करके बनाया जा सकता है ।
  2. मध्यम आटोक्लेव और यह ६० डिग्री सेल्सियस नीचे करने के लिए ठंडा जबकि एक हलचल बार के साथ सरगर्मी, २०० rpm की दर से ।
  3. हां + G418 (geneticin) प्लेट्स के लिए, यस मीडियम में 1 एमएल/L G418 स्टॉक सॉल्यूशन जोड़ें ।
    1. निम्न G418 (1, 000x) का उपयोग करें स्टॉक: १०० मिलीग्राम/एमएल G418 आसुत जल में । एक ०.२२-µm ताकना आकार फिल्टर, aliquot १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों का उपयोग कर बंध्याकरण फ़िल्टर, और दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
  4. एक और 5-10 मिनट के लिए हिलाओ और ९० में मीडिया aliquot mm पेट्री व्यंजन (मध्यम aliquots के 1 एल लगभग ४० पेट्री व्यंजन के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की दुकान ।

2. rpt4 + की क्लोनिंग और उसके 5 '/3 ' UTRs

  1. ५० µ एल की कुल मात्रा में टेम्पलेट के रूप में विखंडन खमीर जीनोमिक डीएनए (gDNA) का उपयोग कर प्राइमरी p1 और p2 (चित्र 1a) के साथ पीसीआर प्रदर्शन (~ 1 µ जी डीएनए, 20 यू एंजाइम, 1x प्रतिक्रिया बफर), और एक ३,३१५-आधार बढ़ाना तालिका 2 में वर्णित प्रतिक्रिया चक्र लागू करने जोड़ी (बीपी) टुकड़ा शामिल rpt4 + और उसके 5 '/3 ' UTRs । निर्माता (चित्रा 1a) के निर्देशानुसार एक शुद्धि किट13 का उपयोग करते हुए पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करना ।
  2. डाइजेस्ट pBlueScript KS (-) वेक्टर14 और प्रवर्धित डीएनए टुकड़ा युक्त rpt4 + के साथ अपने 5 '/3 ' UTRs के साथ BamH1 और Xho1 की कुल मात्रा में 20 µ एल (~ 1 µ जी डीएनए, 20 यू एंजाइम, 1x पाचन बफर) ३७ डिग्री सेल्सियस में एक जल स्नान में 16-18 के लिए h (चित्र 1b) ।
  3. जेल को शुद्ध पच वेक्टर (१.२% agarose जेल) और डीएनए डालने के द्वारा प्रदर्शन ताे आधारित agarose जेल ट्रो (१०० V, 1 ज), वांछित आकार के डीएनए बैंड एक्साइज, और एक जेल निष्कर्षण किट के साथ डीएनए अलग15।
  4. Ligate वेक्टर और डीएनए एक 20-µ एल बंधाव प्रतिक्रिया ५०-१०० वेक्टर डीएनए, एक ~ 3-डालें डीएनए, ४०० यू टी-4 डीएनए दाढ़, और 1x ligase बफर के अधिक से अधिक के एनजी से युक्त प्रदर्शन द्वारा टी-4 डीएनए ligase का उपयोग कर डालें । 16-18 एच के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर इस मिश्रण की मशीन ।
  5. ४२ डिग्री सेल्सियस पर ७० एस के लिए गर्मी सदमे लागू करके ई. कोलाई DH5α के १०० µ एल में ligated डीएनए रूपांतरण । पौंड की 1 मिलीलीटर जोड़ें और वसूली के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मशीन । प्रदर्शन (१३,८०० x g), supernatant, प्लेट के सभी बदल ई. कोलाई कोशिकाओं के पौंड-एम्पीसिलीन (LA) प्लेटों पर, और 16 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन त्यागें ।
  6. toothpicks के साथ 4-8 कालोनियों उठाओ और 3 मिलीलीटर ला मध्यम में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर हो जाना ।
  7. एक प्लाज्मिड शोधन किट के साथ plasmids को अलग16 निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इस्तेमाल किया और अलग प्लाज्मिड के 5 µ एल के साथ विश्लेषणात्मक प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट प्रदर्शन, प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम के 5 यू (BamH1 और Xho1) और 1x प्रतिबंध बफ़र । 3 घंटे के लिए एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण की मशीन sequencing उंमीदवार plasmids द्वारा क्लोनिंग की पुष्टि करें ।

३. मूक उत्परिवर्तन (Xho1 प्रतिबन्ध स्थल) का परिचय

  1. डिजाइन ३३ की एक जोड़ी-बीपी प्राइमर (पी 4 और p) है कि अंयथा पूरक अनुक्रम में वांछित उत्परिवर्तन होते हैं ।
  2. उच्च निष्ठा के साथ पीसीआर प्रदर्शन पोलीमरेज़17 (चित्रा 1C) की कुल मात्रा में 25 µ l (10 क्लोन प्लाज्मिड के एनजी, 2 µ एल के 10 pmol प्राइमर मिक्स, 2 यू एंजाइम, 1x प्रतिक्रिया बफर) सायक्लिंग पैरामीटर का उपयोग कर तालिका 3में सूचीबद्ध ।
  3. 1 एच के लिए एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 µ एल (20 यू एंजाइम, 1x पाचन बफर) की कुल मात्रा में Dpnमैं के साथ टेंपलेट प्लाज्मिड डाइजेस्ट ।
  4. रूपांतरण, प्रचार, अलग, और प्लाज्मिड मूक उत्परिवर्तन युक्त अनुक्रम, के रूप में कदम २.५-२.७ में वर्णित है ।
    नोट: मूक उत्परिवर्तन भी एक क्लोनिंग विधि है जो एक एकल प्रतिक्रिया18में कई डीएनए टुकड़े के शामिल होने के लिए अनुमति देता है का उपयोग कर शुरू किया जा सकता है ।

4. त्रुटि-प्रवण पीसीआर द्वारा rpt4 + का रैंडम Mutagenesis

  1. त्रुटि प्रवण पीसीआर प्रदर्शन, मूक उत्परिवर्तन के साथ प्लाज्मिड का प्रयोग (Xho1 site) के रूप में टें पलेट, प्राइमरी p5 और p6, ५० µ l की कुल मात्रा (कदम शुू में परिभाषित टें पलेट की राशि, 10 µ प्राइमरी मिक्स के 2 pmol l, २.५ यू एंजाइम, 1x रिएक्शन बफर) , और एक विशेष पोलीमरेज़ है कि एक उच्च त्रुटि दर19 (चित्रा 1 डी) उत्पंन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । तालिका 2में वर्णित के रूप में पीसीआर निष्पादित करें ।
    1. का प्रयोग करें 4-5 टेंपलेट के µ जी प्लाज्मिड 1 बीपी/केबी (kilobase) को उत्परिवर्तन आवृत्ति को नियंत्रित करने के लिए ।
      नोट: एक उच्च एकाग्रता (> 500 एनजी/µ एल) प्लाज्मिड, जो एक मिनी तैयारी का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है किट20, आवश्यक है ।
  2. का प्रयोग करें जेल ट्रो २६७० bp (१.२% agarose जेल) के एक पीसीआर उत्पाद की पुष्टि करने के लिए । जेल २.५ कदम में वर्णित के रूप में इस पीसीआर उत्पाद शुद्ध ।

5. फ्यूजन पीसीआर टुकड़े की तैयारी (कान, 3 ' UTR)

  1. pFA6a-KANMX621 के रूप में टेम्पलेट, प्राइमरी p7 और p8, और मार्कर (कान) अंश प्राप्त करने के लिए तालिका 4 में सूचीबद्ध शर्तों का उपयोग कर पीसीआर निष्पादित करें । जेल २.५ चरण (चित्रा 1E) में वर्णित के रूप में परिणामी १,४८०-bp टुकड़ा शुद्ध ।
    1. जांच करें कि क्या उत्परिवर्तन के लिए लक्षित जीन के stop codon और उसके निकटवर्ती जीन के कोडन क्षेत्र से अधिक ५०० बीपी से अलग कर रहे हैं । अंतर्जात टर्मिनेटर जब इस क्षेत्र से कम है उपयोग नहीं किया जा सकता है ५०० bp; बल्कि, आढ टर्मिनेटर के बजाय अंतर्जात टर्मिनेटर का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । प्रोटोकॉल आढ टर्मिनेटर का उपयोग करने के लिए आवश्यक परिवर्तन तालिका 5में प्रस्तुत कर रहे हैं ।
      नोट: ये बदलाव तभी लागू होते हैं जब आढ टर्मिनेटर, जो कि pFA6a-3HA-KANMX6 प्लाज्मिड में उपलब्ध है, के बजाय अंतर्जात टर्मिनेटर का प्रयोग किया जाता है ।
  2. क्लोन rpt4 +के साथ पीसीआर प्रदर्शन-वेक्टर युक्त टेंपलेट और प्राइमरों के रूप में p9 और p10 की कुल मात्रा में ५० µ एल (क्लोन प्लाज्मिड के एनजी 20, 2 µ एल के 10 pmol प्राइमर मिक्स, 2 यू एंजाइम, 1x प्रतिक्रिया बफर), तालिका 6में प्रस्तुत की शर्तों का उपयोग कर । जेल प्राप्त ५०६-बीपी 3 ' UTR टुकड़ा शुद्ध (चित्रा 1E) ।

6. परिवर्तन फ्यूजन पीसीआर (चित्रा 1E) द्वारा निर्माण की जनरेशन

  1. 3 टुकड़े तैयार (mutagenized rpt4 +, कान, और 3 ' UTR) ५० एनजी पर/µ एल
  2. प्राइमरी p11 और p12 का उपयोग करते हुए तीन टुकड़ों के फ्यूजन पीसीआर प्रदर्शन, के रूप में तालिका 7 में वर्णित है । (फ्यूजन पीसीआर के लिए प्रोटोकॉल मूल प्रोटोकॉल के एक संशोधन है22.) प्रमुख ४,३९८-बीपी पीसीआर उत्पाद को शुद्ध ।
    1. 1:3:1 के अनुपात में इष्टतम परिणामों के लिए rpt4 +: कान: 3 ' UTR टुकड़े का उपयोग करें ।
      नोट: संमिलित डीएनए की कुल राशि ५०० एनजी से अधिक नहीं होना चाहिए । की सिफारिश की राशि rpt4 +: कान: 3 ' UTR ५० एनजी है: 150 एनजी: 50 एनजी । mutagenized क्षेत्र लगभग १.६ केबी है, तो खमीर कालोनियों की ंयूनतम संख्या है कि प्रत्येक आधार के सभी संभव संयोजनों के लिए खाते में अंय तीन में रूपांतरित किया जा रहा है १,६०० x 3 = ४,८०० कालोनियों है । क्योंकि एक परिवर्तन प्रतिक्रिया आम तौर पर पैदावार ४००-५०० कालोनियों, फ्यूजन पीसीआर के निर्माण के लायक कम से 10 प्रतिक्रियाओं की जरूरत है । इस जरूरत को सिर्फ प्रतिक्रिया राशि (यानी, पीसीआर ट्यूबों की संख्या) दस के एक पहलू से बढ़ कर पूरा किया जा सकता है ।

7. Electroporation द्वारा विखंडन खमीर के परिवर्तन (चित्रा 1F)

  1. Inoculate से अधिक 16 एच के लिए यह मशीन द्वारा संतृप्ति के लिए हां मध्यम के 10 मिलीलीटर के लिए खमीर
  2. ६०० एनएम (ओडी६००) में ०.२ के २०० मिलीलीटर में एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए कोशिकाओं को पतला हां मध्यम और 30 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के लिए मिलाते के साथ है 5-6 एच, आयुध डिपो केलिए ६०० = ०.६-०.८ ।
  3. आयुध डिपो६०० = 30 के लिए कोशिकाओं पर ध्यान दें, 10 मिनट के लिए ४ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों और बर्फ पर ठंडा करने के लिए वितरण ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए १,०५० x g पर केंद्रापसारक प्रदर्शन द्वारा कोशिकाओं फसल । ट्यूबों और 10 इलेक्ट्रो-बर्फ पर cuvettes प्लेस । ७.३-७.८ बर्फ पर चरण निष्पादित करें ।
  5. supernatant को त्यागें और १.२ मीटर सोर्बिटोल की 15 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे ट्यूबों हिला कोशिकाओं reसस्पेंड करने के लिए ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए १०५० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  7. चरण ७.४ और ७.५ दोहराएँ । supernatant को त्यागें । प्रत्येक ट्यूब के लिए १.२ मीटर सोर्बिटोल के ५०० µ एल जोड़ें, कोशिकाओं reसस्पेंड, और १ १५ एमएल शंकु ट्यूब में कोशिकाओं के सभी इकट्ठा ।
  8. जोड़ें १.२ M सोर्बिटोल अप करने के लिए २.४ मिलीलीटर (आयुध डिपो६०० = 10 प्रति ०.२ मिलीलीटर) । बर्फ पर ट्यूब रखें ।
  9. सोर्बिटोल-निलंबित कोशिकाओं के २०० µ एल जोड़ें (यकीन है कि वे पूरी तरह से निलंबित कर रहे हैं) एक EP ट्यूब फ्यूजन पीसीआर का निर्माण युक्त, अच्छी तरह से मिश्रण है, और एक इलेक्ट्रो-cuvette नमूना हस्तांतरण ।
  10. निम्नलिखित विकल्पों के साथ कोशिकाओं को Electroporate: कवक, ShS (2.00 केवी, 1 पल्स).
  11. ८०० µ एल की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक इलेक्ट्रो-cuvette के लिए १.२ मीटर सोर्बिटोल के ६०० µ एल जोड़ें, और फिर चार हाँ प्लेटों (२०० µ एल/प्लेट) पर कोशिकाओं को फैला. दस इलेक्ट्रो-cuvettes ४० हां प्लेटों को बांटना होगा ।
  12. 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट्स की मशीन
  13. हाँ + G418 करने के लिए प्रतिकृति चढ़ाना प्रदर्शन और 3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें मशीन ।

8. Heterochromatin-स्थिर म्यूटेंट का चयन और झूठी सकारात्मक के लिए जाँच

  1. प्रत्येक हां + G418 प्लेट के लिए, हां करने के लिए प्रतिकृति चढ़ाना प्रदर्शन-Ade (कम Ade) और पीएमजी-Ade (कोई Ade) प्लेटें । 30 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 दिनों के लिए प्रतिकृति प्लेटें, जब तक हां-Ade प्लेटों पर कालोनियों में से कुछ एक लाल रंगाई(चित्रा 1G) दिखाते हैं ।
  2. यस-Ade और पीएमजी-Ade प्लेट्स और चुनिंदा कोशिकाओं की तुलना करें जो हां-Ade प्लेट पर पिंक या वाइट दिखाती हैं और पीएमजी-Ade प्लेट पर भी बढ़ती हैं । पीएमजी-Ade पर विकास के बिना कालोनियों का चयन न करें, क्योंकि वे झूठी सकारात्मक है (उदाहरण के लिए, प्रतिबिंबित करता है कि कान कैसेट एक गैर में एकीकृत किया गया है लक्ष्य जीनोम में कहीं और साइट) ।
  3. लगभग 1 एक्स 105 कोशिकाओं प्रत्येक कॉलोनी से उठाओ और SPZ समाधान के 10 µ एल में मशीन २.५ मिलीग्राम/एमएल zymolyase १०० टी से कम 30 मिनट के लिए ३७ ° c में युक्त । कॉलोनी पीसीआर (चित्रा1) के लिए शुरू टेम्पलेट के रूप में प्रदर्शन करने के लिए इस समाधान के 1 µ l का उपयोग करें ।
    1. SPZ (५० मिलीलीटर) को मिलाकर 30 मिलीलीटर 2 मीटर सोर्बिटोल, ४.०५ मिलीलीटर की 1 मीटर एनए2HPO4, ०.९५ एमएल णः2पीओ4 और आसुत जल की 15 मिलीलीटर (अंतिम पीएच, ७.५) । नमूनों (5 मिलीलीटर) zymolyase के साथ पूरक किया जा सकता है और उपयोग करने तक-20 डिग्री सेल्सियस पर ५००-µ l aliquots में संग्रहीत ।
  4. प्रदर्शन जेल ट्रो (१.२% agarose जेल, 180V, 20 मिनट) के परिणामों की कल्पना करने के लिए + कॉलोनी पीसीआर । चुनें प्रतिक्रियाओं कि उचित आकार के पीसीआर बैंड का प्रदर्शन और डाइजेस्ट 5 µ एल के साथ प्रत्येक प्रतिक्रिया उत्पाद के Xhoमैं (4 यू एंजाइम, 1x पाचन बफर, ३७ ° c जल स्नान, 1 ज) झूठी सकारात्मक बाहर स्क्रीन करने के लिए (चित्रा१).
  5. XhoI डाइजेस्टs (१.२% Agarose जेल, १८० V, 20 min) की कल्पना करने के लिए जेल ट्रो निष्पादित करें । उन कालोनियों को चिह्नित करें जिनके पीसीआर उत्पादों को XhoIद्वारा काटा जाता है, और उंहें हां + G418 प्लेट्स (फिगर 1I) पर पैच करें ।
  6. विखंडन खमीर कोशिकाओं से gDNA अलग और पीसीआर उत्पादों के अनुक्रमण प्रदर्शन23। (चित्रा 1I) उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए जंगली प्रकार के अनुक्रम के साथ प्राप्त अनुक्रम की तुलना करें ।
  7. सीधे पुन: उत्परिवर्तन (ओं) को संलयन के साथ उंहें बदलने से जंगली प्रकार की कोशिकाओं परिचय के उत्परिवर्ती कोशिकाओं23से पीसीआर द्वारा परिवर्धित निर्माण । नई मेड उत्परिवर्ती कोशिकाओं (चित्रा 1J) में phenotype की पुष्टि करने के लिए खोलना का प्रयोग करें ।
    1. फ्यूजन परिवर्तन का निर्माण आसानी से प्राइमर p1 और ५० µ एल (~ 1 µ जी डीएनए, 20 यू एंजाइम, 1x प्रतिक्रिया बफर) की कुल मात्रा में टेंपलेट के रूप में म्यूटेंट के जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर p10 के साथ पीसीआर द्वारा परिवर्धित किया जा सकता है, और प्रतिक्रिया चक्र 2 तालिका में वर्णित लागू करने . निर्माण के परिवर्तन ७.१-७.१३ चरणों का पालन करके किया जा सकता है ।

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Representative Results

चित्रा 1 में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करते हुए अधिग्रहित Rpt4 म्यूटेंट को कालोनियों के रंगों का आंकलन कर विश्लेषण किया जा सकता है । कालोनियों के रंग चित्रा 2में कम सेल संख्या में प्रासंगिक प्लेटों पर देखा जाता है । heterochromatin क्षेत्र में डाला गया ade6 + रिपोर्टर जंगली प्रकार में मौन है और हाँ-Ade प्लेट में लाल कालोनियों से पता चलता है । एक बार heterochromatin अस्थिर है और ade6 + रिपोर्टर व्यक्त की है, सफेद कालोनियों में हां में देखा जा सकता है- clr4Δ उत्परिवर्ती के रूप में Ade प्लेट । दिखलाई Rpt4 म्यूटेंट के रूप में दर्शाए गए हैं । rpt4-1 उत्परिवर्ती सबसे गंभीर heterochromatin स्थिरीकरण से पता चलता है ।

Figure 1
चित्र 1 : प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (क) पीसीआर के पहले दौर, जो प्राइमरों 1 और 2 के साथ किया जाता है द्वारा प्राप्त पीसीआर उत्पाद का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (ख) rpt4 + टुकड़ा के प्रतिबंध आधारित क्लोनिंग । (ग) साइट-क्लोन वेक्टर के निर्देश mutagenesis एक मूक उत्परिवर्तन है कि एक XhoI प्रतिबंध साइट कहते है लागू किया जाता है । (घ) rpt4 + कोडिंग क्षेत्र के यादृच्छिक mutagenesis त्रुटि प्रवण पीसीआर का उपयोग किया जाता है । (ङ) रूपांतरित rpt4 + टुकड़ा, कान टुकड़ा, और 3 ' UTR टुकड़ा फ्यूजन पीसीआर से जुड़े हुए है एक परिवर्तन के लिए तैयार कैसेट उत्पंन कर रहे हैं । (च) विखंडन खमीर कोशिकाओं फ्यूजन पीसीआर निर्माण, जो मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा अंतर्जात rpt4 + अनुक्रम की जगह के साथ बदल रहे हैं । (G) कान-चयनित कालोनियों को यस-Ade (Low Ade) और पीएमजी-Ade (No Ade) प्लेट्स पर प्रतिकृति चढ़ाया जाता है, और धनात्मक कालोनियों का चयन किया जाता है । (ज) पीसीआर और बाद में पीसीआर उत्पाद के XhoI प्रतिबंध झूठी सकारात्मक से बचने के लिए उपयोग किया जाता है । (I) उत्परिवर्तन है कि phenotype का कारण बनता है चयनित कालोनियों, कोशिकाओं के प्रसार, जीनोमिक डीएनए के निष्कर्षण (gDNA), और rpt4 +के प्रासंगिक भाग के अनुक्रमण द्वारा की पहचान की है । (जंमू) करणीय उत्परिवर्तनों की पुष्टि कर रहे है (और झूठी सकारात्मक से इंकार कर रहे हैं) सीधे जंगली प्रकार की कोशिकाओं को उत्परिवर्तन शुरू करने से । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : Heterochromatin डे-Rpt4 का दमन म्यूटेंट. otr1 के योजनाबद्ध आरेख :: ade6 + रिपोर्टर (ऊपर) । heterochromatin स्थिरीकरण (नीचे) के स्तर में वृद्धि के क्रम में संकेत प्लेटों पर 5-गुना सीरियल कमजोर पड़ने का चयन करें Rpt4 म्यूटेंट देखा गया । यह आंकड़ा लेख ' से संशोधित किया गया था 19S proteasome सीधे heterochromatin के विनियमन में शामिल है विखंडन खमीर में फैल ' एसईओ एट अल द्वारा, २०१७24। गैर फसली आंकड़ा मूल लेख में पाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

घटक प्लेट का प्रकार
हाँ पीएमजी
खमीर निकालें 5 g/L
ग्लूकोज 30 g/L 20 g/L
Adenine ०.१५ g/L 0.1 g/L
Histidine ०.१५ g/L 0.1 g/L
Leucine ०.१५ g/L 0.1 g/L
Uracil ०.१५ g/L 0.1 g/L
पोटेशियम हाइड्रोजन pthalate 3 g/L
ना२HPO४ २.२ g/L
L-glutamic अम्ल ३.७५ g/L
लवण 20 एमएल/एल
विटामिन 1 एमएल/एल
खनिज ०.१ एमएल/एल
आगर 16 g/L 16 g/L

तालिका 1. हां और पीएमजी प्लेट्स के अवयव

तापमान समय सायकल (ओं)
९५ओसी 2 min 1 चक्र
९५ओसी 20 एस 30 चक्र
५५ओसी 30 एस
७२ओसी 2 min
७२ओसी 8 min 1 चक्र
8ओसी पकड़

तालिका 2. साइट के लिए अनुशंसित पीसीआर कार्यक्रम-निर्देशित mutagenesis

तापमान समय सायकल (ओं)
९५ओसी 2 min 1 चक्र
९५ओसी 30 एस 19 चक्र
५५ओसी 1 min
७२ओसी 7 min
७२ओसी 10 min 1 चक्र
8ओसी पकड़

तालिका 3. त्रुटि प्रवण पीसीआर के लिए अनुशंसित पीसीआर कार्यक्रम

तापमान समय सायकल (ओं)
९५ओसी 2 min 1 चक्र
९५ओसी 20 एस 30 चक्र
५५ओसी 30 एस
७२ओसी 2 min
७२ओसी 8 min 1 चक्र
8ओसी पकड़

तालिका 4. कान टुकड़ा प्राप्त करने के लिए अनुशंसित पीसीआर कार्यक्रम

बदल को rpt4 के उदाहरण मामले +
टेम्पलेट वेक्टर pFA6a-3HA-KANMX6
वेक्टर-p7 के अनुक्रम बाइंडिंग ATTACGCTGCTCAGTGCTGA ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA
p7 का हैंगिंग सीक्वेंस रोक codon सहित अंतिम 50bp अनुक्रम
p8 का हैंगिंग सीक्वेंस पहला 50bp अनुक्रम सही के बाद stop codon (पूरक अनुक्रम) AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC
p9 का अनुक्रम बंद के बाद सही शुरू codon tgcacatatatccaaaaagccatgaa
p10 का अनुक्रम उत्पादन ~ p9 के साथ 500bp टुकड़ा (पूरक seqeucne) TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC

तालिका 5. परिवर्तन की जरूरत है जब आढ टर्मिनेटर अंतर्जात टर्मिनेटर के बजाय प्रयोग किया जाता है

तापमान समय सायकल (ओं)
९५ओसी 2 min 1 चक्र
९५ओसी 20 एस 30 चक्र
५५ओसी 30 एस
७२ओसी 1 min
७२ओसी 8 min 1 चक्र
8ओसी पकड़

तालिका 6. 3 ' UTR टुकड़ा प्राप्त करने के लिए अनुशंसित पीसीआर कार्यक्रम

तापमान समय रैंप सायकल (ओं)
९४ओसी 2 min 1 चक्र
९४ओसी 20 एस 10 चक्र
७०ओसी 1 s
५५ओसी 30 एस ०.१ ओसी एस/
६८ओसी 2:30 मिनट ०.२ ओसी एस/
९४ओसी 20 एस 5 चक्र
७०ओसी 1 s
५५ओसी 30 एस ०.१ ओसी एस/
६८ओसी 2:30 मिनट ०.२ oC/एस + 5 एस साइकिल/
९४ओसी 20 एस 10 चक्र
७०ओसी 1 s
५५ओसी 30 एस ०.१ ओसी एस/
६८ओसी 2:30 मिनट ०.२ oC/एस + 20 एस साइकिल/
७२ओसी 10 min 1 चक्र
8ओसी पकड़

तालिका 7. फ्यूजन पीसीआर के लिए अनुशंसित पीसीआर कार्यक्रम

CBL1877 h + ade6-210 leu1-32 ura4-D18 otr1R (dg-glu) Sph1: ade6

तालिका s: इस अध्ययन में प्रयुक्त तनाव


तालिका S2: इस अध्ययन में प्रयुक्त प्राइमरों की सूची

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Discussion

त्रुटि-प्रवण पीसीआर के माध्यम यादृच्छिक mutagenesis एक दिए गए क्षेत्र में म्यूटेंट के एक विविध पूल पैदा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । यह तकनीक विशेष रूप से अध्ययन के लिए उपयोगी है जो किसी विशिष्ट परिस्थिति में प्रोटीन के कार्य का आकलन करना चाहते हैं । उदाहरण के लिए, हम इस 19S proteasome उपइकाई, Rpt4, heterochromatin रखरखाव के समारोह का आकलन करने के लिए त्रुटि प्रवण पीसीआर का इस्तेमाल किया । त्रुटि प्रवण पीसीआर द्वारा लक्षित क्षेत्र अलग और स्क्रीनिंग की स्थिति को समायोजित करके, हम वांछित phenotype के लिए ब्याज और स्क्रीन के जीनोमिक क्षेत्र में कोशिकाओं रूपांतरित करने में सक्षम थे । हाल ही में, एक ऐसी ही विधि के विखंडन खमीर धुरी ध्रुव शरीर घटक में उत्परिवर्तनों बंदरगाह कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था25।

यादृच्छिक mutagenesis के प्रमुख लाभ यह है कि यह दोनों गैर आवश्यक और आवश्यक जीन के लिए लागू किया जा सकता है । आवश्यक जीन की यादृच्छिक mutagenesis विविध म्यूटेंट, जैसे सूक्ष्म और/या आंशिक कार्यात्मक दोष है कि सेल व्यवहार्यता निरंतर होने की अनुमति, या म्यूटेंट जिसका कार्य केवल एक विशिष्ट शर्त के तहत प्रभावित होते है के साथ उन के रूप में उपज सकता है । बाद का एक उदाहरण के तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्ती है । इस तरह के म्यूटेंट का उपयोग कर अलग किया जा सकता है 5 mg/L phloxine B, जो लाल रंग में मरने वाले कोशिकाओं दाग और धीमी गति से बढ़ती कोशिकाओं को मरने कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है26.

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम त्रुटि प्रवण पीसीआर कदम है । इस कदम पर, यह उत्परिवर्तन आवृत्ति को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो व्यापक रूप से पीसीआर चक्र की संख्या और टेम्पलेट की प्रारंभिक राशि के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । हम अनुशंसा करते है कि उपयोगकर्ता पीसीआर चक्र की संख्या तय करने और टेंपलेट की प्रारंभिक राशि बदलती है, जैसा कि हम इस पाया अनुकूलन के लिए एक और अधिक सुविधाजनक रणनीति है । हम ध्यान दें कि त्रुटि प्रवण पीसीआर की तकनीक व्यापक रूप से दशकों के लिए उपलब्ध किया गया है । उपयोगकर्ता चुनता है, तो वे मैन्युअल रूप से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध mutagenesis किट का उपयोग किए बिना त्रुटि प्रवण पीसीआर27 करने के लिए एक विधि की तलाश कर सकते हैं ।

एक सावधानी के रूप में, इस प्रोटोकॉल की झूठी सकारात्मक दर बल्कि उच्च है । इस प्रकार, उत्परिवर्ती उंमीदवारों को झूठी सकारात्मक बाहर मातम करने के लिए इरादा प्रदर्शन की एक श्रृंखला से गुजरना चाहिए । हमने पाया है कि मूक लक्ष्य जीन में एक प्रतिबंध साइट के शामिल करने के लिए अनुक्रमण के अपेक्षाकृत श्रमसाध्य कदम के लिए झूठी सकारात्मक विषय की जरूरत से बचने में मदद कर सकते हैं । यह लागत प्रभावी है, के रूप में उत्परिवर्ती उंमीदवारों सैकड़ों में संख्या या भी परे हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना के लिए फंडिंग सहायता को बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित विज्ञान एवं आईसीटी (2016R1A2B2006354) के माध्यम से प्रदान किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Media
Glucose Sigma-Aldrich G8270-10KG
Yeast extract BD Biosciences 212720
L-Leucine JUNSEI 87070-0310
Adenine sulfate ACR 16363-0250
Uracil  Sigma-Aldrich U0750
L-Histidine Sigma-Aldrich H8125
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1.05108.0050
NaCl JUNSEI 19015-0350
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 63140
CaCl2 Sigma-Aldrich 12095
Potassium phthalate Sigma-Aldrich P6758-500g
Inositol Sigma-Aldrich I7508-50G
Biotin Sigma-Aldrich B4501-100MG
Boric Acid Sigma-Aldrich B6768-1KG
MnSO4 Sigma-Aldrich M7634-500G
ZnSO4•7H2O  JUNSEI 83060-031
FeCl2•4H2O KANTO CB8943686
Sodium molybdate dihydrate YAKURI 31621
KI JUNSEI 80090-0301
CuSO4•5H2O YAKURI 09605
D-myo-inositol MP biomedicals 102052
Pantothenate YAKURI 26003
Nicotinic Acid Sigma-Aldrich N4126-500G
(NH4)2SO4  Sigma-Aldrich A4418-100G
Agarose Biobasic D0012
G418, geneticin LPS G41805
2. Enzyme reactions
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aglient 600380 For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit Aglient 200500 For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F-530L For fusion PCR
Ex Taq DNA Polymerase Takara RR001b For general PCR
BamH1 New England BioLabs R0136S
Xho1 New England BioLabs R0146S
Dpn1 New England BioLabs R0176S
3. Equipment
Velveteen square, black VWR 89033-116 For replica
Replica-plating tool VWR 25395-380 For replica
MicroPulser Electroporator Biorad 1652100  For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap Biorad 1652086  For fission yeast transformation
Thermal Cycler Bioer BYQ6078 For fusion PCR ramp reaction 

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References

  1. Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
  2. Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
  3. Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
  4. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  5. Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
  6. Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
  7. Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
  10. Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
  11. Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
  12. Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
  13. QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
  14. pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
  15. QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
  16. QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
  17. PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
  18. Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
  19. GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
  20. Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
  21. Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  22. Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
  23. Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
  24. Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
  25. Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
  26. Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
  27. Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).

Tags

जेनेटिक्स अंक १३५ रैंडम mutagenesis विखंडन खमीर heterochromatin त्रुटि प्रवण पीसीआर centromere जीन लक्ष्यीकरण
जीन लक्षित यादृच्छिक Mutagenesis का चयन करने के लिए Heterochromatin-स्थिर Proteasome म्यूटेंट विखंडन खमीर में
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Seo, H. D., Lee, D. Gene-targeted… More

Seo, H. D., Lee, D. Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast. J. Vis. Exp. (135), e57499, doi:10.3791/57499 (2018).

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