Summary
Denna artikel beskriver en detaljerad metod för slumpmässig mutagenes av en målgenen i fission jäst. Som ett exempel riktar vi rpt4 +, som kodar en subenhet 19S proteasom och skärmen för mutationer att destabilisera Heterokromatin.
Abstract
Slumpmässig mutagenes av en målgenen används ofta för att identifiera mutationer som ger den önska fenotypen. Av de metoder som kan användas för att uppnå slumpmässig mutagenes, felbenägna PCR är en bekväm och effektiv strategi för att skapa en mångsidig pool av mutanter (dvs., en mutant bibliotek). Felbenägen PCR är metoden för val när en forskare söker att mutera en fördefinierade region, såsom kodande regionen av en gen medan andra genomisk regioner påverkas. Efter mutant biblioteket förstärks av felbenägna PCR, måste det vara klonade in en lämplig plasmid. Storleken på de bibliotek som genererat med felbenägna PCR begränsas av effektiviteten i steget kloning. Dock i fission jästen, Schizosaccharomyces pombe, kan steget kloning ersättas genom användning av en högeffektiv one-step fusion PCR att generera konstruktioner för omvandling. Mutanter av önskad fenotyper kan sedan väljas med lämpliga reportrar. Här, beskriver vi denna strategi i detalj, tar som ett exempel, en reporter som infogas vid centromeric Heterokromatin.
Introduction
Framåt genetik är en klassisk metod där forskare söka naturligt förekommande mutanter som visar en viss fenotyp, och utföra genetiska analyser. I omvänd genetik, mutationer införs en gen av intresse och fenotypen undersöks. I det senare fallet används slumpmässig mutagenes av en målgenen ofta för att generera en pool av mutanter som väljs därefter för önskad fenotyper, såsom temperatur känslighet eller förändrad enzymaktivitet. Olika metoder kan användas för att uppnå slumpmässig mutagenes, inklusive felbenägen PCR1; UV bestrålning2; kemiska mutagener, såsom etyl methanesulfonate (EMS) eller salpetersyrlighet3; användningen av tillfälliga mutator stammar, såsom de som alltför uttrycker mutD5 4; och DNA blanda5.
Här beskriver vi en omvänd-genetik strategi där vi använder felbenägen PCR för att generera mutant pooler för en målgenen i fission jästen. Som man kan gissa från namnet, genererar denna metod mutationer genom att medvetet införa fel under PCR. Till skillnad från andra mutagenes metoder tillåter felbenägna PCR användaren att definiera regionen att vara mutagenized. Detta gör det särskilt användbart i arbetet med att studera funktionen hos ett protein/domän av intresse.
För att demonstrera proceduren slumpmässig mutagenes, använda vi häri rpt4 +, som kodar den 19S proteasom subuniten, som ett exempel. Rpt4 har visat sig ha proteolys-oberoende funktioner i organismer än kärnklyvning jäst6,7,8,9, och en defekt proteolys kan orsaka indirekta effekter genom att ändra proteiner nivåer. Vi därför screenas för mutanter som utlöste proteolys-oberoende förändringar, med målet att undersöka funktionen av proteasom på Heterokromatin.
Felbenägen PCR kan tillämpas på någon gen region genom att trimma den plats där primers binder. Mutanter som uppvisar den önskade fenotypiska förändringen kan identifieras med lämpliga reportrar. Här, vi utnyttjade en ade6 + reporter infogas på Centromeren 1 yttre upprepa (otr) region10. Konstitutivt Heterokromatin bildas på denna region11, så ade6 + reportern är tystade i vildtyp skick; Detta indikeras med röd kolonier10. En mutation som destabiliserar den konstitutivt Heterokromatin på Centromeren kommer att leda till ett uttryck för ade6 + reportern, som visualiseras som vita kolonier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelse av Media
- Förbered jästextrakt med kosttillskott (Ja), ja utan adenin (Ja låg Ade), Pombe Glutamate medium (PMG12) och PMG utan adenin (PMG-Ade) genom att blanda komponenterna som beskrivs i tabell 1. Ja-Ade (låg Ade) och PMG-Ade plattor har alla samma komponenter, men adenin utelämnas från den senare.
- Använda det följande salt (50 x)-lagret: 52,5 HB MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na2så4 i destillerat vatten. Filter sterilisera med 0,22 µm porstorlek filter och förvaras vid 4 ° C.
- Använd följande vitamin (1, 000 x) lager: 1 g/L pantothenate, 10 g/L nikotinsyra, 10 g/L inositol, 10 mg/L biotin i destillerat vatten. Filter sterilisera med 0,22 µm porstorlek filter och förvaras vid 4 ° C.
- Använd följande mineral (10, 000 x) lager: 5 g/L borsyra, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L citronsyra i destillerat vatten. Filter sterilisera med 0,22 µm porstorlek filter och förvaras vid 4 ° C.
Obs: Ja flytande medium kan göras genom att utelämna ägarn.
- Autoklav medium och kyla den till under 60 ° C under omrörning med en uppståndelse bar, med en hastighet av 200 rpm.
- För Ja + G418 (geneticin) tallrikar, Lägg till 1 mL/L G418 stamlösning till Ja medium.
- Använda den följande G418 (1, 000 x) lager: 100 mg/mL G418 i destillerat vatten. Filter sterilisera med 0,22 µm porstorlek filter, alikvotens till 1,5 mL centrifugrör och store vid-20 ° C.
- Rör i ytterligare 5-10 min och alikvot media i 90-mm petriskålar (1 L medium alikvoter till ungefär 40 petriskålar. Lagra plattorna vid 4 ° C.
2. kloning av rpt4 + och dess 5' / 3' utr
- Utföra PCR primers p1 och p2 (figur 1A) med fission jäst genomiskt DNA (gDNA) som mall i en total volym på 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reaktion buffert), och tillämpa de reaktion cykler som beskrivs i tabell 2 att förstärka en 3 315-base par (bp) fragment bestående av rpt4 + och dess 5' / 3' utr. Rena PCR-produkten med hjälp av en rening kit13 enligt anvisningar från tillverkaren (figur 1A).
- Smälta den pBlueScript KS(-) vector14 och de amplifierade DNA-fragment som innehåller rpt4 + med dess 5' / 3' utr med BamH1 och Xho1 i en total volym på 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x matsmältningen buffert) vid 37 ° C i ett vattenbad för 16-18 h (figur 1B).
- Gel rena smält vektorn (1,2% agarosgel) och DNA infoga genom att utföra TAE-baserade agaros gel-elektrofores (100 V, 1 h), excising DNA banden av de önskade storlekarna och isolera DNA med en gel utvinning kit15.
- Ligera den vektor och DNA infoga använda T4 DNA-ligase genom att utföra en 20-µL ligering reaktion som innehåller 50-100 ng vektorns DNA, en ~ 3-faldig molar överskott av Infoga DNA, 400 U T4 DNA-ligase och 1 x ligering buffert. Inkubera denna blandning vid 18 ° C i 16-18 h.
- Omvandla ligated DNA till 100 µL av E. coli DH5α genom att tillämpa värme chock för 70 s vid 42 ° C. Tillsätt 1 mL LB och inkubera i 1 timme vid 37 ° C för återvinning. Utföra centrifugering (13.800 x g), Kassera supernatanten, plattan alla den transformerade E. coli celler på LB-Ampicillin (LA) tallrikar och inkubera vid 37 ° C i 16 h.
- Plocka 4-8 kolonier med tandpetare och växa över natten vid 37 ° C i 3 mL LA medium.
- Isolera plasmidsna med en plasmid rening kit16 används enligt tillverkarens protokoll och utföra analytisk restriktionsenzym tumörheterogenitet med 5 µL av isolerade plasmiden, 5 U i varje restriktionsenzym (BamH1 och Xho1) och 1 x begränsning buffert. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C i ett vattenbad för 3 h. Bekräfta kloning genom att sekvensera kandidat plasmider.
3. Introduktion av tyst Mutation (Xho1 begränsning webbplats)
- Designa ett par 33-bp-primers (p3 och p4) som innehåller önskad mutationen i sekvensen annars kompletterande.
- Utföra PCR med HiFi-polymeras17 (figur 1 c) i en total volym på 25 µL (10 ng av klonade plasmid, 2 µL 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reaktion buffert) med cykling parametrar som anges i tabell 3.
- Smälta mall plasmiden med DpnI en total volym på 20 µL (20 U enzym, 1 x matsmältningen buffert) vid 37 ° C i ett vatten bad för 1 h.
- Omvandla, sprida, isolera och sekvens plasmiden som innehåller den tyst mutationen, som beskrivs i steg 2,5-2,7.
Obs: Den tyst mutationen kan också införas med en kloning metod som gör det möjligt för sammanfogning av flera DNA-fragment i en enda reaktion18.
4. slumpmässig mutagenes rpt4 + med felbenägna PCR
- Utföra felbenägen PCR, använder plasmiden med tyst mutation (Xho1 plats) som mallen, primers p5 och p6, en total volym på 50 µL (mängden mall som definierats i steg 4.1.1, 2 µL 10 pmol primer mix, 2,5 U enzym, 1 x reaktion buffert) , och en särskild polymeras som syftar till att skapa en hög fel Betygsätt19 (figur 1 d). Utför PCR som beskrivs i tabell 2.
- Använd 4-5 µg mall plasmiden för att styra mutationsfrekvensen till 1 bp/kb (kilobase).
Obs: En hög koncentration (> 500 ng/µL) av plasmid, som kan erhållas med hjälp av en mini prep kit20, krävs.
- Använd 4-5 µg mall plasmiden för att styra mutationsfrekvensen till 1 bp/kb (kilobase).
- Använd gelelektrofores för att bekräfta en PCR produkt av 2670 bp (1,2% agarosgel). Gel rena PCR-produkten som beskrivs i steg 2.5.
5. beredning av Fusion PCR-fragmenten (KAN, 3' UTR)
- Utför PCR med pFA6a-KANMX621 som mall, primers p7 och p8 och villkor som anges i tabell 4 för att få den markör (KAN) fragmenten. Gel som renar det resulterande 1 480-bp-fragmentet som beskrivs i steg 2.5 (figur 1E).
- Kontrollera om den stop kodon av genen måltavlan för mutation och dess intilliggande gen kodande regionen avgränsas med mer än 500 bp. Den endogena terminatorn kan inte användas när denna region är mindre än 500 bp; snarare, ADH terminatorn bör användas i stället för den endogena terminatorn. Protokoll ändringar krävs för att använda ADH terminatorn presenteras i tabell 5.
Obs: Dessa ändringar gäller endast när ADH terminatorn, som finns i pFA6a-3HA-KANMX6 plasmiden, används i stället för den endogena terminatorn.
- Kontrollera om den stop kodon av genen måltavlan för mutation och dess intilliggande gen kodande regionen avgränsas med mer än 500 bp. Den endogena terminatorn kan inte användas när denna region är mindre än 500 bp; snarare, ADH terminatorn bör användas i stället för den endogena terminatorn. Protokoll ändringar krävs för att använda ADH terminatorn presenteras i tabell 5.
- Utföra PCR med klonade rpt4 +-innehållande vektor som mall och primers p9 och p10 i en total volym på 50 µL (20 ng av klonade plasmiden, 2 µL 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reaktion buffert), med de villkor som presenteras i tabell 6. Gel rena erhållna 506-bp 3' UTR fragmentet (figur 1E).
6. generering av den omvandling konstruktionen av Fusion PCR (figur 1E)
- Förbered 3 fragment (mutagenized rpt4 +, KAN och den 3' UTR) på 50 ng/µL.
- Utföra fusion PCR av tre fragment med primers p11 och p12, som beskrivs i tabell 7. (Protokollet för fusion PCR är en ändring av den ursprungliga protokoll22.) Rena stora 4 398-bp PCR-produkten.
- Använda rpt4 +: KAN:3'UTR fragment i förhållandet 1:3:1 för optimalt resultat.
Obs: Den totala mängden infoga DNA bör inte överstiga 500 ng. Den rekommenderade mängden rpt4 +: KAN:3'UTR är 50 ng:150 ng:50 ng. Mutagenized regionen är cirka 1,6 kb, så det minsta antalet jäst kolonier som skulle stå för alla möjliga kombinationer av varje bas varelse muterades till de andra tre är 1,600 x 3 = 4800 kolonier. Eftersom en omvandling reaktion ger normalt 400-500 kolonier, behövs minst 10 reaktioner värt av fusion PCR konstruera. Detta behov kan uppfyllas genom att helt enkelt öka reaktion mängden (dvs. antalet PCR-rör) med en faktor tio.
- Använda rpt4 +: KAN:3'UTR fragment i förhållandet 1:3:1 för optimalt resultat.
7. omvandling av Fission jäst av elektroporation (figur 1F)
- Inokulera jäst 10 ml av Ja medium till mättnad med ruvning det för mer än 16 h.
- Späd cellerna till en optisk densitet på 600 nm (OD600) 0,2 i 200 mL Ja medium och inkubera vid 30 ° C under skakning för 5-6 h, till OD600 = 0,6 - 0,8.
- Koncentrera sig celler till OD600 = 30, fördela till fyra 50 mL koniska rör och chill på is i 10 min.
- Skörda cellerna genom att utföra centrifugering vid 1050 x g under 3 minuter vid 4 ° C. Placera rören och 10 electro-kyvetter på is. Utför steg 7,3-7,8 på isen.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 15 mL 1,2 M sorbitol. Skaka försiktigt rören för att resuspendera cellerna.
- Centrifugera cellerna vid 1050 x g under 3 minuter vid 4 ° C.
- Upprepa steg 7.4 och 7.5. Kassera supernatanten. Tillsätt 500 µL 1,2 M sorbitol i varje rör, Omsuspendera cellerna och samla alla celler i en 15 ml koniska tub.
- Lägg till 1,2 M sorbitol upp till 2,4 mL (OD600 = 10 per 0,2 mL). Håll röret på is.
- Tillsätt 200 µL av sorbitol-suspenderade celler (kontrollera att de är fullt upphängda) till en EP röret som innehåller fusion PCR konstruera, blanda väl och överför provet till en electro-kyvetten.
- Electroporate cellerna med följande alternativ: svampar, ShS (2.00kV, 1 puls).
- Lägga till 600 µL 1,2 M sorbitol varje electro-kyvetten för en total volym på 800 µL och sedan sprida cellerna på fyra Ja plåtar (200 µL/platta). Tio electro-kyvetter kommer att avstå till 40 Ja plattor.
- Inkubera plattorna vid 30 ° C under 24 h.
- Utföra replica plating att ja + G418 och inkubera plattorna vid 30 ° C i 3 dagar.
8. Val av Heterokromatin-destabiliserande mutanter och kontroll för falska positiva
- För varje Ja + G418 platta, utföra replica plating till Ja-Ade (låg Ade) och PMG-Ade (nr Ade) plattor. Inkubera plattorna replika i 1-2 dagar vid 30 ° C, tills några av kolonierna på Ja-Ade plattorna visar en röd färg (figur 1 g).
- Jämföra Ja-Ade och PMG-Ade plattor och välj celler som visar rosa eller vitt på Ja-Ade plattan och även växa på PMG-Ade plattan. Välj inte kolonier utan tillväxt på PMG-Ade, som de är falska positiva (t.ex. reflekterande att KAN kassetten har integrerats på ett icke-målorganismer plats någon annanstans i genomet).
- Plocka ca 1 x 105 celler från varje koloni och inkubera i 10 µL SPZ lösning innehållande 2,5 mg/mL zymolyase 100 T vid 37 ° C i minst 30 min. Använd 1 µL av denna lösning att fungera som utgångspunkt mallen för kolonin PCR (figur 1 H).
- Gör SPZ (50 mL) genom att blanda 30 mL 2 M sorbitol, 4.05 mL 1 M Na2HPO4, 0.95 mL NaH2PO4 och 15 mL destillerat vatten (slutligt pH, 7,5). Prover (5 mL) kan kompletteras med zymolyase och lagras i 500-µL alikvoter vid-20 ° C fram till användning.
- Utföra gelelektrofores (1,2% agarosgel, 180V, 20 min) för att visualisera resultaten av + kolonin PCR. Välj reaktioner som uppvisar PCR band av rätt storlek och smälta 5 µL av varje reaktionsprodukt med XhoI (4 U enzym, 1 x matsmältningen buffert, 37 ° C vattenbad, 1 h) att sålla bort falska positiva (figur 1 H).
- Utföra gelelektrofores för att visualisera de XhoI smälter (1,2% agarosgel, 180 V, 20 min). Markera de kolonier vars PCR produkter skärs av XhoIoch lappa dem att ja + G418 plattor (figur 1I).
- Isolera gDNA från fission jästceller och utföra sekvensering av PCR-produkter23. Jämför erhållna sekvensen med de wild-type-sekvensen att identifiera mutationer (figur 1I).
- Direkt återinföra Function"-mutation(er) till vildtyp celler genom att omvandla dem med fusion konstruktioner förökas med PCR från mutanta celler23. Använd spotting för att bekräfta fenotypen i nygjorda muterade celler (figur 1J).
- Fusion omvandling konstruera enkelt kan amplifieras med PCR med primers p1 och p10 med mutanter genomisk DNA som mall i en total volym på 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reaktion buffert), och tillämpa de reaktion cykler som beskrivs i tabell 2 . Omvandling av konstruktionen kan göras genom att följa stegen 7,1-7.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förvärvade Rpt4 mutanter genom att följa procedurerna som beskrivs i figur 1 kan analyseras genom att bedöma färgerna i kolonierna. Färgerna i kolonierna är spotted på de relevanta plattorna i fallande mobilnummer i figur 2. Ade6 + reportern infogas vid regionen Heterokromatin är tystade i vildtyp och visar röda kolonier i Ja-Ade plattan. När Heterokromatin är destabiliseras och reportern ade6 + uttrycks, kan vita kolonier observeras i Ja-Ade plattan som clr4Δ mutant. Skärmad Rpt4 mutanter är som visas. rpt4-1 mutant visar den allvarligaste Heterokromatin destabiliseringen.
Figur 1 : Schematisk representation av protokollet. (A) Schematisk framställning av PCR-produkten erhålls genom den första omgången av PCR, som utförs med grundfärg 1 och 2. (B) begränsning-baserade kloning av rpt4 + fragmentet. (C) webbplats riktad mutagenes klonade vektorns används för att införa en tyst mutation som lägger till en XhoI begränsning webbplats. (D) slumpmässig mutagenes rpt4 + kodning regionen utförs med felbenägna PCR. (E) den muterade rpt4 + fragmenten, KAN fragmentet och 3' UTR fragmentet sällskap av fusion PCR att generera en omvandling-klar-kassett. (F) Fission jästceller omformas med fusion PCR-konstruktionen, som ersätter den endogena rpt4 + sekvensen av homolog rekombination. (G) KAN utvalda kolonier är replika pläterade till Ja-Ade (låg Ade) och PMG-Ade (nr Ade) plattor, och positiva kolonier är valda. (H) PCR och efterföljande XhoI begränsning av PCR-produkten används för att undvika falsklarm. (I) den mutation som orsakar fenotypen identifieras av patchning av valda kolonier, spridning av celler, utvinning av genomisk DNA (gDNA) och sekvensering av den relevanta delen av rpt4 +. (J) orsakande mutationer bekräftas (och falska positiva är uteslutet) genom att direkt införa mutationen till vildtyp celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Heterokromatin avinstallation förtryck mutanter av Rpt4. Schematisk bild av otr1::ade6 + reporter (överst). 5-faldig seriespädningar av Välj skärmad Rpt4 mutanter sågs på angivna plattorna i ökande nivå av Heterokromatin destabilisering (nederst). Denna siffra ändrades från artikeln '19S proteasom är direkt involverat i regleringen av Heterokromatin sprider sig i fission jäst ' av Seo et al., 201724. Den icke beskurna figuren kan hittas i den ursprungliga artikeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | Typ av skylt | |
| Ja | PMG | |
| Jästextrakt | 5 g/L | |
| Glukos | 30 g/L | 20 g/L |
| Adenin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Histidin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Leucin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Uracil | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Kalium väte pthalate | 3 g/L | |
| Na2HPO4 | 2.2 g/L | |
| L-glutaminsyra | 3.75 g/L | |
| Salter | 20 ml/L | |
| Vitaminer | 1 ml/L | |
| Mineraler | 0,1 ml/L | |
| Agar | 16 g/L | 16 g/L |
Tabell 1. Komponenter av Ja och PMG plattor
| Temperatur | Tid | Cyklerna |
| 95oC | 2 min | 1 cykel |
| 95oC | 20 s | 30 cykler |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 cykel |
| 8oC | Håll |
Tabell 2. Rekommenderade PCR-program för webbplats riktad mutagenes
| Temperatur | Tid | Cyklerna |
| 95oC | 2 min | 1 cykel |
| 95oC | 30 s | 19 cykler |
| 55oC | 1 min | |
| 72oC | 7 min | |
| 72oC | 10 min | 1 cykel |
| 8oC | Håll |
Tabell 3. Rekommenderade PCR-program för felbenägen PCR
| Temperatur | Tid | Cyklerna |
| 95oC | 2 min | 1 cykel |
| 95oC | 20 s | 30 cykler |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 cykel |
| 8oC | Håll |
Tabell 4. Rekommenderas PCR-program för att erhålla KAN fragmentet
| Förändring | Till | Exempel om rpt4 + | |
| Mall vektor | pFA6a-3HA-KANMX6 | ||
| Vektor-bindande sekvens av p7 | ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | |
| Hängande sekvens av p7 | Den sista 50bp sekvensen inklusive den stop kodon | ||
| Hängande sekvens av p8 | Första 50bp sekvensen rätt efter den stop-kodon (kompletterande sekvens) | AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC | |
| Sekvens av p9 | Starta direkt efter den stop kodon | tgcacatatatccaaaaagccatgaa | |
| Sekvens av p10 | Producera ~ 500bp fragment med p9 (kompletterande seqeucne) | TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC | |
Tabell 5. Förändringar som behövs när ADH terminatorn används istället för den endogena terminatorn
| Temperatur | Tid | Cyklerna |
| 95oC | 2 min | 1 cykel |
| 95oC | 20 s | 30 cykler |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 1 min | |
| 72oC | 8 min | 1 cykel |
| 8oC | Håll |
Tabell 6. Rekommenderas PCR-program för att erhålla 3' UTR fragmentet
| Temperatur | Tid | Ramp | Cyklerna |
| 94oC | 2 min | 1 cykel | |
| 94oC | 20 s | 10 cykler | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0.2 oC/s | |
| 94oC | 20 s | 5 cykler | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0.2 oC/s + 5 s/cykel | |
| 94oC | 20 s | 10 cykler | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0.2 oC/s + 20 s/cykel | |
| 72oC | 10 min | 1 cykel | |
| 8oC | Håll |
Tabell 7. Rekommenderade PCR-program för fusion PCR
| CBL1877 | h + | ade6-210 leu1-32 ura4-D18 otr1R (GD-glu) Sph1:ade6 |
Tabell S1: Stam används i denna studie
Tabell S2: Lista av primers som används i denna studie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Slumpmässig mutagenes via felbenägen PCR är ett kraftfullt verktyg för att skapa en mångsidig pool av mutanter i en viss region. Denna teknik är särskilt användbart för studier som syftar till att bedöma funktionen av ett protein under en viss omständighet. Exempelvis används vi häri felbenägen PCR för att bedöma funktionen av den 19S proteasom subuniten, Rpt4, i Heterokromatin underhåll. Genom att variera regionen riktade av felbenägna PCR och justera villkoren screening, vi skulle kunna mutera celler på genomisk regionen intresse och skärmen för önskad fenotypen. Nyligen, en liknande metod användes för att isolera fission jästceller härbärgerat mutationer i spindeln pole kropp komponent25.
Den viktigaste fördelen med slumpmässig mutagenes är att det kan tillämpas på både icke-väsentliga och grundläggande gener. Slumpmässig mutagenes viktiga gener kan ge olika mutanter, såsom de med subtila eller partiell funktionell defekter som gör att cellernas viabilitet att upprätthållas eller mutanter vars funktioner påverkas endast under ett visst villkor. Ett exempel på det senare är en temperatur-känslig mutant. Sådan mutanter kan isoleras med 5 mg/L phloxine B, som fläckar döende celler i rött och möjliggör långsamt växande celler skiljer sig från döende celler26.
Det kritiska steget i detta protokoll är felbenägen PCR-steg. I detta steg är det viktigt att kontrollera den mutationsfrekvensen, som kan variera kraftigt beroende på antalet PCR cykler och det ursprungliga beloppet av mallen. Vi rekommenderar att användaren fixa antalet PCR cykler och variera det ursprungliga beloppet av mallen, eftersom vi fann detta vara en bekvämare strategi för optimering. Vi noterar att tekniken med felbenägna PCR har varit allmänt tillgänglig i decennier. Om användaren väljer, kan de begära en metod för att manuellt utföra felbenägen PCR27 utan att använda ett kommersiellt tillgängliga mutagenes kit.
Som en försiktighet är falska positiva detta protokoll ganska hög. Således, mutant kandidater bör genomgå en serie av filmvisningar avsedda att sålla ut de falska positiva. Vi hittade att tyst införlivandet av en begränsning plats i målgenen kan hjälpa till att undvika behovet av att ämnet falska positiva till relativt mödosamt steg av sekvensering. Detta är kostnadseffektivt, som muterade kandidaterna får nummer i hundratals eller även utanför.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering av stöd till detta projekt lämnades av grundläggande vetenskap forskningsprogrammet genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (2016R1A2B2006354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
- Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
- QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
- pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
- QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
- QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
- PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
- Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
- GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
- Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).
