Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

Summary

La capacité des cellules souches embryonnaires humaines à se renouveler et se différencier en tous les types cellulaires du corps donne à penser qu'ils sont très prometteurs pour les applications médicales et comme un outil de recherche pour aborder les questions fondamentales dans le développement et la maladie. Ici, nous fournissons un résumé concis, étape par étape de protocole pour la dérivation de cellules souches embryonnaires humaines à partir d'embryons par l'isolement immunosurgical de la masse cellulaire interne.

Abstract

La capacité des cellules souches embryonnaires humaines à se renouveler et se différencier en tous les types cellulaires du corps donne à penser qu'ils sont très prometteurs pour les applications médicales et comme un outil de recherche pour aborder les questions fondamentales dans le développement et la maladie. Ici, nous fournissons un résumé concis, étape par étape de protocole pour la dérivation de cellules souches embryonnaires humaines à partir d'embryons par l'isolement immunosurgical de la masse cellulaire interne.

Protocol

Frozen embryons humains utilisés pour la dérivation de cellules souches humaines embryonnaires humaines (hES) ont été donnés pour la recherche après consentement éclairé appropriée en vertu des protocoles de recherche qui ont été examinés et approuvés tant par le Comité sur l'utilisation de sujets humains et les cellules souches embryonnaires de surveillance du comité de recherche à l'Université Harvard .

Protocole écrit ci-dessous est basée sur des paramètres publié rapportés par Cowan et al. 2004, avec de légères modifications.

Culture des embryons

Dégel des embryons humains en utilisant Kit Quinn Avantage dégel et la culture en gouttes de milieu mondiale complétée par Plasmanate 15% jusqu'au développement jusqu'au stade blastocyste élargi.

Immunosurgery basée sur l'isolement de la masse cellulaire interne

Préparation:

1. Préparer les plaques pour le retrait de la zone pellucide et immunosurgery (voir ci-dessous) en mettant en place des gouttes de chaque solution dans des assiettes de 10 cm. Superposition avec l'huile minérale pour éviter l'évaporation. Préparer une seule rangée par embryon destiné à la dérivation.
   • EmbryoMax Tyrodes acide, utiliser tel quel.
   • les médias dérivation de cellules hES: 75% KO-DMEM, 10% KO-Sérum remplacement, Plasmanate 10%, 2,5% des cellules ES testé sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM Glutamax-I, 1% de non-acides aminés essentiels, 50 unités / ml de pénicilline, la streptomycine 50μg/ml, 0.055mM b-mercaptoéthanol, 5ng/ml bFGF.
   • Lapin anticorps anti-humain de globules rouges primaire, reconstitué selon la suggestion du fabricant, dilué à 1:10 avec les médias dérivation de cellules hES.
   • Guinée-sérum de porc complément, reconstitué selon la suggestion du fabricant, dilué à 1:10 avec les médias dérivation de cellules hES.
     
     
     
     
     
     
2. Equilibrer toutes les plaques à 37 ° C en incubateur de culture tissulaire avant utilisation.
3. Tirez 50 pl-100 ul pipettes capillaires (VWR) pour une utilisation dans des embryons de transfert. Extrémités coupées à la plume de diamants et de l'utilisation avec des tubes pipeter à la bouche équipé d'un filtre 0,2 um.

Procédure Immunosurgery:

Notes:

• Dans cette procédure, les cellules du trophectoderme sont détruits par une brève exposition à des anticorps dirigés contre les cellules humaines en tandem avec l'activité du complément. Par conséquent, le protocole fonctionne mieux avec embryons de grande qualité avec un trophectoderme intacte, comme seule l'intégrité structurale du blastocyste empêche l'ICM d'être aussi sensibles à la réaction immunologique.
• Toutes les procédures effectuées en utilisant un champ de dissection équipés de platine chauffante.

Étapes:

1. Rincer la pipette bouche pour être utilisé pour le transfert d'embryons avec du FBS embryons pour éviter de coller.
2. Transfert blastocyste de boîte de culture pour la tenue hES goutte d'AT plat.
3. Début de la procédure par le transfert de blastocyste de déposer hES grâce à une série d'AT gouttes. En troisième baisse, montre pour la dissolution de la zone pellucide (secondes en général 5-30). Attention à ne pas l'intégrité sur-traiter ou de l'embryon peut être compromise.
   
   
   
   
4. Blastocyste transfert grâce à une série de médias dérivation de cellules hES gouttes de rincer à l'arrêt. Pipette préchargement avec les médias est recommandé de neutraliser immédiatement la réaction. Blastocystes peut être tenu ici jusqu'à ce que tous ont été au-traitées.
5. Transfert blastocyste grâce à une série de gouttes d'anticorps primaires, laissant en troisième baisse pour 30 minutes d'incubation à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire.
6. Blastocyste transfert grâce à une série de médias dérivation de cellules hES tombe à rincer primaire.
7. Transfert blastocyste grâce à une série de gouttes complètent, en laissant au troisième baisse de regarder pour la lyse des cellules du trophectoderme. Observez blastocyste pour les 30 premières secondes sur scène pour "bouillonnante" des cellules du trophectoderme comme ils lysent. Si la lyse est observée dans ce délai, gardez plat sur la platine du microscope pour surveiller la réaction jusqu'à son achèvement. Si aucun bullage est observé pendant les 30 premières secondes, retour à la pépinière, en vérifiant toutes les 5 minutes jusqu'à ce que la plupart des trophectoderme a lysées. Cela peut prendre 5-15 minutes. Surveiller de près la réaction afin de minimiser le temps de réaction et les dommages potentiels à la masse cellulaire interne.
   
   
   
   
8. Blastocyste transfert grâce à une série de médias dérivation de cellules hES gouttes pour laver l'activité du complément.
9. En utilisant une pipette en verre avec un diamètre qui est légèrement plus petit que le blastocyste (tirée de tubes capillaires VWR 10 ul), dessiner le blastocyste haut et bas pour dépouiller la plupart des trophectoderme lysées.
   
   g "alt =" 574_Figure-0 "width =" 577 "height =" 270 "/>
   
   
10. Plaque d'isoler l'ICM sur les cellules nourricières de la mitose des fibroblastes d'embryon de souris inactivées (FAE). FAE devrait être préparé la veille et sont passés à la dérivation de cellules hES dérivation journée des médias d'. 4-plats ainsi NUNC fonctionnent bien pour des mesures initiales de la dérivation.
11. Ne pas déranger la plaque pour la première 1-2 jours. Par la suite, chaque jour vérifier excroissance de cellules souches embryonnaires colonies (généralement apparente dans 1-2 semaines). Les médias devraient être changés dans les volumes moitié tous les deux jours commence le jour 3.

Excroissance de cellules ES et repiquage

Lorsque l'excroissance de cellules hES a atteint environ 0,5 mm ou plus, il est prêt pour l'expansion par la cueillette mécanique.

1. Mécaniquement disperser la moitié de l'excroissance et transfert à de nouvelles plaques contenant mangeoires frais. Touffes de cellules souches embryonnaires doivent être d'environ 30-50 cellules chacune. Laisser l'autre moitié d'excroissance comme un back-up pour le premier passage (P1). L'excroissance (p0) peut être capté à partir plusieurs fois car il continue à se développer.
   
   
   
   
   
2. Colonies secondaires peuvent être également dispersées et étendu à l'ensemble des boîtes de culture plus que les passages 3-5, époque à laquelle les lignées cellulaires de nouvelles peuvent être adaptées aux repiquage enzymatique à la trypsine. Le contenu du sérum des milieux de culture doivent également être progressivement ramenée à 1% et 0% au cours de ces passages initiaux afin de minimiser la différenciation des cellules ES.
3. Tous établie lignées cellulaires embryonnaires souches devraient être mis en réserve par le gel jusqu'à une partie de passages tôt pour de futures expansions.
4. En outre, chaque lignée cellulaire devrait être caractérisé par l'analyse du caryotype et validé par des études de pluripotence et différenciation in vitro et in vivo.
   

Discussion

Le protocole présenté ici fournit aux chercheurs une présentation concise, facile à suivre aperçu de la façon de dériver des lignées cellulaires embryonnaires souches par l'isolement immunosurgical de la masse cellulaire interne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quinn’s Advantage Thaw Kit	Sage	ART-8016
Global medium	Life Global	GMGB-050
Plasmanate	Talecris	61325
EmbryoMax Acidic Tyrodes	Chemicon International	MR-004-D
KO-DMEM	Invitrogen	10829-018
KO-Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
ES cell-tested fetal bovine serum, Defined	Hyclone	SH30070.03
Glutamax-I	Invitrogen	35050-079
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-076
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063
Recombinant human basic fibroblast growth factor	Invitrogen	13256-029
Beta-mercapt–thanol	Invitrogen	21985-023
Rabbit anti-human red blood cell primary antibody	Rockland Immunochemicals	109-4139
Guinea-pig complement serum	Sigma-Aldrich	S-1639
Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes	VWR international
Mouth pipettes with tubing	VWR international		supplied with capillary pipettes from VWR
0.2 microm Acrodisc syringe filter	Pall Corporation	PN4192
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-120
Tissue culture dishes	VWR international
Tissue culture dishes	Nalge Nunc international
Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage
Mouse embryonic fibroblasts (E12.5)