Summary
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की आत्म नवीनीकृत और शरीर के सभी प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता का पता चलता है कि वे दोनों चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए और विकास और रोग में मौलिक सवालों को संबोधित करने के लिए एक अनुसंधान उपकरण के रूप में महान वादा पकड़. यहाँ, हम एक संक्षिप्त, आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के immunosurgical अलगाव द्वारा भ्रूण से मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की व्युत्पत्ति के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Abstract
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की आत्म नवीनीकृत और शरीर के सभी प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता का पता चलता है कि वे दोनों चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए और विकास और रोग में मौलिक सवालों को संबोधित करने के लिए एक अनुसंधान उपकरण के रूप में महान वादा पकड़. यहाँ, हम एक संक्षिप्त, आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के immunosurgical अलगाव द्वारा भ्रूण से मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की व्युत्पत्ति के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Protocol
जमे हुए मानव मानव भ्रूण स्टेम सेल (HES) व्युत्पत्ति के लिए इस्तेमाल किया भ्रूण अनुसंधान के लिए अनुसंधान प्रोटोकॉल की समीक्षा की और हार्वर्ड विश्वविद्यालय में दोनों मानव विषयों का उपयोग पर समिति और भ्रूण स्टेम सेल अनुसंधान निरीक्षण समिति द्वारा अनुमोदित के तहत उचित सूचित सहमति के बाद दान किए थे .
लिखित नीचे प्रोटोकॉल Cowan एट अल द्वारा रिपोर्ट प्रकाशित मानकों पर आधारित है. 2004, मामूली संशोधनों के साथ.
भ्रूण संस्कृति
मानव ग्लोबल मध्यम विकास जब तक विस्तारित ब्लास्टोसिस्ट चरण के लिए 15% Plasmanate साथ पूरक की बूंदों में क्विन लाभ पिघलना किट और संस्कृति का उपयोग भ्रूण पहले गला लें.
आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के Immunosurgery आधारित अलगाव
तैयारी:
- Zona pellucida और immunosurgery (नीचे देखें) को हटाने के लिए 10cm प्लेटों में प्रत्येक समाधान की बूंदों की स्थापना द्वारा तैयार प्लेटें. खनिज तेल के साथ ओवरले के लिए वाष्पीकरण को रोकने. भ्रूण प्रति एक एकल पंक्ति व्युत्पत्ति के लिए इरादा तैयार.
- EmbryoMax अम्लीय Tyrodes का उपयोग, के रूप में है.
- 75% को - DMEM, 10% को - सीरम रिप्लेसमेंट, 10% Plasmanate, 2.5% ES सेल परीक्षण भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2mm Glutamax - मैं, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 50 इकाइयों: HES सेल व्युत्पत्ति मीडिया / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 50μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.055mM ख mercaptoethanol, 5ng/ml bFGF.
- खरगोश विरोधी मानव लाल रक्त कोशिका प्राथमिक एंटीबॉडी, निर्माता का सुझाव है, HES सेल व्युत्पत्ति मीडिया के साथ 1:10 पर पतला के अनुसार पुनर्गठन.
- गिनी - सुअर पूरक सीरम, निर्माता का सुझाव है, HES सेल व्युत्पत्ति मीडिया के साथ 1:10 पर पतला के अनुसार पुनर्गठन.
- 37 के लिए उपयोग करने से पहले डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सभी प्लेटों संतुलित करना.
- स्थानांतरित भ्रूण में उपयोग के लिए 50μl 100μl केशिका pipettes (VWR) खींचो. हीरे की कलम और मुँह विंदुक टयूबिंग के साथ प्रयोग एक 0.2μm फिल्टर के साथ सुसज्जित के साथ समाप्त होता है कट.
Immunosurgery प्रक्रिया:
नोट:
- इस प्रक्रिया में, trophectoderm की कोशिकाओं पूरक गतिविधि के साथ मिलकर में मानव कोशिकाओं के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी संक्षिप्त प्रदर्शन द्वारा नष्ट कर रहे हैं. इसलिए, प्रोटोकॉल एक अक्षुण्ण trophectoderm के साथ उच्च गुणवत्ता वाले भ्रूण के साथ सबसे अच्छा काम करता है, के रूप में केवल ब्लास्टोसिस्ट के संरचनात्मक अखंडता भी प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रिया के लिए अतिसंवेदनशील होने से ICM रोकता है.
- सभी प्रक्रियाओं एक विच्छेदन गर्म मंच के साथ सुसज्जित गुंजाइश का उपयोग कर प्रदर्शन किया.
चरण:
- मुँह FBS साथ भ्रूण स्थानांतरण करने के लिए चिपके से भ्रूण को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा विंदुक कुल्ला.
- ब्लास्टोसिस्ट संस्कृति डिश से पकवान एटी HES पकड़े ड्रॉप करने के लिए स्थानांतरण.
- की श्रृंखला के माध्यम से बूँदें एटी HES ड्रॉप से ब्लास्टोसिस्ट हस्तांतरण द्वारा प्रक्रिया शुरू करो. तीसरे ड्रॉप में, zona pellucida (आमतौर पर 5-30 सेकंड) के विघटन के लिए देखो. से अधिक का इलाज या भ्रूण अखंडता के लिए नहीं सावधान रहो समझौता किया जा सकता है.
- HES सेल व्युत्पत्ति मीडिया की श्रृंखला के माध्यम से स्थानांतरण ब्लास्टोसिस्ट एटी बंद कुल्ला बूँदें. मीडिया के साथ preloading विंदुक के लिए तुरंत प्रतिक्रिया एटी बेअसर करने के लिए सिफारिश की है. Blastocysts यहां आयोजित किया जा सकता जब तक सभी प्रसंस्कृत किया गया है.
- प्राथमिक एंटीबॉडी बूंदों की श्रृंखला के माध्यम से ब्लास्टोसिस्ट ट्रांसफर, 37 पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन तीसरे ड्रॉप ° सी एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में में छोड़कर.
- HES सेल व्युत्पत्ति मीडिया की श्रृंखला के माध्यम से स्थानांतरण ब्लास्टोसिस्ट बंद कुल्ला प्राथमिक बूँदें.
- पूरक बूंदों की श्रृंखला के माध्यम से ब्लास्टोसिस्ट ट्रांसफर, तीसरे बूंद में छोड़ने के लिए trophectoderm कोशिकाओं के lysis के लिए घड़ी. ब्लास्टोसिस्ट trophectoderm कोशिकाओं के "बुदबुदाती" के रूप में वे lyse के लिए मंच पर पहले 30 सेकंड के लिए देखो. यदि lysis इस समय सीमा के भीतर मनाया जाता है, खुर्दबीन मंच पर पकवान पूरा होने तक प्रतिक्रिया की निगरानी रखने के लिए. यदि कोई बुदबुदाती पहले 30 सेकंड के दौरान मनाया जाता है, मशीन पर लौटने के लिए, हर 5 मिनट की जाँच तक trophectoderm के सबसे lysed है. यह 5-15 मिनट ले सकते हैं. बारीकी से प्रतिक्रिया करने के लिए प्रतिक्रिया समय और आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के लिए संभावित क्षति को कम मॉनिटर.
- HES सेल व्युत्पत्ति मीडिया की श्रृंखला के माध्यम से स्थानांतरण ब्लास्टोसिस्ट बंद पूरक गतिविधि धोने चला जाता है.
- ब्लास्टोसिस्ट (10μl VWR केशिका ट्यूब से निकाला) से थोड़ा छोटा है कि एक व्यास के साथ कांच विंदुक का प्रयोग, ब्लास्टोसिस्ट आकर्षित ऊपर और नीचे lysed trophectoderm का सबसे दूर पट्टी.
छ "alt =" 574_Figure-0 "चौड़ाई =" 577 "ऊंचाई =" 270 /> - प्लेट ICM mitotically निष्क्रिय माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) के फीडर कोशिकाओं पर अलग. MEFs व्युत्पत्ति पहले दिन तैयार किया जाना चाहिए और HES सेल व्युत्पत्ति मीडिया के दिन के लिए बंद. 4-अच्छी तरह से NUNC व्यंजन व्युत्पत्ति के प्रारंभिक चरणों के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं.
- पहले 1-2 दिनों के लिए थाली परेशान मत करो. इसके बाद भ्रूण स्टेम सेल कालोनियों (1-2 हफ्तों के भीतर आमतौर पर स्पष्ट) के परिणाम के लिए दैनिक की जाँच करें. मीडिया आधा मात्रा में बदला जा 3 दिन पर हर दूसरे दिन की शुरुआत करना चाहिए.
ES सेल परिणाम और passaging
जब HES सेल परिणाम लगभग 0.5mm या अधिक तक पहुँच गया है, यह यांत्रिक उठा द्वारा विस्तार के लिए तैयार है.
- यंत्रवत् परिणाम के आधा फैलाने और नए ताजा भक्षण युक्त प्लेटों को हस्तांतरण. भ्रूणीय स्टेम सेल clumps 30-50 लगभग प्रत्येक कोशिकाओं होना चाहिए. पहले बीतने (p1) के लिए एक पीठ के रूप में परिणाम के दूसरे आधे छोड़ो. परिणाम (p0) से कई बार उठाया जा सकता है के रूप में यह विस्तार जारी है.
- माध्यमिक कालोनियों इसी तरह हो सकता है और छितरी 3-5 अंश है, जो समय पर नए सेल लाइनों trypsin साथ एंजाइमी passaging के लिए अनुकूलित किया जा सकता जब तक बड़ा संस्कृति व्यंजन भर में विस्तार कर सकते हैं. संस्कृति मीडिया के सीरम सामग्री भी धीरे - धीरे इन प्रारंभिक अंश के दौरान 1% और 0% के लिए कम किया जा ES सेल भेदभाव को कम.
- सभी स्थापित भ्रूण स्टेम सेल लाइनों के भविष्य के विस्तार के लिए नीचे जल्दी मार्ग के एक हिस्से की ठंड के द्वारा बैंकिंग होना चाहिए.
- इसके अलावा, प्रत्येक कोशिका लाइन karyotype विश्लेषण द्वारा विशेषता होना चाहिए और इन विट्रो में और vivo में pluripotency और भेदभाव अध्ययनों द्वारा मान्य .
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल यहाँ शोधकर्ताओं के साथ प्रदान करता है एक संक्षिप्त, आसानी से कैसे आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के immunosurgical अलगाव द्वारा मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइनों प्राप्त करने के लिए की रूपरेखा का पालन करें.
Acknowledgments
एईसी जेन ताबूत मेडिकल रिसर्च और मर्क अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए Childs मेमोरियल फंड के एक साथी है. हम प्रयोगात्मक सलाह और चर्चा के लिए डी. Egli और सी. Cowan धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
