Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

Summary

A capacidade de células estaminais embrionárias humanas para a auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células do corpo sugere que eles são uma grande promessa para aplicações médicas e como ferramenta de pesquisa para abordar questões fundamentais no desenvolvimento e na doença. Aqui, fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para a derivação de células estaminais embrionárias humanas a partir de embriões pelo isolamento immunosurgical da massa celular interna.

Abstract

A capacidade de células estaminais embrionárias humanas para a auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células do corpo sugere que eles são uma grande promessa para aplicações médicas e como ferramenta de pesquisa para abordar questões fundamentais no desenvolvimento e na doença. Aqui, fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para a derivação de células estaminais embrionárias humanas a partir de embriões pelo isolamento immunosurgical da massa celular interna.

Protocol

Embriões humanos congelados usado para embrionárias humanas derivação de células-tronco (embrionárias humanas) foram doados para pesquisa após o consentimento informado adequado ao abrigo de protocolos de pesquisa que foram analisadas e aprovadas tanto pelo Comitê sobre o uso de seres humanos e as células-tronco embrionárias comitê de supervisão de pesquisa na Universidade de Harvard .

Protocolo escrito abaixo é com base em parâmetros publicados relatado por Cowan et al. 2004, com ligeiras modificações.

Cultura de embriões

Descongelar embriões humanos usando Kit Quinn Thaw Advantage e cultura em gotas de médio global suplementado com 15% até Plasmanate de desenvolvimento para o estágio de blastocisto expandido.

Immunosurgery baseado isolamento da massa celular interna

Preparação:

1. Prepare pratos para a remoção da zona pelúcida e immunosurgery (veja abaixo) através da criação de gotas de cada solução em placas de 10cm. Sobreposição com óleo mineral para evitar a evaporação. Prepare uma única linha por embrião destinado a derivação.
   • Tyrodes EmbryoMax ácidas, use como é.
   • CTeh media derivação: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum substituição, Plasmanate 10%, 2,5% de células-ES testados soro fetal bovino (FBS), 2mM Glutamax-I, 1% não-aminoácidos essenciais, 50 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 50μg/ml, 0.055mM b-mercaptoetanol, 5ng/ml bFGF.
   • Coelho anti-humano de anticorpos de glóbulos vermelhos primários, reconstituídos de acordo com sugestão do fabricante, diluído em 1:10, com media de derivação CTeh.
   • Cobaia soro complemento, reconstituídos de acordo com sugestão do fabricante, diluído em 1:10 com a mídia derivação CTeh.
     
     
     
     
     
     
2. Equilibrar todas as placas a 37 ° C em cultura de tecidos incubadora antes de usar.
3. Pull-50μl 100μl pipetas capilares (VWR) para uso em embriões de transferência. Corte termina com diamantes e usar caneta com tubulação pipeta boca equipado com um filtro de 0,2 Hm.

Procedimento Immunosurgery:

Notas:

• Neste procedimento, as células do trofectoderma são destruídos por uma breve exposição a anticorpos direcionados contra as células humanas em conjunto com a atividade do complemento. Portanto, o protocolo funciona melhor com alta qualidade de embriões com um trofectoderma intacta, como apenas a integridade estrutural do blastocisto impede que o ICM de também estar suscetível à reação imunológica.
• Todos os procedimentos realizados usando um escopo dissecção equipado com palco aquecida.

Passos:

1. Enxágüe a boca pipeta a ser usada para transferência de embriões com FBS para evitar embriões de degola.
2. Transferência de blastocisto, do prato de cultura para TEh queda realização de AT prato.
3. Comece procedimento, transferindo-tronco embrionárias humanas a partir de blastocisto queda através de uma série de AT cai. Na terceira queda, para assistir dissolução da zona pelúcida (segundos normalmente 30/05). Tenha cuidado para não tratá-over integridade ou embrião pode ser comprometida.
   
   
   
   
4. Blastocisto transferência através de uma série de meios de derivação de células-tronco embrionárias humanas cai para enxaguar AT. Pipeta pré-carga com a mídia é recomendado para neutralizar imediatamente AT reação. Blastocistos podem ser realizadas aqui até que todos tenham sido AT-processado.
5. Transferência de blastocisto através de uma série de gotas anticorpo primário, deixando em queda de terceiro para 30 minutos de incubação a 37 ° C em uma incubadora de cultura de tecidos.
6. Blastocisto transferência através de uma série de meios de derivação de células-tronco embrionárias humanas cai para enxaguar primária.
7. Transferência de blastocisto através de uma série de gotas complementar, deixando na terceira queda para assistir pela lise das células trofectoderma. Observe blastocisto para os primeiros 30 segundos no palco para "bolhas" de células trofectoderma como eles lise. Se lise é observada dentro deste prazo, mantenha prato no palco microscópio para monitorar a reação até a conclusão. Se não borbulhar é observada durante os primeiros 30 segundos, volte à incubadora, verificando a cada 5 minutos até que a maioria dos trofectoderma tem lisadas. Isso pode demorar 5-15 minutos. Monitorar de perto a reação para minimizar o tempo de reação e danos potenciais para a massa celular interna.
   
   
   
   
8. Blastocisto transferência através de uma série de meios de derivação de células-tronco embrionárias humanas cai para lavar atividade complementar.
9. Usando pipeta de vidro com um diâmetro que é ligeiramente menor do que o blastocisto (a partir de puxou 10μl VWR tubos capilares), desenhe o blastocisto cima e para baixo para tirar fora a maior parte do trofectoderma lisadas.
   
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10. Placa ICM para isolar células alimentadoras de fibroblastos de rato mitoticamente inativado embrião (MEFs). MEFs deve ser preparada no dia anterior derivação e mudou para CTeh dia derivação de mídia. 4 pratos bem NUNC funcionam bem para as etapas iniciais de derivação.
11. Não perturbe placa para o primeiro período de 1-2 dias. A partir daí, verificar diariamente por conseqüência de colônias de células-tronco embrionárias (geralmente aparente dentro de 1-2 semanas). Mídia deve ser mudado em volumes metade a cada início outro dia no dia 3.

ES conseqüência celular e passaging

Quando a conseqüência CTeh atingiu cerca de 0,5 milímetros ou mais, ele está pronto para a expansão de colheita mecânica.

1. Mecanicamente dispersar a metade do crescimento e transferência para novas placas contendo alimentadores fresco. Aglomerados de células-tronco embrionárias deve ser de aproximadamente 30-50 células cada. Deixe outra metade conseqüência como um back-up para a primeira passagem (p1). A conseqüência (p0) podem ser separados em várias vezes à medida que continua a se expandir.
   
   
   
   
   
2. Colônias secundárias podem ser igualmente dispersos e expandido através de pratos de maior cultura até passagens 3-5, altura em que as novas linhagens de células pode ser adaptado para passaging enzimática com tripsina. O conteúdo do soro do meio de cultura também deve ser gradualmente reduzida para 1% e 0% durante essas passagens iniciais para minimizar a diferenciação de células ES.
3. Todas as linhagens estáveis ​​de células-tronco embrionárias devem ser bancados pelo congelamento até uma porção de passagens cedo para futuras expansões.
4. Além disso, cada linha celular deve ser caracterizada pela análise de cariótipo e validado por estudos pluripotência e diferenciação in vitro e in vivo.
   

Discussion

O protocolo apresentado aqui fornece aos pesquisadores uma concisa, fácil de seguir esboço de como derivar linhagens de células-tronco embrionárias pelo isolamento immunosurgical da massa celular interna.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quinn’s Advantage Thaw Kit	Sage	ART-8016
Global medium	Life Global	GMGB-050
Plasmanate	Talecris	61325
EmbryoMax Acidic Tyrodes	Chemicon International	MR-004-D
KO-DMEM	Invitrogen	10829-018
KO-Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
ES cell-tested fetal bovine serum, Defined	Hyclone	SH30070.03
Glutamax-I	Invitrogen	35050-079
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-076
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063
Recombinant human basic fibroblast growth factor	Invitrogen	13256-029
Beta-mercapt–thanol	Invitrogen	21985-023
Rabbit anti-human red blood cell primary antibody	Rockland Immunochemicals	109-4139
Guinea-pig complement serum	Sigma-Aldrich	S-1639
Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes	VWR international
Mouth pipettes with tubing	VWR international		supplied with capillary pipettes from VWR
0.2 microm Acrodisc syringe filter	Pall Corporation	PN4192
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-120
Tissue culture dishes	VWR international
Tissue culture dishes	Nalge Nunc international
Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage
Mouse embryonic fibroblasts (E12.5)