Summary
Möjligheten för mänskliga embryonala stamceller att själv förnya och differentiera till alla celltyper i kroppen tyder på att de är mycket lovande både för medicinska tillämpningar och som ett forskning verktyg för att hantera grundläggande frågor i utveckling och sjukdom. Här ger vi en kortfattad och steg-för-steg-protokoll för utvinning av mänskliga embryonala stamceller från embryon genom immunosurgical isolering av den inre cellmassan.
Abstract
Möjligheten för mänskliga embryonala stamceller att själv förnya och differentiera till alla celltyper i kroppen tyder på att de är mycket lovande både för medicinska tillämpningar och som ett forskning verktyg för att hantera grundläggande frågor i utveckling och sjukdom. Här ger vi en kortfattad och steg-för-steg-protokoll för utvinning av mänskliga embryonala stamceller från embryon genom immunosurgical isolering av den inre cellmassan.
Protocol
Frysta mänskliga embryon som används för mänskliga embryonala stamceller (HES) cell härledning skänktes till forskning efter vederbörligt informerat samtycke i forskning protokoll som granskats och godkänts av både kommittén om användningen av mänskliga subjekt och embryonala stamceller tillsynskommitté vid Harvard University .
Skriftliga protokoll nedan är baserad på publicerade parametrar rapporterats av Cowan et al. 2004, med smärre ändringar.
Embryo Culture
Tina mänskliga embryon med Quinns Kit Advantage Tina och kultur i droppar globalt medium kompletteras med 15% Plasmanate fram utvecklingen till den utökade blastocyststadiet.
Immunosurgery-baserad isolering av den inre cellmassan
Förberedelser:
- Förbered plattor för borttagning av zona pellucida och immunosurgery (se nedan) genom att inrätta droppar av varje lösning i 10 cm plattor. Overlay med mineralolja för att förhindra avdunstning. Förbered en enda rad per embryo avsedd för härledning.
- EmbryoMax Sura Tyrodes, använda som de är.
- hES cell härledning media: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum Replacement, 10% Plasmanate, 2,5% ES-cellerna testas fetalt bovinserum (FBS), 2 mm Glutamax-I, 1% icke-essentiella aminosyror, 50 enheter / ml penicillin, 50μg/ml streptomycin, 0.055mM B-merkaptoetanol, 5ng/ml bFGF.
- Kanin anti-humana röda blodkroppar primära antikroppen, rekonstitueras enligt tillverkarens förslag, utspätt till 1:10 med HES media cell härledning.
- Marsvin komplement serum, rekonstitueras enligt tillverkarens förslag, utspätt till 1:10 med HES media cell härledning.
- Jämvikta alla plåtar till 37 ° C i vävnadskultur inkubator före användning.
- Dra 50μl-100μl kapillärpipett (VWR) för användning i överföring av embryon. Skär slutar med diamant penna och använda med munnen pipett slang utrustad med en 0.2μm filter.
Immunosurgery Förfarande:
Anmärkningar:
- I detta förfarande är celler i trophectoderm förstörts av kortvarig exponering för antikroppar riktade mot humana celler i takt med att komplettera verksamheten. Därför fungerar protokoll bäst med hög kvalitet embryon med en intakt trophectoderm, eftersom endast den strukturella integritet blastocysten förhindrar ICM från att även vara mottagliga för den immunologiska reaktionen.
- Alla förfaranden utförs med hjälp av en dissektion omfattning utrustad med uppvärmd scen.
Steg:
- Skölj munnen pipett som ska användas för embryotransfer med FBS för att förhindra att embryon från att fastna.
- Överföring blastocysten från kultur skålen hES hålla droppe i skålen.
- Börja förfarande genom att överföra blastocysten från hES släppa igenom serie AT droppar. I tredje släpp, se upp för upplösning av zona pellucida (oftast 5-30 sekunder). Var noga med att inte över-behandla eller embryo integritet kan äventyras.
- Överlåtelse blastocyst genom serie hES medier cell härledning droppar för att skölja av vid. Förspänning pipetten med media rekommenderas att omedelbart neutralisera AT reaktion. Blastocyster kan hållas här tills alla har AT-bearbetas.
- Överlåtelse blastocyst genom serie primär antikropp droppar, lämnar i tredje droppe för 30 minuter inkubation vid 37 ° C i en vävnadsodling inkubator.
- Överlåtelse blastocyst genom serie hES medier cell härledning droppar för att skölja bort primär.
- Överlåtelse blastocyst genom serien kompletterar droppar, lämnar i tredje släpp för att titta på lys av trophectoderm celler. Observera blastocyst de första 30 sekunderna på scen för "bubblande" i trophectoderm celler som de lyseras. Om lys observeras inom denna tidsram, hålla rätt på mikroskop scenen för att övervaka reaktionen tills slutförts. Om ingen bubblande observeras under de första 30 sekunder, återgår till inkubatorn, kontroll av varje 5 minuter tills det mesta av trophectoderm har lyseras. Detta kan ta 5-15 minuter. Övervaka reaktion noga för att minimera reaktionstiden och potentiella skador på den inre cellmassan.
- Överlåtelse blastocyst genom serie hES medier cell härledning droppar att tvätta bort komplement aktivitet.
- Använda glaspipett med en diameter som är något mindre än blastocysten (hämtas från 10μl VWR kapillärrör), dra blastocysten upp och ner att skala bort de flesta av de lyserade trophectoderm.
g "alt =" 574_Figure-0 "width =" 577 "height =" 270 "/> - Tavla ICM isolera på feeder celler mitotically inaktiverat fibroblaster mus embryo (MEFs). MEFs bör förberedas dagen innan härledning och bytte till hES cell härledning media dag. 4-väl NUNC rätter fungerar bra för initiala steg för härledning.
- Stör inte platta för första 1-2 dagarna. Därefter kontrollerar dagligen för utväxt av embryonala kolonier stamceller (vanligtvis visar sig inom 1-2 veckor). Media bör ändras i halva volymer varannan dag med början den dag 3.
ES-celler utväxt och passaging
När hES cellen utväxt har nått cirka 0,5 mm eller mer, är det redo för expansion genom mekanisk plockning.
- Mekaniskt skingra hälften av utväxt och överföring till nya plattor med färskt matare. Embryonala stamceller klumpar bör vara ca 30-50 celler vardera. Låt andra halvan av utväxt som back-up för den första passagen (P1). Den utväxt (P0) kan hämtas från flera gånger som det fortsätter att expandera.
- Sekundär kolonier kan vara lika spridda och byggdes ut i större kultur rätter fram passager 3-5, då den nya cellinjer kan anpassas till enzymatisk passaging med trypsin. Serumet innehåll odlingssubstrat bör också gradvis minskas till 1% och 0% under dessa inledande passager för att minimera differentiering ES-celler.
- Alla etablerade embryonala stamcellslinjer bör bankas frysa ner en del av tidiga passager för framtida expansion.
- Dessutom bör varje cellinje skall präglas av karyotyp analys och validerats av pluripotens och differentiering studier in vitro och in vivo.
Discussion
Protokollet presenteras här ger forskare med en kortfattad och lätt att följa konturerna av hur man kan härleda mänskliga embryonala stamcellslinjer som immunosurgical isolering av den inre cellmassan.
Acknowledgments
AEC är en karl av Jane Coffin Childs Minnesfond för medicinsk forskning och Merck Research Laboratories. Vi tackar D. Egli och C. Cowan för experimentell råd och diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
