Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En 3D Organotypic melanom klumpformet hudmodel

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57500
Automatic Translation
1, 1
1Experimental Dermatology, Medical Faculty, TU-Dresden

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at generere en 3D organotypic melanom klumpformet hudmodel, der sammenfatter både arkitektur og flercellede kompleksiteten af et orgel/tumor i vivo men samtidig rummer systematisk eksperimentelle intervention.

Abstract

Maligne transformation af melanocytter, pigment celler i huden, forårsager dannelsen af modermærkekræft, en meget aggressiv kræft med øget metastatisk potentiale. For nylig, mono-kemoterapier fortsat at forbedre af melanom specifikke Kombinationsbehandlinger med målrettede kinase hæmmere. Stadig, metastatisk melanom er en livstruende sygdom, fordi tumorer udstille primære modstand eller udvikle resistens over for nye behandlingsformer, dermed genvinde tumorfremkaldende kapacitet. For at forbedre den terapeutiske succes af malignt melanom, er bestemmelse af molekylære mekanismer giver modstand mod konventionelle behandlingsmetoder nødvendige; Det kræver dog innovative cellulære in vitro- modeller. Her, vi introducere en in vitro- tre-dimensionelle (3D) organotypic melanom klumpformet model der kan skildre i vivo arkitektur af malignt melanom og kan berettige nye indsigter i samhandel tumorsygdomme og tumor-værtssammenspil. Modellen indeholder defineret antal modne og differentieret melanom spheroids i et 3D fuld menneskehud genopbygning model bestående af primære hudceller. Integrerede melanom spheroids cellulære sammensætning og differentiering status er magen til ene af kutane melanom metastaser in vivo. Ved hjælp af denne organotypic melanom klumpformet model, som et stof screening platform kan støtte til identifikation af respondenter at valgt Kombinationsbehandlinger, mens besparende unødvendig behandling byrde for ikke-responders, hvorved fordelene terapeutiske indgreb.

Introduction

Den menneskelige hud er sammensat af to særskilte rum, der tjener forskellige funktioner i beskytte kroppen mod skadelige miljømæssige virkninger1. Den lavere dermal rum består af en fibro-elastisk bindevæv. Det består af løst forbundne kollagen og elastin fibre syntetiseret af fibroblaster, tjener en mekanisk barriere funktion. Dermis er adskilt fra den øverste epidermis af basal lamina, som fremstilles som en ekstracellulære matrix på grund af en konstant kommunikation mellem begge hud rum. I modsætning til dermis, epidermis er en planocellulære epitel, som hovedsageligt består af keratinocytter og kan opdeles i fire lag. Stratum basale består af udifferentierede basal keratinocytter, som konstant stammer fra hud stamceller stratifying igennem faser af stratum spinosum og stratum granulosum ind stratum corneum at beskytte kroppen fra dehydrering og infektioner2. Melanocytter er justeret på den basale membran og kommunikere gennem dendritiske udvidelser med flere keratinocytter. De producere pigmentet melanin for at beskytte huden væv fra de skadelige virkninger af UV-stråling, som huden ældning, immunsuppression, betændelse og induktion af ikke-melanom hudkræft. UV stråling bidrag til omdannelsen af melanocytter til malignt melanom, er dog stadig under debat3.

Melanom udvikling er differentieret i forskellige tumor progression faser og karakteriseret ved visse genetiske, morfologiske og histologiske ændringer4. De stammer enten de novo eller fra en medfødt eller erhvervet nævus på grund af en lokal forøgelse af melanocyte spredning forårsager godartede neoplasi. Dette forløber læsion kan konvertere til strukturelt ændrede Dysplastiske væv indeholdende atypic celler, som fortsat kan den første maligne fase, radial vækstfase (RGP). Denne tidlige tumor progression fase er karakteriseret af celler radialt prolifererende i epidermis, viser par lokalt invasive celler i papillære dermis. Under den efterfølgende lodret vækst fase (VGP) melanom viser celler allerede en metastatisk og invasive fænotype ved at bryde gennem basal lamina at infiltrere de dybere dele af dermis og subkutane væv5. Endelig, den metastatisk melanom (MM) repræsenterer den mest aggressive progression fase med metastaserende celler systemisk breder sig i hele blod- og lymfeknuder systemet at invadere distalt organer som lever, lunge og hjerne6.

Til dato, er tidlig diagnose efterfulgt af kirurgi stadig den mest effektive behandling af malignt melanom. Prognosen for patienter med Fjern metastase, dog stadig især fattige7, fordi klassisk kemoterapi regimer giver kun lidt overlevelse fordel8,9. Men, efter årtiers stagnation, de seneste fremskridt i målrettede behandlinger er betydeligt forbedret prognosen for malignt melanom.

Dysregulering af to store mitogen aktiveret veje, RAS-RAF-MEK-ERK og PI3K-AKT-PT signaling veje, præsentere centrale drivkræfter for melanom progression, især når constitutively aktivering punktmutationer af protooncogener BRAFV600 og De nationale tilsynsmyndigheder er nuværende10. I overensstemmelse hermed, opfindelsen af målrettede kinase hæmmere lovede terapeutisk fordel for patienter med metastatisk melanom. Et væld af kliniske forsøg, der foretages til dette punkt har ikke opnået væsentlig gavn for patienter med metastatisk melanom. Næsten alle svar er delvis, med en delpopulation af patienter viser primære modstand. Derudover blev erhvervelse af sekundære modstand fører til tilbagefald observeret i fleste af patienterne11,12.

Det bliver klart, at analyse af mutation status alene ikke er tilstrækkeligt til at udvikle de mest potente terapeutisk strategi. Nye hurtige og pålidelige diagnostiske værktøjer er nødvendige for at systematisk registrere og analysere lydhørhed af individuelle kræftceller. Størstedelen af de i øjeblikket foreliggende data om menneskelige melanom er opnået fra todimensionale (2D) melanom cellekulturer. Tumorcellerne, men dyrkes i 3D tillader intercellulære krydstale mellem differentieret kræft celle delpopulationer samt mellem kræftceller og ikke-transformeret omkringliggende værten væv. Derfor ville det være bedst at rekonstruere 3D-miljø hvor melanom udvikles, anvendes som en præklinisk screening model13,14.

Protocol

Alle menneskelige væv arbejde blev udført ved hjælp af godkendte institutionelle protokoller.

1. adskillelse af Dermis og Epidermis fra menneskelige hud (juvenil forhuden fra omskæring)

  1. Placer forhuden (normalt 1-2 cm2) i en ikke-klæbende sterile celle kultur fad (Ø 10 cm) og dække det med 10-12 mL af fosfatbufferet saltopløsning+ (PBS, 0,5 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, pH 7,2 = PBS+). Fjern alle overskydende (fedt) væv ved hjælp af steril skalpel og pincet.
  2. Skære huden i 3 mm x 5 mm stykker, vaske dem med PBS og overføre dem til en ikke-klæbende sterile celle kultur fad (Ø 6 cm). Dække væv stykker med 5-7 mL dispase løsning (2 U/mL i PBS). Forsegle celle kultur parabol med paraffin film og Ruger i 16 timer ved 4 ° C.
  3. Trække den epidermale fra den dermale del med to steril pincet. Overføre dissekeret væv stykker til enkelte ikke-klæbende celle kultur retter (Ø 6 cm) og dække hver af dem med PBS+.

2. isolering af primære keratinocytter fra Epidermis

  1. Forsigtigt fjerne PBS+ fra celle kultur fadet ved hjælp af Pasteurs pipette og vaske epidermal væv stykker (punkt 1.3) med PBS. Skær epidermis i mindre stykker (1 mm2) og samle dem i en 50 mL konisk slange. Der tilsættes 10 mL 1 x Trypsin-EDTA (forvarmet til 37 ° C) og Inkuber i 5 min i et vandbad ved 37 ° C. Vortex væv suspension hver 2 min.
  2. Stoppe den enzymatiske reaktion ved at tilføje 1 mL føtalt kalveserum (FCS). Resuspend cellerne af pipettering op og ned med en 10-mL plastik pipette til 4 min. Prøv at undgå bobler og skum dannelse.
  3. Pipette cellesuspension ind i en celle si (pore størrelse 100 µm), placeret på toppen af en frisk 50 mL konisk slange, og skyl 3 x med 5 mL PBS. Der centrifugeres celler på 200 x g for 5 min. celle resuspenderes i 2-6 mL næringssubstratet indeholdende 1% (v/v) phosphatbufferet. Bestemme den celle nummer manuelt ved at tælle celler i en hemocytometer og seed 6 x 105 celler ind i en T75 celle kultur kolbe.

3. dyrkning af primære keratinocytter

  1. Inkuber primære keratinocytter isoleret i trin 2.3 i en celle inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i keratinocytter medium uden FCS, at 50-70% confluency.
  2. Til passage af keratinocytter omhyggeligt fjerne medium, tilsættes 5 mL PBS-EDTA og inkuberes celler i 10 minutter ved 37 ° C. Kontrollere hvis celler er begyndt at løsne sig fra kultur kolben under et lysmikroskop (4 X forstørrelse: celler vises afrundet, men er stadig tilknyttet!). Hvis ikke, udskifte gamle PBS-EDTA med friske PBS-EDTA og re inkuberes i en anden 10 min ved 37 ° C.
  3. Der tilsættes 5 mL 1 x Trypsin-EDTA til afrundede cellerne stadig dækket med 10 mL PBS-EDTA og re Inkuber dem i 1-3 min. ved 37 ° C. Stoppe den enzymatiske reaktion ved tilsætning af 1 mL FCS og indsamle de fritliggende celler i en 50 mL konisk slange. Centrifugeres celler på 200 x g i 5 min, resuspenderes i keratinocytter medium og frø 6 x 105 celler i en frisk T75 celle kultur kolbe.
    Bemærk: For at generere organotypic hud rekonstruerer, den primære keratinocytter bør anvendes senest passage 3-4.

4. isolering af primære fibroblaster fra Dermis

  1. Skær den dermale væv (punkt 1.3) i mindre stykker (1 mm2) og overføre dem til en 50 mL konisk slange. Tilsæt 10 mL collagenase-løsning (5 U/mL i PBS+) og Inkuber i 45 min i et vandbad ved 37 ° C. Der centrifugeres blandingen væv og celler på 200 x g i 5 min.
  2. Vask celle pellet to gange med 10 mL DMEM indeholdende 4,5 g/L glukose og L-glutamin, men uden at L-pyruvat. Endelig resuspend væv stykker i 2 mL af DMEM indeholdende 1% (v/v) phosphatbufferet og 10% FCS. Overføre dem til en T25 celle kultur målekolbe, og der inkuberes dem i en celle inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 natten over.
    Bemærk: Den lille volumen tillader fibroblaster at migrere ud af væv-debris og tvinger dem til at vedhæfte kultur kolben.
  3. Den næste morgen, tilføje en anden 6 mL phosphatbufferet-DMEM-FCS og inkuberes i 2-3 dage ved 37 ° C, indtil cellerne har nået 80-90% confluency.

5. dyrkning af primære fibroblaster

  1. Passage af fibroblaster, fjerne medium og vaske vedhængende celler med PBS. Der tilsættes 5 mL 1 x Trypsin-EDTA og Inkuber i 3 minutter ved 37 ° C.
  2. Stoppe den enzymatiske reaktion ved tilsætning af 5 mL DMEM/FCS og indsamle de fritliggende celler i en 50 mL konisk slange. Centrifugeres celler på 200 x g i 5 min, resuspenderes i DMEM medium og seed 6 x 105 celler i en frisk T75 celle kultur kolbe.
    Bemærk: For at generere organotypic hud rekonstruerer, de primære fibroblaster bør anvendes senest passage 4-6.

6. generation af 3D melanom Spheroids Via hængende slip-metoden

  1. Kultur melanom celler (f.eks., 451-LU eller enhver melanom cell line af interesse) ifølge almindelige protokoller, ved hjælp af RPMI som indeholder 10% FCS15.
    1. For at generere melanom spheroids af lignende størrelse og kvalitet, vaske melanom-celler i PBS, tilsættes 5 mL af 1 x Trypsin-EDTA i PBS til celler i en T175 celle kultur kolbe, og der inkuberes i 3-5 min. ved stuetemperatur (RT). Neutralisere Trypsin ved at tilføje 5 mL RPMI/10% FCS. Høst celler ved centrifugering ved 200 x g i 5 min. genopslæmmes celle pellet i RPMI/FCS i en endelig koncentration på 10.000 celler/mL som bestemt ved optælling i en hemocytometer.
  2. Spot 40 x 25 µL (= 250 celler) af cellesuspension på indersiden af låget af en steril ikke-klæbende celle kultur fad (Ø 10 cm) ved hjælp af en elektronisk multi pipette. Med en hurtig, men jævn bevægelse, vende låget og placere den på de respektive celle kultur parabol der indeholder 5 mL PBS.
    1. Kultur "hængende drop retter" i en celle inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 10-14 dage, afhængigt af hvilken celle anvendes.
      Bemærk: Celler fra MM vækstfase typisk vokser hurtigere og danne mere solidt spheroids i hængende drop sammenlignet med melanom-celler, der stammer fra RGP eller VGP. Individuel evaluering, observere klumpformet vækst under et par kikkert eller under et lysmikroskop (4 X forstørrelse). Normalt, blive spheroids påvises efter 48 h under et par kikkert eller under et lysmikroskop (4 X forstørrelse). Efter 10-14 dage er de synlige uden nogen forstørrelse enhed.
  3. 5 dage efter den første dråbe spotting, tilføje 10 µL af friske RPMI/10% FCS medium til hver dråbe. Efterfølgende exchange 10 µL af medium hver anden dag. Anvendelse af en elektronisk dispenser er meget nyttige i dette trin.
  4. Afhængigt af hvilken celle høste spheroids (se punkt 10 for detaljer) efter 10-15 dage ved at skylle dem forsigtigt ud celle kultur parabol låg med PBS. Samle dem i en frisk ikke-klæbende celle kultur parabol.
    Bemærk: Dyrkning periode afhænger af tumor vækstfase af melanom-celler når de var oprindeligt stammer, fxspheroids stammer fra 451-LU celler vokse til ca. 500 µm i diameter senest 12 dage efter dyrkning i hængende drop15 .

7. generation af Dermal rum af Organotypic fuld hud rekonstruerer

  1. Generere hud modeller bruger 24-godt celle Mikroporøs membran skær (pore størrelse 8 µm) placeret i 24-godt plader.
    Bemærk: Sørg for ikke at bruge hængende men stående skær, fordi de vil blive placeret i en 6-godt plade til air-liquid dyrkning på et senere tidspunkt.
  2. Forberede gel neutralisering løsning (GNL)15, såvel som kultur medier benævnt MM og endotel vækst medier (EGM)16,17. For at forhindre koagulation, butik kollagen type I-(som regel fra rotte hale, 3,5-4 mg/mL 0,02 eddikesyre, N) på køl indtil brug, fordi det begynder at gel på RT.
  3. Genopslæmmes 1 x 105 fibroblaster pr. Indsæt i GNL og hurtigt blandes cellesuspension med kollagen i forholdet 1:3 i en endelige mængden af 500 µL/Indsæt. Mix af forsigtigt pipettering op og ned for at undgå boble dannelse som bobler kan forringe kvaliteten af huden rekonstruere.
  4. Tillad de enkelte dermal gels at bosætte sig ved at holde dem uden medium på RT for 30 min i en steril hætte. Efterfølgende dækker hver gel med DMEM indeholdende 4,5 g/L glucose, 1% L-glutamin, 10% FCS, og uden L-pyruvat, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.

8. generation af den epidermale rum af Organotypic fuld hud rekonstruerer

  1. Den næste dag fjerner medium fra de dermale geler og reagensglasset dem med EGM medier (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/mL gentamicin) i 2 timer ved 37 ° C. Trække mediet og omhyggeligt frø 1 x 105 keratinocytter genopslemmes i 100 µL EGM oven på den dermale gel.
  2. Inkuber rekonstruerer i 1,5 timer ved 37 ° C at tillade keratinocytter at tiltræde den dermale rum.
    Bemærk: Under denne inkubationstiden, geler vil begynde at skrumpe ind på grund af fibroblast-induceret sammentrækning, og dermed, i det mindste delvist løsne sig fra Indsæt vægge.
  3. Dække huden ækvivalenter med ca. 800 µL EGM og fjern forsigtigt de resterende gel fra Indsæt væggen med en lille (hvid) afpipetteres spids. Kultur hud ækvivalenter neddykket EGM i 7 dage i en celle inkubator ved 37 ° C, 5% CO2, og ændre mediet hver anden dag.
    Bemærk: I løbet af denne tid hud ækvivalenter vil skrumpe markant.

9. air-liquid dyrkning af Organotypic fuld hud rekonstruerer

  1. På dag 8 indsætte overførsel hver i en individuel godt af en 6-godt plade. Kun 1,2-1,4 mL tilsættes MM medium til hver brønd, således at huden rekonstruere leveres med medium fra bunden af godt men er ikke dækket med medium.
    Bemærk: Dyrkning på luft-flydende interface giver mulighed for stratificering af epidermale del og etablering af en fuld cornified lag (stratum corneum).
  2. I løbet af de næste 10-17 dage, ændre mediet som anført i afsnit 9.1 hver anden dag. I denne periode, tilføje stoffer eller andre stimuli efter behov til medium. Fjern forsigtigt den fulde hud rekonstruere fra Mikroporøs membran Indsæt bruger buet pincet til yderligere analyse, fximmunhistokemisk analyse (figur 1).

10. generation af Organotypic melanom klumpformet hud modeller

  1. For at integrere den dermale rum af organotypic fuld hud rekonstruerer melanom spheroids, skylles omhyggeligt spheroids (efter trin 6.4) off låget af hængende slip celle kultur parabol med PBS. Indsamle 10-20 spheroids/Indsæt i en steril ikke-klæbende celle kultur parabol. Fjern forsigtigt overdreven PBS med Pasteur pipette.
  2. Opsug spheroids i den mindste mængde mulige af ekstraordinær generalforsamling. På dette tidspunkt observere og tælle spheroids med det blotte øje, uden yderligere forstørrelse enhed. Tage 10-20 spheroids pr. hud model/gel, som anført i trin 10.1.
  3. Overføre dem til den ønskede mængde af GNL indeholdende fibroblaster (under trin 7.3), og bland med kollagen type. Fra dette trin på fortsættes som beskrevet i afsnit 7.3-9.1.
    Bemærk: Tumor spheroids bliver synlige i de dermale gel som hvide pletter (figur 2)

Representative Results

Succesfuld behandling af melanom metastaser kan være påvirket af cross-talk mellem tumorceller samt mellem tumor og ikke-transformeret værtsceller. Formålet med udvikling af organotypic modeller af kræft in vitro- er at give passende prækliniske testsystemer, at sammenfatte 3D organisation og kompleksitet af menneskelige melanom in vivo. Dette giver mulighed for undersøgelse af den terapeutiske virkning på tumor i et organotypic miljø og de negative virkninger på de omgivende primære væv parallelt.

For at udvikle de bedste organotypic hud modeller, er kvaliteten af de primære celler afgørende. Det er en fordel at bruge juvenile primære fibroblaster og keratinocytter, fordi de er typisk mindre differentierede i forhold til voksne primære hudceller. Juvenile hud celler kan enten være isoleret fra juvenile forhuden som beskrevet i afsnittene protokol 1-5, men kan også købes fra selskaber som præ-natal primære fibroblaster og keratinocytter. Hvis køber, er det nødvendigt at bestille celler fra forskellige donorer til at undgå donor-specifikke resultater, fxfor drug følsomhed. Hele protokollen vises som en ordning i figur 3.

Kvalitetskontrol af 3D full-hud ækvivalenter kræver immunhistokemisk analyse. Et første indtryk kan opnås ved hæmatoxylin-Eosin (H & E) farvning af paraffin indlejret sektioner (3 µm). Detaljeret analyse af kvaliteten af epidermale differentiering og dannelsen af basal lamina mellem dermis og epidermis kræver immunhistokemisk analyse ved hjælp af specifikke antistoffer mod en epidermal stratificering markør. Dette tillader sondring mellem udifferentierede, meget proliferativ celler ligger tæt på den basale membran og meget differentieret og keratiniseret cellerne i stratum corneum gennem dannelsen af særskilte epidermale lag i mellem . Som det fremgår af immun-histologiske farvning (figur 4), differentiering af keratinocytter i hele epidermis kunne opnås svarende til normal hud: fortrinsvis udifferentierede celler fra den lavere epidermale lag (stratum basale og stratum spinosum) pletten positive for keratin 14, mens de mere differentierede celler fra supra basal lag (stratum granulosum og stratum corneum) pletter positivt for keratin 10 og involucrin. I overensstemmelse hermed, der filaggrin farvning, kunne der kun konstateres i stærkt differentierede celler i stratum corneum. Vigtigst, afslører laminin 5 farvning at en basal lamina blev genereret for at fysiologisk tilslutte den epidermale til kunstig hud rekonstruere dermal kabine. Dette beviser, at en kommunikerende organotypic mikromiljø er blevet genereret til vært melanom celler eller spheroids for fysiologiske og patofysiologiske analyse.

Med henblik på melanom stof screening integreres enkelt melanom celler også i dermis af fuld hud ækvivalenter til at tillade de novo melanom reden dannelse18,19. Derfor, melanom celler kombineres med primære fibroblaster i forholdet 5:1, centrifugeret sammen på 200 x g i 5 min og genopslemmes i GNL inden blanding med kollagen. Som et resultat, vil melanom cell reder spontant danner i dermal rum. Ifølge vores erfaring, kun celler med den metastatisk vækst fase form ordentlig reder, sammenlignet med melanom celler RGP eller VGP15. En væsentlig ulempe ved disse typer af modeller er, at antallet og størrelsen af melanom reder dannet kan ikke forudsiges, og kan variere mellem individuelle hud rekonstruerer uafhængigt af enhver behandling. Eksempelvis kan 1.000 celler seedede ind i de dermale rum få 10 reder bestående af 100 celler eller 100 reder bestående af 10 celler hver (figur 5). Disse biologiske variabler præsentere med tre mangler: først, antallet og størrelsen af melanom reder dannet er uforudsigeligt; for det andet metastaser i vivo er normalt større end melanom reder og udviser en mere kompleks samhandel tumorsygdomme mangfoldighed; og for det tredje på grund af begrænset levetid af tumor-reden modeller behandling startes tidligt, og derfor snarere hæmmer tumor udvækst i stedet for forårsager regression af eksisterende tumor reder.

For at overvinde disse begrænsninger organotypic melanom klumpformet hud modeller kan genereres. Af dyrkningsbaserede 250 metastatisk melanom celler i en hængende drop for 14 dage20, genereres spheroids reproducerbar bestående af levedygtige melanom celler præsentere en kompakt struktur med en afsluttende diameter på ca. 500 µm efterligne ikke vaskulariserede tumor noder, mikro-metastase, eller mellem kapillær mikro regioner af solide tumorer21,22. Generelt, enhver melanom cell line er velegnet til generation af spheroids via hængende drop metode; dog celler afledt af mere avancerede metastatisk tumor faser form mere solidt spheroids i forhold til cellelinjer stammer fra tidlige progression stadier, fxRGP.

For nogle celler, det er en fordel for ordentlig klumpformet dannelsen at øge viskositeten af hængende drop næringssubstratet. Dette kan opnås ved tilsætning af 10-50% methyl-cellulose til næringssubstratet. Til methyl-cellulose bestand løsning, autoklave 1,2 g methyl-cellulose sammen med en magnetisk rør i en 100 mL glasflaske. Tilsæt 100 mL forvarmet (60 ° C) medium og rør for 20 min ved stuetemperatur, og en anden 1-2 h ved 4 ° C. Centrifugeres stamopløsning i 2 timer ved 5.000 x g og gemme den tyktflydende supernatanten ved 4 ° C indtil brug.

Korrekt validering af fuld hud melanom klumpformet modeller er forudsat af den omstændighed, at et defineret antal af melanom spheroids kan - i det mindste statistisk - skal integreres i de dermale fibroblast/kollagen jeg stillads på dag 1 af huden model konstruktion, så dem udvikling under epidermal differentiering for 25-27 dage. Udbyttet af spheroids kan analyseres direkte efter såning, fordi spheroids vises som hvide pletter i den gennemsigtige dermal gel og kan ses uden nogen forstørrelse device (figur 2). Som et resultat, genereres en 3D hudmodel, at havne modne melanom spheroids, der havde været dyrkede i vitro for i alt ca. 42 dage, viser den højeste grad af samhandel tumorsygdomme celle differentiering15.

H & E farvning af huden melanom klumpformet model afslører histologisk udseende og cellulære fordeling af melanom spheroids at være meget lig den, ikke-vaskulariserede menneskelige melanom hud metastaser i vivo15 (figur 6 ). To delpopulationer af melanom-celler er tydeligt adskiller sig under disse betingelser: en perifer prolifererende delpopulation og en central delpopulation hovedsageligt bestående af indskrumpet, apoptotiske eller nekrotiske celler, danner de såkaldte "nekrotisk" Center. Immunohistochemically bor og prolifererende delpopulationer kan påvises ved hjælp af antistoffer mod spredning markør KI-67, der henviser til celler i de nekrotiske center kan visualiseres ved TUNEL-farvning15. Denne særlige distribution af tumor celle delpopulationer er berettiget af den sfæroide størrelse (≥500 µm), som følge af en mangel på næringsstoffer og ilt i den centrale del hvor katabolske affald ophobes. Efter protokollen, forudsat her vil tillade generation af en pålidelig og reproducerbar organotypic integreret menneskelige fuld-tykkelse hudmodel med menneskelige melanom spheroids, der efterligner human melanom hud metastaser. Anvendelser af denne model Medtag dopingkontrol, screening af toksiner, indflydelse af kosmetiske forbindelser eller laser terapi på melanom udvækst og behandling.

Figure 1
Figur 1 : Dyrkning af 3D organotypic hud rekonstruerer oversvømmet med medium og på grænsefladen air-liquid. På dag indlejret 0 primære keratinocytter udsås på toppen af den dermale rum bestående af primære fibroblaster i et kollagen type jeg matrix. 3D hud rekonstruerer bo dyrkede oversvømmet med EGM for 7 dage, løsne sig fra Indsæt væg og begynde faldende. På dag 8 indsætter overføres til 6-brønde og dyrkes på air-liquid grænseflade at tillade epidermal stratificering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Melanom spheroids indlejret i de dermale rum vises som hvide pletter. Mens forbereder den dermale rum af 3D hud rekonstruere, et defineret antal melanom spheroids kan føjes til den fibroblast kollagen type jeg blande. Når den dermale gel har afgjort, blive melanom spheroids synlig som hvide pletter.

Figure 3
Figur 3 : Ordningen af 3D organotypic hud model konstruktion. Fjerner fedtvæv fra prøven, huden og skæres i mindre stykker. Inkubering med dispase løsning natten over ved 4 ° C letter adskillelse af epidermis til dermis. Isolerede primære fibroblaster og keratinocytter bør dyrkes separat og brugt mellem passage 4-6 og 3-4, henholdsvis. Efterfølgende, kan generation af 3D hudmodel fortsætte som beskrevet i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : 3D organotypic hud rekonstruerer Vis en differentiering niveau svarende til normal human hud. Paraffin dele af huden ækvivalenter (A) i forhold til normale menneskelige hud (B) blev farvet for udtryk for keratiner 14 (rød: λex 554 nm; λem 568 nm) og 10, involucrin (grøn: λex 490 nm; λem 525 nm ), filaggrin (grøn: λex 490 nm; λem 525 nm), og laminin 5 (grøn: λex 490 nm; λem 525 nm), og analyseret med en Konfokal fluorescens mikroskop. Cellekerner blev visualiseret ved DAPI farvning (blå: λex 340 nm; λem 488 nm). Immunhistokemisk undersøgelse af 3D full-tykkelsen af huden ækvivalenter afslørede ordentlig epidermal stratificering danner forskellige lag af epidermis, som ses i normal human hud. Mens celler fra den lavere epidermale lag farvet positive for keratin 14, differentierede mere celler fra supra basal lag viste keratin 10 og involucrin farvning. Højt differentierede celler tæt på stratum corneum udtrykt filaggrin. Laminin 5 farvning viser, at en basal lamina genereres for at fysiologisk tilslutte den epidermale til den dermale rum (laveste panel). Dette tal er taget fra Voersmann et al. 15 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Antal og størrelse af spontant dannede melanom reder kan ikke forudsiges. De novo melanom reden dannelse i dermal rum fuld hud ækvivalenter kan opnås ved at blande et defineret antal melanom celler med primære fibroblaster at integrere begge celletyper i typen kollagen matrix. Antallet og størrelsen af spontant dannede melanom reder kan kun analyseres fra en moden 3D hud rekonstruere efter ca. 21 dage. Som afbildet fra to prøver (A) og (B), numre og størrelser af melanom reder kan variere mellem individuelle hud rekonstruerer. Som følge heraf er det vanskeligt at validere disse modeller og at forudsige den terapeutiske virkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Melanom spheroids integreret i huden ækvivalenter sammenfatte Nøglefunktioner af menneskelige kutane melanom metastaser. H & E farves paraffinsnit af tumor spheroids indlejret i huden ækvivalenter viste spheroids dele nøglefunktioner med ikke-vaskulariserede menneskelige kutane melanom metastaser i vivo. To delpopulationer af celler er klart mærkbar: en perifer levende delpopulation og centrale delpopulation hovedsageligt bestående af indskrumpet, apoptotiske eller nekrotiske celler, danne byens "nekrotisk". Denne fordeling af tumor celle delpopulationer er garanteret af den sfæroide størrelse. Dette tal er blevet ændret fra Voersmann et al. 15 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Organotypic melanom klumpformet hudmodel indført her warrants nye indsigter for en dybere forståelse af samhandel tumorsygdomme og tumor-vært interaktion, og kan give en avanceret screening platform for at studere molekylære mekanismer af tumor udvikling og terapi modstand i fremtiden.

At sikre bedst fysiologisk og i vivo efterligne betingelser af huden rekonstruerer, kvaliteten af de primære celler er af allerstørste betydning. Som anført ovenfor, juvenil eller prænatale hudceller viser den laveste differentiering grade og er derfor bedst egnet til at generere fuld-tykkelse hud ækvivalenter. Den første mulige kvalitetskontrol er omfanget af dermal sammentrækning på dag 2 efter såning af keratinocytter og equilibrating gel til ekstraordinær generalforsamling (protokollen afsnit 8.2 og 8.3). Dermal geler vil skrumpe mest med den bedste kvalitet af fibroblaster. Også kan integrationen af for få eller for mange fibroblaster forringe dermal sammentrækning og dermed fastgørelse af den epidermale dermal rummet. Dette vil til gengæld kompromittere epidermal differentiering, fordi denne proces kræver en omfattende cross-talk mellem dermal og epidermal celler.

Kvaliteten af primærelementer afhænger også kritisk celle confluency samt passagen af cellerne. Hvis keratinocytter er vokset til ≥80% confluency de straks stoppe prolifererende og begynde at differentiere. Det er derfor vigtigt at kultur dem til 40-70% confluency under passaging og bruge dem ikke senere end passage 3-4. Fibroblaster er mindre følsomme, men bør ikke anvendes senere end passage 4-6. Bemærk også at alle primære celler og cellelinjer bruges til at generere organotypic melanom klumpformet hud modeller er kulturperler fri for antibiotika, og derfor forurening risikoen er høj. Men tilsætning af antibiotika ændrer fysiologi af de enkelte celler og derfor reducerer kvaliteten af huden-ækvivalenter.

Tumordannelse klumpformet er generelt muligt fra næsten alle former for tumor cellelinjer og også fra tumorceller frisk isoleret fra patient materiale. Den første celle nummer og/eller dyrkning tid for at opnå optimal klumpformet størrelser kan variere afhængigt af celletype anvendes. Op til en størrelse på 150-200 µm, kan alle celler i en klumpformet stadig tilstrækkelig leveres med næringsstoffer via simpel diffusion. Kun spheroids med størrelser ≥500 µm viser en høj grad af cellulære differentiering og repræsentere typiske funktioner af ikke-vaskulariserede tumor væv22.

Organotypic melanom-klumpformet-hud-modellen udviklet her er særligt velegnet til at studere tumor-værtssammenspil og for melanom drug test under i vivo-indkvartering vilkår15. Stadig, miljø af melanom i vivo er endnu mere kompleks, husly en bred vifte af tumor forbundet celletyper, herunder immunceller og endotelceller. Da tilsætning af ordentlig primære immunceller står over for problemer med histocompatibility, er disse modeller endnu ikke kunnet følge tilstrækkelig med i immun-terapeutiske tilgange.

Ikke desto mindre melanom spheroids kan genereres fra frisk isoleret patient materiale og når inkluderet i den fulde hud rekonstruere, kan tjene som enkelt drug screening platforme. Selv integrationen af stykker af melanom metastaser i huden rekonstruerer er tænkeligt at teste stoffet kombinationer i en skræddersyet terapeutiske tilgang. Herunder organotypic 3D skin-melanom model i præklinisk afprøvning er tilbøjelige til at hjælpe med at sikre, at de mest lovende nye terapeutiske begreber er taget frem i klinisk afprøvning, dermed reducere nedslidning satsen af potentielle nye behandlinger for dette sygdom og øge hastigheden af terapeutiske succes i kliniske forsøg.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takke Hanna Voersmann for oprettelse af 3D organotypic melanom-klumpformet-hud-model og giver udmærkede protokoller. Forfatterne også takke Silke Busch for værdifuld teknisk støtte. Arbejdet var støttet af BMBF e: Med programmet "Melanom følsomhed" 031A423A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal serum albumin (FCS) Thermo Fisher Scientific 10270106 add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 1X dilute in PBS
RPMI Thermo Fisher Scientific 61870010 for cultivation of melanoma cell lines
DMEM  Thermo Fisher Scientific 41965062 for cultivation of primary fibroblasts
Dispase Gibco life technologies  17105041 2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I BD Biosciences 354249 usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon  Nunc 140629 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer BD Falcon 352360 yellow
Gentamycine Thermo Fisher Scientific 15750060 dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium Cell Systems do not add FCS or antibiotics
Collagenase SERVA 17454 NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes Cell Systems FC-0007 alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts Cell Systems FC-0001 alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM
[+] 4,5 g/l Glucose,
[+] L- Glutamine,
[-] L- Pyruvate		 Gibco life technologies 41965 mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine Gibco life technologies  21765-029 add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF  Gibco life technologies  13247-051 add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride Merck Chemicals 2381 add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid Alfa Aesar 18851 add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin Lilly HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine Sigma-Aldrich  E-0135 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine Sigma-Aldrich P-0503 add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine Sigma-Aldrich  T-0665 add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine Sigma-Aldrich T-6397 add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-088816 add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone Sigma-Aldrich P-8783 add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes Sigma-Aldrich H-3784 add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine Sigma-Aldrich S-4311 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride Sigma-Aldrich  C-7017 add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS Sigma-Aldrich F-0392 Lot 086K0361 add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine Sigma-Aldrich  A-9795 add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine PromoCell C-42209 add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride Sigma-Aldrich 255521 add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody Dako M7002 1:50
anti cytokeratin 14 antibody Santa Cruz sc-53253 1:200
 anti laminin 5 antibody Santa Cruz sc-32794 1:50
anti filaggrin antibody Thermo Fisher Scientific MA5-13440 1:50
anti involucrin antibody Acris Antibodies AM33368PU 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled LifeSpan Biosciences LS-C153907 1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled Jackson Immuno Research 115-165-003 1:1000
DAPI Sigma-Aldrich 10236276001 1:100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boulais, N., Misery, L. The epidermis: a sensory tissue. Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).
  2. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).
  3. Shain, A. H., Bastian, B. C. From melanocytes to melanomas. Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).
  4. Clark, W. H. Jr Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer. Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).
  5. Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host. Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).
  6. Miller, A. J., Mihm, M. C. Jr Melanoma. N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).
  7. Balch, C. M., et al. Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification. J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).
  8. Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials. Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).
  9. Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma. Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).
  10. Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
  11. Flaherty, K. T., et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).
  12. Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. Systemic therapy of metastatic melanoma. J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).
  13. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
  14. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  15. Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing. Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).
  16. Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation. J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).
  17. Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).
  18. Sinnberg, T., et al. Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide. J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).
  19. Niessner, H., et al. The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells. J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).
  20. Foty, R. A. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  21. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  22. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).

Tags

Kræftforskning spørgsmålet 135 melanom spheroids organotypic fuld hudmodel 3D melanom screening screening system
En 3D Organotypic melanom klumpformet hudmodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, I., Kulms, D. A 3D… More

Müller, I., Kulms, D. A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model. J. Vis. Exp. (135), e57500, doi:10.3791/57500 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter