Summary
ここで、両方のアーキテクチャを繰り返す 3 D 脊髄悪性黒色腫回転楕円体皮膚モデルを生成するためのプロトコルを提案する、体内臓器・腫瘍同時に多細胞の複雑さを収容する体系的な実験的介入。
Abstract
人間の皮膚の色素細胞のメラノサイトの悪性化は、増加の転移可能性の非常に積極的な癌悪性黒色腫の形成を引き起こします。最近、モノラル化学療法は対象キナーゼ阻害剤の黒色腫の特定の組み合わせ療法で改善を継続します。まだ、悪性黒色腫では腫瘍に対する耐性がプライマリまたは発癌性容量を取り戻すことにより、新規の治療法に抵抗を開発するため、命にかかわる病気が残っています。悪性黒色腫の治療の成功を改善するために従来の治療アプローチに対して耐性の分子機構の決定は必要である;しかし、革新的な細胞の in vitroモデルが必要です。ご紹介の in vitro三次元 (3 D) 脊髄悪性黒色腫回転楕円体モデル悪性黒色腫の生体内で建築を描くことができますし、新しい洞察を保証があります内腫瘍腫瘍ホスト相互作用だけでなく。モデルには、皮膚一次細胞から成る 3 D 皮膚完全復元モデルの成熟と分化した悪性黒色腫の回転楕円体の定義番号が組み込まれています。埋め込まれた黒色の回転楕円体の細胞の組成と分化の状態は皮膚黒色腫転移の生体内のものと同様です。非対応、増加の利点のための不必要な治療負担を温存しながら併用療法を選択した薬剤のスクリーニングのプラットフォームにレスポンダーの識別をサポート可能性がありますようこの脊髄悪性黒色腫回転楕円体モデルを使用治療上の介在。
Introduction
人間の皮膚は、環境への悪影響1から体を保護する上でさまざまな機能を提供する 2 つの異なるコンパートメントで構成されます。皮膚の下のコンパートメントは、弾性線維結合組織で構成されます。それは機械的な障壁機能を提供、線維芽細胞により合成された緩く接続されているコラーゲンとエラスチン繊維で構成されます。真皮は、上の表皮から両方の肌のコンパートメント間一定の通信による細胞外マトリックスとして作り出される基底膜で区切られます。対照をなして、真皮表皮ケラチノ サイトから主に成っている扁平上皮し、4 つの層に区別できます。常に皮膚細胞の棘と顆粒層の段階を経て角質層に層化から派生する未分化の基底ケラチノ サイトから成っている層植皮2脱水や感染症から身体を守る。メラノサイトは基底膜が揃えし、複数ケラチノ サイトと樹状の拡張を通じて通信します。彼らは、皮膚の老化、免疫、炎症、非黒色腫皮膚癌の誘導など、紫外線の悪影響から皮膚組織を守るためにメラニン色素を生成します。UV 放射線に貢献する悪性黒色腫メラノサイトの変換しかし、です、まだ討論3。
悪性黒色腫の開発は異なる腫瘍進行段階に区別される、特定の遺伝的、形態学的、組織学的変化の4によって特徴付けられます。彼らはいずれかのde novoを起源としています。 またはローカル生得か得られた母斑から良性の腫瘍を引き起こしているメラノサイト増殖の増加します。この前駆病巣を続けます可能性があります悪性初期肥大成長段階 (RGP) 亜流の細胞を含む構造的に変更された異形成組織に変換できます。この初期の腫瘍の進行段階は、表皮、真皮乳頭層内のいくつかの局所浸潤細胞を示す内放射状増殖細胞が特徴です。その後の垂直成長段階 (VGP) 悪性黒色腫の中にセルはすでに皮下5と同様、真皮の深い部分に潜入する基底膜を破り転移性、侵襲性の表現型を表示します。最後に、転移性の悪性黒色腫 (MM) 遠位肝臓、肺、脳の6のような器官に侵入する血液・ リンパのシステム全体に広がって全身転移細胞で最も積極的な進行段階を表します。
日には、外科手術による早期診断では、悪性黒色腫の最も有効な治療法がまだ残っています。遠隔転移症例の予後は、古典的な化学療法レジメンのみ少し生存給付8,9を与えるので特に貧しい7をただし、残ります。ただし、停滞の十年後標的治療の最近の進歩は、悪性黒色腫の予後を大きく改善しています。
2 つの主要なマイトジェン活性化経路、RAS RAF MEK ERK と PI3K AKT PTEN のシグナル伝達経路の制御不全、悪性黒色腫の進行の主要なドライバーを提示は、恒常のプロトオンコジーンの BRAFV600 の点突然変異をアクティブにする場合は特に、Nras 登録で現在10にあります。したがって、対象キナーゼ阻害剤の発明は転移性メラノーマ患者の治療効果を約束しました。この時点までに実施された臨床試験の多くは転移性メラノーマ患者の重要な利益を達成していません。ほぼすべての応答は、主な抵抗性を示した患者の亜種で、部分的です。また、再発につながる二次抵抗性の獲得は、患者11,12の大半にみられた.
単独で突然変異状態の分析は最も強力な治療戦略を開発するための十分なないことが明確になります。新しい高速で信頼性の高い診断ツールは、体系的に記録し、個々 のがん細胞の応答性を分析に必要です。ひと黒色の現在利用可能なデータの大半は、二次元 (2 D) 悪性黒色腫細胞の培養から得られています。3 D で育ったしかし、腫瘍細胞は、リンパ球サブポピュレーションだけでなく癌細胞と周囲のホストの非変形組織間分化癌細胞間クロストークを許可します。したがって、それは最高の前臨床スクリーニングとして使用する黒色腫を開発、3 D 環境を再構築するだろう13,14のモデルします。
Protocol
承認機関のプロトコルを使用してすべての人間の組織の仕事を行った。
1. 人間の皮 (割礼から少年包皮) から真皮と表皮の分離
- 非接着剤無菌細胞培養皿 (Ø 10 cm) に包皮 (通常 1-2 cm2) を置き、リン酸緩衝生理食塩水+の 10-12 ml カバー (pH 7.2 0.9 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2PBS PBS+=)。生殖不能のメスと鉗子を使用してすべての余分な (脂肪) の組織を削除します。
- 3 × 5 mm の部分に皮膚を切り取って、PBS で洗浄し非接着剤無菌細胞培養皿 (Ø 6 cm) に転送。当期ソリューション (PBS で 2 U/mL) の 5-7 ml 組織部分をカバーします。パラフィンの膜と細胞培養ディッシュを封印し、4 ° C で 16 時間インキュベート
- 2 滅菌ピンセットで表皮真皮の一部からを撤回します。個々 の非接着細胞培養皿 (Ø 6 cm) に切り裂かれたティッシュ部分を転送し、PBS+でそれらのそれぞれをカバーします。
2. 表皮からプライマリ ケラチノ サイトの分離
- 慎重にパスツール ピペットを使用して細胞培養ディッシュから PBS+を削除し、PBS の表皮部分 (セクション 1.3 より) を洗浄します。小さな断片 (1 mm2) に表皮を切断し、50 mL の円錐管にそれらを収集します。10 mL 1 を加えてトリプシン-EDTA (37 ° C に予熱) x 37 ° C の水浴中で 5 分間インキュベートし、渦組織懸濁液 2 分ごと。
- 1 mL 牛胎児血清 (FCS) を追加することによって酵素反応を停止します。上下に 4 分泡を避けるためし、泡の形成を試みる 10 mL プラスチック ピペットでピペッティングにより細胞を再懸濁します。
- ピペットにセル ストレーナー (細孔サイズ 100 μ m)、細胞懸濁液は新鮮な 50 mL の円錐管の上に配置、5 mL の PBS で 3 x をすすいでください。200 x g で細胞を遠心分離機の 5 分 1% (v/v) ゲンタマイシンを含む 2-6 mL 培養液中の細胞ペレットを再懸濁します。コート t75 フラスコ細胞培養用フラスコに検定と種子 6 × 105セルのカウントの細胞によって手動でセル数を決定します。
3. プライマリ ケラチノ サイトの栽培
- 手順 2.3 表皮細胞中の 37 ° C および 5% の CO2のセルのインキュベーターで FCS、なし 50-70% の confluency に分離されたプライマリ ケラチノ サイトを孵化させなさい。
- ケラチノ サイトを慎重に通過するメディアを取り出して、5 mL PBS-EDTA を追加し、37 ° C で 10 分間細胞をインキュベート細胞を光学顕微鏡による培養用フラスコからデタッチし始めているかどうかをチェック (4 X 倍率: 細胞は丸い表示されますが、まだ接続されている!)。場合は、新鮮な PBS-EDTA と古い PBS-EDTA を交換し、再 37 ° C で別の 10 分間インキュベート
- 5 ml 1 x 丸い細胞をトリプシン-EDTA まだ 10 mL PBS EDTA で覆われ、37 ° C で 1-3 分間インキュベートして再1 mL FCS を追加することによって酵素反応を停止し、50 mL の円錐管の剥離細胞を収集します。5 分間 200 x g で細胞を遠心分離機、新鮮なコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコにケラチノ サイトの中規模、およびシード 6 × 105細胞ペレットを再懸濁します。
注: 脊髄皮膚の再構築を生成するには、プライマリ ケラチノ サイト使用してください遅くとも 3-4 の通路。
4 主な真皮線維芽細胞の分離
- 小さな断片 (1 mm2) に皮膚の組織 (セクション 1.3 より) をカットし、50 mL の円錐管にそれらを転送します。10 mL のコラゲナーゼ溶液 (PBS+で 5 U/mL) を追加し、37 ° C の水浴中で 45 分間インキュベート組織の部分と 5 分の 200 x g で細胞の混合物を遠心分離機します。
- 2 回 10 mL DMEM 含む 4.5 G/L グルコースと L-グルタミンが L ピルビン酸、細胞ペレットを洗浄します。最後に 2 ml の 1% (v/v) ゲンタマイシンと 10% の FCS を含む DMEM の組織部分を再懸濁します。T25 細胞培養用フラスコに移して、一晩それら 37 ° C、5% CO2でセルのインキュベーターで孵化させなさい。
注: 小さなボリュームができ組織破片から移行する線維芽細胞培養用フラスコにアタッチすることを強制します。 - 次の朝は、別 6 mL DMEM、ゲンタマイシン、FCS を追加し、37 ° C で 2-3 日間インキュベート細胞が 80-90% の confluency に達するまでします。
5 主な線維芽細胞の培養
- 繊維芽細胞を通過するには、媒体を取り外し、付着性のセル PBS で洗浄します。5 mL 1 を加えてトリプシン-EDTA x 37 ° C で 3 分間インキュベートし、
- 5 mL DMEM/FCS を追加することによって酵素反応を停止し、50 mL の円錐管の剥離細胞を収集します。5 分間 200 x g で細胞を遠心分離機、DMEM 培地でペレットを再懸濁しますで新鮮なコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコに 6 x 10 の5セルをシードします。
注: 脊髄皮膚の再構築を生成するには、主な線維芽細胞使用してください遅くとも 4-6 を通過します。
6. 悪性黒色腫 3 D 回転楕円体を介してハンギング ドロップ法の生成
- 培養メラノーマ細胞 (例えば451-LU、または関心の悪性黒色腫細胞線) RPMI 10% FCS15を含むを使用して一般的なプロトコルに従って。
- 同様のサイズと品質の黒色腫の回転楕円体を生成するには、PBS のメラノーマ細胞を洗浄、細胞培養用フラスコ、室温 (RT) で 3-5 分間インキュベート トリプシン-EDTA、T175 で細胞を PBS で 1 x 5 mL を加えます。5 mL RPMI/10% FCS を追加してトリプシンを中和します。収穫 200 x g で 5 分間の遠心分離によって細胞再診断でカウントすることによって決定される 10,000 のセル/mL の最終的な集中に RPMI/FCS で細胞ペレットを中断します。
- 電子マルチ ピペットを使用して滅菌非接着細胞培養ディッシュ (Ø 10 cm) の蓋の内側の表面にセル中断の 40 x 25 μ (= 250 セル) を見つけます。高速ではスムーズな動きで蓋を振り返るし、5 mL の PBS を含むそれぞれの細胞培養皿の上に置きます。
- 「ハンギング ドロップ料理」10-14 日間、使用細胞の種類に応じて細胞インキュベータ 37 ° C、5% CO2で文化。
注: MM 成長期から細胞は、通常より速く成長し、RGP や VGP 由来悪性黒色腫細胞と比較してハンギング ドロップでより強固スフェロイドを形成します。個別の評価では、回転楕円体の成長倍率の双眼鏡の下または光学顕微鏡 (4 倍) の下を確認します。通常、回転楕円体は双眼鏡のペアまたは光学顕微鏡 (4 倍) で 48 時間後に検出になります。10-14 日後倍率デバイスを使用せずに表示されます。
- 「ハンギング ドロップ料理」10-14 日間、使用細胞の種類に応じて細胞インキュベータ 37 ° C、5% CO2で文化。
- 最初のドロップダウンをスポッティングした後 5 日間は、各ドロップに培 RPMI/10% FCS の 10 μ L を追加します。その後、他の毎日媒体の 10 μ L を交換します。電子ディスペンサーの使用は、このステップで非常に便利です。
- セルの種類に応じて優しく洗浄して PBS で細胞培養皿のふたによって 10-15 日後回転楕円体 (詳細についてはセクション 10 を参照してください) を収穫します。新鮮な非接着性細胞の培養皿にそれらを収集します。
注: 栽培期間によって異なります腫瘍成長期メラノーマ細胞の彼らは当初得られたとき例えば、451 LU 細胞由来スフェロイド成長直径約 500 μ m にハンギング ドロップ15 で培養 12 日以内.
7. 切片における皮膚の真皮のコンパートメントの世代を再構築します。
- 24 ウェル セル多孔膜挿入 (サイズ 8 μ m の細孔) 24 ウェルに配置されますを使用して皮膚モデルを生成します。
注: ぶら下げを使用しないことを確認してください、彼らは後の段階で空気液体培養 6 ウェル プレートに配置されますので、挿入を立っています。 - ゲル中和ソリューション (GNL)15として血管内皮成長メディア (EGM)16,17MM と呼ばれ、文化メディアを準備します。凝固を防ぐためには、ストア コラーゲン I 型 (通常はラットの尾、3.5 4 mg/mL 0.02 N 酢酸) から氷の上まで使用、室温ゲル開始するため
- 再 GNL の挿入あたり 1 x 105の線維芽細胞を中断し、すぐに細胞懸濁液を 500 μ L/挿入の最終巻の 1:3 の割合でコラーゲンに混ぜてください。泡が皮膚の品質を損なうことがありますバブル形成を避けるために上下に軽くピペッティングでミックスを再構成します。
- 無菌フードで 30 分間常温媒体なしそれらを保つことによって解決する個々 の皮膚ゲルを許可します。その後 4.5 G/L グルコース、1% を含む DMEM にゲルをカバー L グルタミン、10 %fcs と L-ピルビン酸、37 ° C で一晩インキュベートし、
8. 切片における皮膚の表皮のコンパートメントの世代を再構築します。
- 次の日皮膚ゲルからメディアを取り出して、EGM メディア (10 %fcs、1 %penstrep, 10 mg/mL ゲンタマイシン) 37 ° C で 2 時間でそれらを平衡媒体を撤回し、慎重に種子 1 x 105ケラチノ サイト 100 μ L EGM 皮膚のゲルの上で再停止されます。
- 皮膚の区画に準拠するケラチノ サイトを許可する 37 ° C で 1.5 h の再構築を孵化させなさい。
注: このインキュベーション時間の間に、ゲルは線維芽細胞収縮により縮小し、したがって、少なくとも部分的に挿入壁からデタッチ開始されます。 - 約 800 μ L EGM で同等の肌をカバーし、小 (白) ピペット先端挿入壁から残留ゲルを慎重に取り外します。肌と同等の EGM に 37 ° c、5% CO2セルのインキュベーターで 7 日間浸漬を文化し、一日おきに媒体を変更します。
注: この時間の間に同等の肌が大幅に縮小します。
9. 空気液体培養切片における皮膚の再構築します。
- 8 日目、各転送 6 ウェル プレートの各ウェルに挿入します。のみ皮膚再構成付属は井戸の底から媒体が媒体に覆われていない各ウェルに MM 媒体の 1.2-1.4 mL を追加します。
メモ: 気液界面培養表皮部分と完全角質層 (角質層) の確立の層別化をできます。 - 次の 10-17 日間 9.1 一日おきの項で述べたように媒体を変更します。この期間中に薬や媒体に必要な他の刺激を追加します。さらに分析、例えば、免疫組織化学的解析 (図 1) のピンセットを使用して微多孔性膜挿入から完全皮膚再構成を慎重に取り外します。
10 脊髄悪性黒色腫回転楕円体の皮膚モデルの生成
- 切片における皮膚の再構築の皮膚のコンパートメントに悪性黒色腫の回転楕円体を統合して慎重にすすいでください (手順 6.4) の後では絞首刑のふたを回転楕円体 PBS でドロップ細胞培養ディッシュ。生殖不能の非接着細胞培養皿で 10-20 回転楕円体/挿入を収集します。パスツール ピペットの過度の PBS を慎重に取り外します。
- EGM の可能な最小ボリュームの回転楕円体を吸い出しなさい。この時点で観察し、さらに倍率デバイスがなくても、肉眼で回転楕円体を数えます。10.1 のステップのとおり皮膚モデル/ゲルあたり 10-20 回転楕円体を取る。
- (ステップ中 7.3)、線維芽細胞を含む GNL の適切なボリュームに転送してコラーゲンの種類ミックス私。このステップから、セクション 7.3 9.1 で説明を進みます。
注: 腫瘍回転楕円体は、白い斑点 (図 2) として皮膚ゲルに表示されます。
Representative Results
悪性黒色腫の転移の治療の成功は、腫瘍細胞だけでなく腫瘍の間と未変換のホスト間のクロストークによる影響があります。がんの in vitroの切片のモデルの開発の目的は、3次元組織と人間のメラノーマの複雑さを要約するだろう適切な前臨床テスト システムを提供する体内。これにより切片環境と並行して周囲の主な組織に悪影響内腫瘍の治療の影響を研究。
最高の切片皮膚モデルを開発し、一次電池の品質が不可欠です。通常より少なく区別されているため主な大人の皮膚細胞と比較して少年主線維芽細胞とケラチノ サイト、使用に有利です。少年の皮膚細胞かプロトコルのセクション 1-5 で説明したように少年の包皮から分離することもは、出生前の主な線維芽細胞とケラチノ サイトとして企業から購入します。購入する場合、ドナー固有の結果、例えば、薬剤感受性を避けるために異なるドナーからのセルの順序が必要です。図 3の方式としては、一連のプロトコルが表示されます。
3 D 全肌対応の品質管理には、免疫組織化学的解析が必要です。第一印象は、ヘマトキシリン ・ エオジンによって得ることができるセクション (3 μ m) を埋め込んだ (H & E) パラフィンの染色します。表皮分化の品質の詳細に分析し、真皮と表皮の基底膜の形成、表皮成層マーカーに対する特異抗体を用いた免疫組織化学的解析を必要とします。これにより、未分化、増殖性が高いセル間を区別する基底膜近くに位置する高い区別し、異なる表皮層の形成によって角質層で細胞を間に角質化.免疫組織学的染色で示すように、 (図 4)、全体表皮ケラチノ サイトの分化は正常な皮膚のように達成できる: 主として表皮下層から未分化細胞 (層脛と棘) 10、involucrin、スープラ基底の層 (角質層と顆粒層) から区別された細胞染色ケラチン陽性間ケラチン 14、陽性染色します。したがって、フィラグリンの染色は角質層の非常に区別された細胞で観察のみできます。最も重要なは、ラミニン 5 の染色には、生理学的人工皮膚再構成の皮膚のコンパートメントに表皮を接続する基底膜が生成されたこと明らかにします。これは、ホスト メラノーマ細胞または回転楕円体の生理学的および病態生理学的解析、通信切片微小環境が生成されていることを証明します。
悪性黒色腫の薬剤のスクリーニングを目的としては、 de novo黒色腫巣形成18,19を許可する完全皮膚同等の真皮に単一のメラノーマ細胞を統合できます。したがって、メラノーマ細胞は一緒に 5 分 200 × g で遠心 5:1 の割合で一次繊維芽細胞と結合され、コラーゲンと混合する前に GNL で再停止されます。その結果、悪性黒色腫細胞巣は皮膚のコンパートメントで自発的に形成されます。私たちの経験によると転移の成長のセルのみ相 RGP や VGP15の悪性黒色腫細胞と比較して、フォームの適切な巣です。1 つのこれらの種類のモデルの主な欠点は数と形成された悪性黒色腫巣のサイズは予測できないと個々 の皮膚の間に異なる場合がありますという事実は、任意の処理とは独立して再構築します。たとえば、1000 個の細胞が真皮のコンパートメントにシードは 100 セルまたは各 (図 5) 10 細胞から成る 100 巣から成る 10 の巣を得るかもしれない。これらの生物学的変数に現在 3 つの欠陥: 数と形成された悪性黒色腫巣のサイズは予測できます最初に、。第二に、生体内で転移悪性黒色腫巣より通常大きくより複雑な内腫瘍の多様性; を展示そして第三に、腫瘍巣モデルの限られた寿命のため治療が早期に開始され、その結果ではなく腫瘍巣を既存の回帰ではなく腫瘍の伸長を阻害します。
これらの制限脊髄悪性黒色腫回転楕円体の皮膚モデルを克服するために生成できます。養殖 250 の転移性のメラノーマは 14 日20の吊りのセルを削除、回転楕円体が再現性をもって生成最終的な直径約 500 μ m 模倣以外のコンパクトな構造を提示細胞血管柄付き実行可能な悪性黒色腫から成る腫瘍ノード、微小転移または間キャピラリー マイクロ地域固形腫瘍21,22の。一般に、任意の悪性黒色腫細胞株は、絞首刑を介して回転楕円体の生成に適したメソッドをドロップただし、由来細胞より高度な転移性腫瘍の段階フォーム初期進行段階、例えば、RGP 由来細胞株と比較してより強固回転楕円体。
絞首刑の粘度を高めるために適切な回転楕円体形成と便利ですいくつかの細胞の培養液をドロップします。これは、培養培地に 10-50% メチル セルロース添加によって達成できます。メチル セルロースの貯蔵液、オートクレーブ 1.2 g のメチル セルロース一緒に 100 mL ガラス瓶の中の磁気攪拌棒。4 ° C で 100 mL 予熱 (60 ° C) 中、室温で 20 分、さらに 1-2 時間の攪拌を追加します。5,000 × g で 2 h の原液を遠心し、使用するまで 4 ° C で粘性上清を保存します。
完全皮膚黒色腫回転楕円体モデルの適切な検証が定義された番号黒色回転楕円体ことができます - 少なくとも統計的に - が、真皮の線維芽細胞・ コラーゲンに統合という事実によって私は皮膚モデルの構築の 1 日目で足場を提供できるように25-27 日間表皮分化を共同開発しています。皮膚の透明な内に白い斑点がゲルし、倍率デバイス (図 2) を使用せずに見ることができるよう、回転楕円体が表示されるため、回転楕円体の収量は, 播種後直接分析できます。その結果、港湾成熟した黒色腫スフェロイド培養体外内腫瘍の最高レベルを示す約 42 日間の合計であった細胞分化15のこと 3 D 皮膚モデルが生成されます。
組織学的外観と非血管ひと悪性黒色腫の皮膚転移体内15 (図 6 のいずれかに非常に類似する悪性黒色腫を回転楕円体の細胞の分布を明らかにする H & E 染色皮膚黒色腫回転楕円体モデル).悪性黒色腫細胞の 2 つの集団がこれらの条件の下で明確に区別できる: 末梢増殖個体との主にで構成される中央亜種萎縮し、アポトーシスや壊死細胞、いわゆる形成「壊死」センター。生活と集団を増殖の免疫組織化学的には、壊死の中心部の細胞を TUNEL 染色15が視覚化できるに対しにキ-67、増殖マーカーに対する抗体を用いて検出できます。腫瘍細胞の亜集団のこの特定の分布は、栄養素や中部異化廃棄物が蓄積する場所の酸素の不足に起因する回転楕円体サイズ (≥500 μ m)、によって保証されます。信頼性と再現性のある切片の世代は、ここで指定したプロトコルに従うと全層皮膚モデルは人間の悪性黒色腫の皮膚転移を模したヒトメラノーマ スフェロイドを埋め込まれています。このモデル含める薬剤テストのアプリケーション、毒素のスクリーニング化粧品化合物の影響またはレーザー黒色伸長と治療に関する治療。
図 1: 3 D 脊髄皮膚再構築の栽培浸水中と気液界面。日主ケラチノ サイトが主な線維芽細胞から成る皮膚のコンパートメントの上にシード 0 に埋め込まれたコラーゲン タイプ私行列。3 D 肌再構築滞在 7 日間 EGM の水中栽培、挿入壁から分離させ、縮小し始めます。8 日目に挿入が 6 井戸に転送され、表皮の成層を許可する気液界面での栽培します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 皮膚のコンパートメントに埋め込まれた黒色回転楕円体が白い斑点として表示されます。一方、3 D 皮膚再構成、黒色回転楕円体の定義された数の皮膚のコンパートメントの準備は、私はミックス型コラーゲン線維芽細胞に追加できます。皮膚のゲルが定着している、黒色回転楕円体を白い斑点として表示されるようになります。
図 3: 切片の 3 D 皮膚モデル構築のスキーム。皮のサンプルから脂肪組織を除去し、小さな断片に切断します。当期ソリューション 4 ° C で一晩培養真皮から表皮の分離が容易になります。分離主線維芽細胞とケラチノ サイトを別々 に栽培し、通路 4-6 と 3-4 間でそれぞれ使用ください。その後、3 D 皮膚モデルの生成は、プロトコルで説明されているように進むことができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 3 D 脊髄皮膚再構築ひと正常皮膚ような分化のレベルが表示。パラフィン皮膚同等のセクション(A) 通常と比較して人間の皮膚 (B) 染色によるケラチン 14 の式 (赤: λex 554 nm; λem 568 nm) と 10、involucrin (緑: λex 490 nm; λem 525 nm)、フィラグリン (緑: λex 490 nm; λem 525 nm)、およびラミニン 5 (緑: λex 490 nm; λem 525 nm)、共焦点蛍光顕微鏡を用いた分析と。細胞核を視覚化した DAPI 染色 (青: λex 340 nm; λem 488 nm)。3 D 全層皮膚同等明らかに適切な表皮成層のひと正常皮膚に見られるように、表皮の独立した層を形成の免疫組織化学的検査。一方、表皮下層からケラチン 14 陽性染色より多くはケラチン 10 と involucrin 染色を示したスープラ基底層から細胞を区別しました。角質層に近い高度に分化した細胞は、フィラグリンを表明しました。ラミニン 5 染色生理表皮真皮コンパートメント (最低パネル) への接続に基底膜を生成することを示しています。この図は、Voersmannらから撮影されています。15権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 数と自発的に形成された悪性黒色腫巣のサイズは予測できません。De novo黒色腫巣形成における皮膚悪性黒色腫の定義された数を混合することによって対応が可能の皮膚のコンパートメントにコラーゲン タイプに両方のセル型を埋め込むには主な線維芽細胞と細胞私行列。数と自発的に形成された悪性黒色腫巣のサイズは約 21 日後に成熟した 3 D 肌再構築からのみ分析できます。下図の 2 つのサンプル (A) から (B) 番号および黒色腫巣のサイズは個々 の皮膚再構築の間に異なる場合があります。結果として、これらのモデルを検証し、治療的効果を予測することは困難です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 黒色腫スフェロイド皮膚同等に統合要約人間の皮膚悪性黒色腫の転移の重要な機能です。H & E 染色等価の皮膚に埋め込まれた腫瘍スフェロイドのパラフィン切片は、非血管人間皮膚悪性黒色腫転移は生体内で重要な機能を共有する回転楕円体を明らかにしました。細胞の 2 つの集団は明確に識別: 周辺生活集団との主にで構成される中央の subpopulation 萎縮し、アポトーシスや壊死細胞、「壊死」拠点の形成。この腫瘍細胞の亜集団の配布は、回転楕円体サイズによって保証されます。この図は、Voersmannらから変更されています。15権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
紹介脊髄悪性黒色腫回転楕円体の皮膚モデル保証内腫瘍のより深い理解のための新たな洞察と腫瘍との相互作用、悪性化の分子機構を研究する高度なスクリーニング プラットフォームを提供することがあり、療法の抵抗は、将来的に。
最高を保証する生理学的および生体内で肌の条件を模倣を再構築、一次電池の品質が最も重要であります。前述のように、少年または出生前皮膚細胞は最低の差別化グレードを表示し、全層皮膚の同等物を生成するために最適であるため。最初の可能な品質コントロール ケラチノ サイトを播種し、, ゲル EGM (プロトコルのセクション 8.2 と 8.3) に後 2 日目で皮膚の収縮の程度であります。皮膚ゲルが線維芽細胞の最高の品質で最もを縮小されます。また、数が少なすぎる、またはあまりにも多くの線維芽細胞の統合は、皮膚の収縮とその結果、表皮の真皮のコンパートメントに添付ファイルを損なうことがあります。このプロセスは、真皮と表皮の細胞間の広範なクロストークを必要とするためこれは、ターンで表皮の分化が侵害されます。
初代培養細胞の品質はまた批判的に細胞の通路と同様に、細胞密度に依存します。ケラチノ サイトが ≥80% の confluency に成長した場合、彼らはすぐに増殖を停止し、区別するために開始。したがって、40-70% の confluency に継代した文化のそれらとない通路 3-4 より後でそれらを使用することが重要です。線維芽細胞は敏感が、4-6 を通過以降は使用しないでください。すべての初代培養細胞および細胞脊髄悪性黒色腫回転楕円体皮膚モデルを生成するために使用を培養することも注意してください無料の抗生物質の汚染の危険性が高いため。ただし、抗生物質添加は個々 の細胞の生理学を変更し、したがって皮膚と同等の品質が低下します。
一般に、腫瘍スフェロイドの形成はたて患者材料から分離された腫瘍細胞と腫瘍細胞のほとんどすべての種類から可能です。使用細胞の種類に応じて最適な回転楕円体のサイズを得るため初期細胞数および/または栽培時間が異なる場合があります。150-200 μ m にサイズアップ、回転楕円体に含まれるすべてのセルまだ十分に単純拡散を介して栄養素を供給します。サイズ ≥500 μ m のみ回転楕円体は、細胞の分化の高度を示すし、非血管腫瘍組織22の典型的な特徴を表します。
脊髄悪性黒色腫-回転楕円体-皮膚-モデル開発が適して特に腫瘍ホストの相互作用を研究し、悪性黒色腫薬の生体内での下でテスト-条件15が好き。まだ、生体内で悪性黒色腫の環境はさらに複雑、様々 な腫瘍細胞の種類、免疫細胞や血管内皮細胞などをかくまっています。適切な主な免疫細胞の組織適合性の問題に直面している、のでこれらのモデルはまだ免疫治療法を適切に監視することができます。
それにもかかわらず、黒色回転楕円体、新鮮単離患者材料から生成され、一度に完全皮膚再構成に含まれる、ことがあります個々 の薬剤としてスクリーニング プラットフォーム。悪性黒色腫の転移の部分の皮膚再構築への統合も考え合わせた治療的なアプローチの薬の組み合わせをテストするのにです。前臨床試験で切片の 3 D 皮膚黒色腫モデルを含む最も有望な新しい治療概念のみが取られる前方臨床テストにこれの潜在的な新しい治療法の離職率を減らすようにする可能性が高いです。疾患との臨床試験で治療の成功率を増加します。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
著者は、3 D 脊髄悪性黒色腫-回転楕円体-皮膚-モデルを確立し、優れたプロトコルを提供するためハンナ Voersmann をありがとうございます。著者はまた、貴重なテクニカル サポートのシルクはブッシュを感謝します。仕事は BMBF e によって支えられた: 医学プログラム「悪性黒色腫感度」031A423A。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
| Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
| Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
| 24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
| cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
| Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
| Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
| Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
| juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
| juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
| DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
| Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
| EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
| Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
| Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
| Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
| dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
| L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
| anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
| anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
| anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
| anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
| secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
| secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |
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