Summary
여기, 우리이 두 아키텍처는 3D organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델을 생성 하는 프로토콜을 제시 하 고 다세포 복잡 한 기관/종양에 vivo에 의 하지만 같은 시간에 수용 체계적인 실험 내정간섭입니다.
Abstract
Melanocytes, 인간의 피부 색소 세포의 악성 변화 하면 흑색 종, 매우 공격적인 암 증가 전이성 잠재력의 형성. 최근, 모노-chemotherapies 타겟된 kinase 억제제와 흑색 종 특정 조합 치료 요법에 의해 향상 계속 합니다. 아직도, 전이성 흑색 종 종양 기본 저항을 전시 또는 그로 인하여 tumorigenic 용량을 되 찾고 새로운 치료에 저항을 개발 하기 때문에 생명을 위협 하는 질병 남아 있습니다. 악성 흑색 종의 치료 성공을 개량 하기 위하여 기존의 치료 방법에 대 한 저항을 부여 하는 분자 메커니즘의 결정이 필요; 그러나, 그것은 혁신적인 세포 생체 외에서 모델을 요구 한다. 여기, 우리는 체 외에서 3 차원 (3D) organotypic 흑색 종 회전 타원 체 모델을 vivo에서 아키텍처의 악성 흑색 종 묘사 수에 새로운 통찰력을 보증 수 소개 종양-호스트 상호 작용 뿐만 아니라 내 종양. 모델의 성숙 하 고 차별화 된 흑색 종 spheroids 기본 피부 세포로 구성 된 3 차원 인간의 전체 피부 재건 모델에 정의 된 숫자를 포함 합니다. 포함 된 흑색 종 spheroids의 세포 구성과 차별화 상태 피부 흑색 종 전이 비보중 하나 비슷합니다. 비-초 동의 이익 증가 대 한 불필요 한 치료 부담을 덜고 동안 조합 치료를 선택한 플랫폼을 심사 하는 마약에 응답자의 식별을 지원 수 있습니다이 organotypic 흑색 종 회전 타원 체 모델을 사용 하 여 치료 내정간섭입니다.
Introduction
인간의 피부는 불리 한 환경 효과1에서 신체를 보호에 다른 기능을 제공 하는 두 개의 개별 구획 구성 됩니다. 석면 탄성 결합 조직 낮은 피부 구획에 의하여 이루어져 있다. 그것은 기계적 장벽 기능을 제공 하는 섬유 아 세포에 의해 합성 하는 느슨하게 연결 된 콜라겐과 엘라 스 틴 섬유의 구성 됩니다. 진 피는 두 피부 구획 간의 지속적인 통신 인 기질으로 생산 되는 기저 lamina에 의해 위쪽 표 피에서 분리 된다. 달리 진 피, 표 피 keratinocytes 이루어져 주로 편평 상피 이며 4 개의 층으로 분화 될 수 있다. 지층 basale undifferentiated 기초 keratinocytes 끊임없이 피부 조상 세포에 지층 corneum 지층 spinosum 그리고 지층 granulosum 의 단계를 통해 stratifying에서 파생 되는 구성 탈수 및 감염2에서 신체를 보호 하. Melanocytes 기저 막에 정렬 하 고 여러 keratinocytes와 수지상 확장을 통해 전달 합니다. 그들은 피부 노화, 면역 억제, 염증, 및 비 흑색 종 피부 암의 유도 같은 UV 방사선의 부작용에서 피부 조직을 보호 하기 위해 멜 라 닌 색소를 생성 합니다. 그러나, 악성 흑색 종, melanocytes의 변화에 UV 방사선 기여 논쟁3의 밑에 아직도 이다.
흑색 종 개발은 다른 종양 진행 단계로 구분 하 고 특정 유전 형태 론 적, 조직학 변화4특징. 그들은 어느 드 노 보 발생 또는 melanocyte 확산 양성 신 생물 발생의 증가 타고 난 또는 인수 모 반 때문에 로컬에서. 이 선구자 병 변은 악성 초단 방사형 성장 단계 (까지) 계속 atypic 셀을 포함 하는 구조적으로 수정된 dysplastic 조직으로 변환할 수 있습니다. 이 초기 종양의 진행 단계는 광선으로 젖꼭지 피부 내의 몇 로컬 침략 셀을 보여주는 표 피 내에서 증식 하는 세포에 의해 특징입니다. 후속 수직 성장 단계 (VGP) 흑색 종 동안 세포는 이미 진 피 뿐만 아니라 피하 조직5의 더 깊은 부분에 침투 하기 위해 기저 lamina를 통해 침입 하 여 전이성 및 침략 적 표현 형을 표시. 마지막으로, 전이성 흑색 종 (MM) 전이성 세포 침공 distally 간, 폐, 및 뇌6같은 장기에 혈액과 림프 시스템을 통해 체계적으로 확산 가장 적극적인 진행 단계를 나타냅니다.
날짜 하려면, 조기 진단 수술 뒤에 여전히 악성 흑색 증의 가장 효과적인 치료 남아 있습니다. 그러나 먼 전이 환자에 대 한 예 후, 클래식 화학요법 식이요법만 작은 생존 혜택8,9부여 하기 때문에 특히 가난한7, 남아 있다. 그러나, 침체의 십 년간 후에 표적으로 한 치료의 최근 발전 상당히 개선 악성 흑색 종의 예 후.
두 가지 주요 물질 활성화 경로, RAS-영국 공군-MEK-ERK 및 PI3K-AKT-PTEN 신호 통로의 Dysregulation constitutively proto-oncogenes BRAFV600의 점 돌연변이 활성화 하는 경우에 특히 흑색 종 진행의 핵심 드라이버를 제시 하 고 NRAS는 현재10. 이 따라, 타겟된 kinase 억제제의 발명 전이성 흑색 종에 고통 받는 환자에 대 한 치료 혜택을 약속 했다. 다양 한 임상 시험이이 시점에 실시 하지 전이성 흑색 종 환자에 대 한 상당한 혜택을 달성 했다. 거의 모든 응답은 부분, 기본 저항을 보여주는 환자의 부분 모집단. 또한, 보조 저항 재발로 이어지는 인수 환자11,12의 대부분에서 관찰 되었다.
그것은 분명 혼자 돌연변이 상태의 분석은 가장 강력한 치료 전략을 개발 하는 충분 한 된다. 새로운 신속 하 고 신뢰할 수 있는 진단 도구는 체계적으로 기록 하 고 개별 암 세포의 응답을 분석 하는 데 필요한. 인간 흑색 종에 현재 사용할 수 있는 데이터의 대부분을 2 차원 (2D) 흑색 종 세포 배양에서 가져올 되었습니다. 그러나 종양 세포,, 3d에서 성장 차별화 된 암 사이 세포 누화: 암 세포와 주변 호스트 변환 비 조직 뿐만 아니라 셀 모집단 수 있습니다. 따라서 것이 좋습니다 있는 흑색 종 개발, 전 임상 심사로 사용할 수 3D 환경 재구성13,14모델.
Protocol
모든 인간의 조직 작업 승인된 기관 프로토콜을 사용 하 여 수행 되었다.
1. 인간의 피부 (할례에서 청소년 포 피)에서 진 피와 표 피의 분리
- 비 접착식 멸 균 셀 문화 접시 (Ø 10 c m)으로 포 피 (보통 1-2 cm2)를 놓고 염 인산 염 버퍼+ 의 10-12 mL와 함께 그것을 커버 (PBS, 0.5 m m MgCl2, 0.9 m m CaCl2, pH 7.2 PBS+=). 모든 초과 (지방) 조직 살 균 메스와 집게를 사용 하 여 제거 합니다.
- 3 m m x 5 m m 조각으로 피부를 잘라, PBS와 그들을 세척 하 고 비 접착식 멸 균 셀 문화 접시 (Ø 6 cm)에 그들을 전송. 5-7 mL dispase 솔루션 (PBS에 2 U/mL)의 조직 조각을 커버. 파라핀 영화와 셀 문화 접시 및 4 ° c.에 16 h에 대 한 품 어
- 두 살 균 겸 함께 상피 피부 부분에서 철회. 개별 비 접착제 셀 문화 요리 (Ø 6 cm) 해 부 조직 조각을 전송 하 고 PBS+를 가진 그들의 각각을 커버.
2. 표 피에서 기본 Keratinocytes의 격리
- 조심 스럽게 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀 문화 접시에서 PBS+ 를 제거 하 고 씻어 PBS와 표 피 조직을 조각 (섹션 1.3). 작은 조각 (1 m m2)으로 표 피를 잘라내어 50 mL 원뿔 튜브에 수집. 10 mL 1 추가 트립 신-EDTA (37 ° C에 미리 데워) x 37 ° c.에 물 욕조에 5 분 동안 품 어와 와 동 조직의 서 스 펜 션 마다 2 분입니다.
- 1 mL 송아지 태아 혈 청 (FCS)를 추가 하 여 효소 반응을 중지 합니다. 4 분 거품을 피하기 위해 거품 형성을 시도 대 한 10 mL 플라스틱 피 펫으로 아래로 pipetting으로 세포를 resuspend.
- 피펫으로 세포 현 탁 액 셀 스 트레이너 (기 공 크기는 100 µ m)에 신선한 50 mL 원뿔 튜브 위에 놓이고 5 mL PBS와 함께 3 x 린스. 5 분 Resuspend 셀 펠 릿 1% (v/v) gentamycin을 포함 하는 2-6 mL 문화 매체에 대 한 200 x g에서 세포를 원심. T75 셀 문화 플라스 크로 수동으로 hemocytometer 및 씨앗 6 x 105 셀에 계산 셀에 의해 셀 수를 결정 합니다.
3입니다. 기본 Keratinocytes의 재배
- 단계에서 2.3 keratinocyte 매체에서 37 ° C, 5% CO2 셀 인큐베이터에서 FCS, 없이 50-70 %confluency 절연 기본 keratinocytes를 품 어.
- Keratinocytes는 신중 하 게 통로를 매체를 제거 하 고, 5 mL PBS-EDTA, 추가 하 고 37 ° c.에서 10 분에 대 한 셀을 품 어 세포는 가벼운 현미경 문화 플라스 크에서 분리 하기 시작 했습니다 경우 확인 (4 배 확대: 셀 둥근 표시 되지만 여전히 첨부!). 그렇지 않으면, 신선한 PBS-EDTA와 오래 된 PBS-EDTA를 대체 하 고 다시 37 ° c.에 또 다른 10 분 동안 품 어
- 추가 5 mL 1 x 둥근된 세포를 트립 신-EDTA 여전히 덮여 10 mL PBS-EDTA와 다시 37 ° c.에 1-3 분 동안 그들을 품 어 1 mL FCS를 추가 하 여 효소 반응을 중지 하 고 50 mL 원뿔 튜브에서 분리 된 세포를 수집 합니다. 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심, 신선한 T75 셀 문화 술병으로 keratinocyte 매체, 및 씨앗 6 x 105 셀에 펠 릿을 resuspend.
참고: organotypic 피부 재구성을 생성 하려면 기본 keratinocytes 사용 되어야 한다 늦어도 3-4을 통과 보다.
4. 진 피에서 기본 섬유 아 세포의 고립
- 작은 조각 (1 m m2)으로 피부 조직 (단원 1.3)을 잘라내어 50 mL 원뿔 튜브로 그들을 전송. 10 mL 콜라-솔루션 (PBS+에 5 U/mL)을 추가 하 고 37 ° c.에 물 욕조에 45 분 동안 품 어 조직 조각과 5 분 동안 200 x g에서 셀의 혼합 원심
- 10 mL DMEM 포함 4.5 g/L 포도 당과 L-글루타민, 두 번 사용 하지 않고 L Pyruvate 셀 펠 릿을 세척. 마지막으로 DMEM gentamycin 1% (v/v) 및 10 %FCS 2 mL에 조직 조각을 resuspend. T25 셀 문화 플라스 크에 그들을 전송 하 고 37 ° C, 5% CO2 셀 인큐베이터에서 밤새 그들을 품 어.
참고: 작은 볼륨 조직 파편 마이그레이션할 fibroblasts 있으며 문화 플라스 크를 연결 하는 그들. - 다음날 아침, 다른 6 mL DMEM/Gentamycin/FCS를 추가 하 고 셀에는 80-90 %confluency 도달 했습니다 때까지 37 ° C에서 2-3 일 동안 품 어.
5입니다. 기본 섬유 아 세포의 배양
- 섬유 아 세포를 통과 하는 매체를 제거 하 고 PBS와 부착 세포를 씻어. 5 mL 1 추가 트립 신-EDTA x 37 ° c.에 3 분 동안 품 어 및
- 5 mL DMEM/FCS를 추가 하 여 효소 반응을 중지 하 고 50 mL 원뿔 튜브에서 분리 된 세포를 수집 합니다. 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 DMEM 매체에 펠 릿을 resuspend 하 고, 씨앗 6 x 105 셀 신선한 T75 셀 문화 술병으로.
참고: organotypic 피부 재구성을 생성 하려면 기본 fibroblasts 사용 되어야 한다 늦어도 4-6을 통과 보다.
6. 3D 흑색 종 Spheroids 메서드를 통해 걸려 드롭의 세대
- 문화 흑색 종 세포 (예를들면, 451-루, 또는 관심의 모든 흑색 종 세포 라인) 일반 프로토콜을 사용 하 여 10% FCS15포함 된 RPMI에 따르면.
- 비슷한 크기와 품질의 흑색 종 spheroids 생성, PBS에 흑색 종 세포를 씻어, 1 x는 T175 셀에 PBS에 트립 신-EDTA 문화 플라스 크, 세포 및 실 온 (RT)에서 3-5 분 동안 품 어의 5 mL을 추가. 5 mL RPMI/10% FCS를 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 5 분에 대 한 200 x g에서 원심 분리에 의해 셀 다시 중단 셀 펠 릿 RPMI/FCS에 10000 셀/mL는 hemocytometer에 계산 하 여 결정의 최종 농도에 추수.
- 자리는 세포 현 탁 액 살 균 비 접착제 셀 문화 접시 (Ø 10 cm)의 뚜껑의 안쪽 표면에 전자 멀티 피 펫을 사용 하 여의 (= 250 셀) 40 x 25 µ L. 빠른 하지만 부드러운 움직임, 뚜껑을 돌아서와 5 mL PBS를 포함 하는 각 셀 문화 접시에 놓습니다.
- 문화 "드롭 요리"에 걸려 37 ° C, 5% CO2 셀 인큐베이터 사용 셀 종류에 따라 10-14 일.
참고: m M 성장 단계에서 세포 일반적으로 빨리 성장 고 매달려 드롭까지 또는 VGP에서 파생 된 흑색 종 세포에 비해 더 단단한 spheroids를 형성 한다. 개별 평가 대 한 회전 타원 체 성장 쌍안경의 쌍에서 또는 가벼운 현미경 (4 배 확대) 아래를 관찰 합니다. 일반적으로, spheroids 쌍안경의 쌍에서 또는 가벼운 현미경 (4 배 확대)에서 48 h 후 감지 된다. 10-14 일 후 그들은 어떤 확대 장치 없이 볼 수 있습니다.
- 문화 "드롭 요리"에 걸려 37 ° C, 5% CO2 셀 인큐베이터 사용 셀 종류에 따라 10-14 일.
- 초기 드롭 구경, 후 5 일 각 드롭 신선한 RPMI/10% FCS 매체의 10 µ L를 추가 합니다. 그 후, 매체의 10 µ L 매일 교환 합니다. 전자 디스펜서의 사용은이 단계에서 매우 유용 합니다.
- 셀 유형에 따라 부드럽게 PBS로 세포 문화 접시 뚜껑 떨어져 rinsing 하 여 (자세한 내용은 섹션 10 참조) spheroids 10-15 일 후 수확. 신선한 비 접착 세포 배양 접시에 그들을 수집 합니다.
참고: 재배 기간 종양 성장 단계에 따라 흑색 종 세포의 때 그들은 처음에 파생 했다, 예를 들어, 451-루 셀에서 파생 된 spheroids 성장 약 500 µ m 직경에 매달려 드롭15에서에서 경작의 12 일 이내 .
7. 세대 Organotypic 전체 피부의 피부 구획의 재구성
- 24 잘 셀 미소 한 구멍이 있는 막 삽입 (기 공 크기 8 µ m) 24-잘 접시에 배치를 사용 하 여 피부 모델을 생성 합니다.
참고: 확인 교수형을 사용 하지 않아야 하지만 나중 단계에서 공기 액체 재배 6 잘 플레이트에 배치 될 것입니다 때문에 삽입, 서. - MM 및 내 피 성장 미디어 (EGM)16,17이라고 하는 문화 미디어로 서 젤 중화 솔루션 (GNL)15, 준비. 응고를 방지 하기 위해, 저장소는 콜라겐 유형 I (보통에서 쥐 꼬리, 0.02 N 초 산에 3.5-4 mg/mL) 얼음 사용까지 실시간에 젤 시작 하기 때문에
- 다시 GNL에 삽입 당 1 x 105 fibroblasts을 일시 중지 하 고 신속 하 게 500 µ L/삽입의 최종 볼륨에서 1: 3의 비율로 콜라겐 세포 현 탁 액을 혼합. 거품 형성 거품이 피부의 품질 저하 될 수 있습니다 피하기 위해 아래로 부드럽게 pipetting으로 혼합 재구성 합니다.
- 유지 하 여 그들 매체 없이 RT에서 30 분 멸 균 후드에 대 한 해결 하기 위해 개별 피부 젤을 허용 합니다. 이후 포도 당 4.5 g/L, 1% 포함 된 DMEM 각 젤 커버 L-글루타민, 10 %FCS, L-pyruvate, 없이 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
8. 세대 Organotypic 전체 피부의 상피 구획의 재구성
- 다음 날 피부 젤에서 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 2 h EGM 미디어 (FCS가 10%, 1 %PenStrep, 10mg/mL gentamicin) equilibrate 매체를 철회 하 고 신중 하 게 피부 젤 위에 100 µ L EGM에서에서 resuspended 1 x 105 keratinocytes 씨앗.
- Keratinocytes 피부 구획에 있도록 37 ° C에서 1.5 h에 대 한 재구성을 품 어.
참고:이 인큐베이션 기간 동안은 젤 구와 유도 수축으로 인해 축소 하 고 따라서, 적어도 부분적으로 삽입 벽에서 분리 하기 시작 합니다. - 약 800 µ L EGM 해당 하는 피부를 커버 하 고 신중 하 게 작은 (흰색) 피 펫 팁 삽입 벽에서 잔여 젤을 제거 합니다. 37 ° C, 5% CO2에 셀 인큐베이터에서 7 일 동안 EGM에 빠져들 피부 등가물 문화 고 매일 매체를 변경 합니다.
참고:이 시간 동안 해당 하는 피부 수축 됩니다 크게.
9. 공기-액체 재배 Organotypic 전체 피부의 재구성
- 8 일에 각 전송 6 잘 플레이트의 개별 잘 삽입 합니다. 에 추가할 MM 매체의 1.2-1.4 mL 각 잘 피부 재구성 우물의 바닥에서 매체와 함께 제공 하지만 매체와 적용 되지 않습니다.
참고: 공기-액체 인터페이스에서 재배 표 피 부분과 전체 cornified 층 (지층 corneum)의 설립의 계층 수 있습니다. - 다음 10 월 17 일 동안 9.1 매일 섹션에 명시 된 매체를 변경 합니다. 이 기간 동안, 약 또는 다른 자극 매체에 필요에 따라 추가 합니다. 조심 스럽게 곡선된 핀셋을 사용 하 여 추가 분석, 예를 들어, immunohistochemical 분석 (그림 1)에 대 한 미소 한 구멍이 있는 막 삽입에서 전체 피부 재구성을 제거.
10. Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델의 생성
- Organotypic 전체 피부 재구성의 피부 구획에 흑색 종 spheroids을 통합, 신중 하 게 씻어 교수형의 뚜껑을 (6.4 단계) 후 spheroids PBS와 드롭 셀 문화 접시. 살 균 비 접착제 셀 문화 접시에 10-20 spheroids/삽입을 수집 합니다. 조심 스럽게 제거 파스퇴르 피 펫과 과도 한 PBS.
- EGM의 작은 볼륨 가능한 spheroids 발음 이 시점에서 관찰 하 고 더 이상 확대 장치 없이 맨 눈으로 spheroids를 계산. 단계 10.1에서에서 명시 된 젤/피부 모델, 당 10-20 spheroids를 가져가 라.
- (단계 7.3), 섬유 아 세포를 포함 하는 GNL의 원하는 볼륨에 그들을 전송 하 고 콜라겐 유형 나 혼합. 이 단계에서 7.3-9.1 섹션에 설명 된 대로 진행 합니다.
참고: 종양 spheroids 표시 되 고 피부 젤에 흰 반점 (그림 2)으로
Representative Results
흑색 종 전이의 성공적인 치료 종양 사이 뿐만 아니라 종양 세포와 비 변형 호스트 세포 간의 크로스 토크에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 암에 체 외에서 의 organotypic 모델 개발의 목적은 3D 조직과 인간 흑색 종의 복잡성을 정리 하는 적당 한 전 임상 테스트 시스템을 제공 하는 vivo에서. Organotypic 환경과 동시에 주변의 기본 조직에 부작용 내 종양에 치료 영향의 연구 수 있습니다.
최고의 organotypic 피부 모델을 개발, 1 차 셀의 품질이 매우 중요 합니다. 그들은 일반적으로 분화 성인 기본 피부 세포에 비해 덜은 때문에 그것은 청소년 기본 섬유 아 세포와 keratinocytes, 사용에 유리입니다. 청소년 피부 세포 수 중 프로토콜 섹션 1-5에에서 설명 된 대로 청소년 포 피 로부터 격리 하지만 수 있습니다 또한 태아 기본 섬유 아 세포와 keratinocytes 회사에서 구입. 구매 하 고, 경우에 그것을 피하기 위해 기증자 전용 결과, 예를 들면, 마약 감도 대 한 다른 기증자 로부터 주문 셀 필요가 있다. 전체 프로토콜 체계를 그림 3에 표시 됩니다.
3D 풀 피부 등가물의 품질 관리 필요 immunohistochemical 분석을 합니다. 첫 인상 되며 오신에 의해 얻어질 수 있다 섹션 (3 µ m)를 포함 (H & E) 파라핀의 얼룩. 표 피 분화의 품질의 상세한 분석 및 진 피와 표 피 사이의 기저 lamina의 immunohistochemical 분석을 표 피 계층 표식에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 필요 합니다. 이로써 undifferentiated, 높은 증식 세포 사이 구별 기저 막 근처에 위치한 매우 분화 그리고 keratinized 별개 상피 층의 형성을 통해 지층 corneum 세포 사이 . 면역 조직학에 게 얼룩이 지기에 의해 그림과 같이 (그림 4), 표 피에 걸쳐 keratinocytes의 정상 피부와 유사한 달성 될 수 있었다: 낮은 상피 층에서 주로 undifferentiated 셀 (지층 basale 및 지층 spinosum) 10와 involucrin 위에 기저 층 (지층 granulosum 및 지층의 corneum)에서 분화 세포 각 질에 대 한 긍정적인 얼룩 동안 각 14, 질에 대 한 긍정적인 얼룩. 따라서, filaggrin 얼룩만 지층 corneum의 고도로 분화 된 세포에서 관찰 수 있었다. 가장 중요 한 것은, 순수 인공 피부 재구성의 피부 구획에는 표 피를 연결 하는 기저 lamina 생성 된 보여준다 laminin 5 얼룩. 이 통신 organotypic microenvironment 호스트 흑색 종 세포 또는 생리 및 pathophysiologic 분석을 위한 spheroids 생성 된 증명 한다.
흑색 종 약물 검사 목적 드 노 보 흑색 종 둥지 형성18,19수 있도록 전체 피부 등가물의 진 피에도 단일 흑색 종 세포를 통합 수 있습니다. 따라서, 흑색 종 세포 5:1, 5 분 동안 200 x g에서 함께 centrifuged의 비율로 기본 섬유 아 세포와 결합 되며 콜라겐 혼합 이전 GNL에 resuspended. 결과적으로, 흑색 종 세포 둥지는 피부에 자연스럽 게 형성할 것 이다. 우리의 경험에의 하면 전이성 성장의 셀만 단계까지 또는 VGP15의 흑색 종 세포에 비해 양식을 적절 한 둥지. 하나 이러한 유형의 모델의 주요 단점은 사실은 수와 형성 하는 흑색 종 둥지의 크기, 예측할 수 없는 개별 피부 사이 다를 수 있습니다, 어떤 처리 든 지 독립적으로 재구성 합니다. 예를 들어 1000 셀 피부 구획에 시드 100 셀 또는 100 둥지로 구성 된 10 셀의 각 (그림 5)의 구성 된 10 둥지를 얻을 수 있습니다. 이러한 생물 학적 변수 3 결함 선물: 첫째, 수와 형성 하는 흑색 종 둥지의 크기는 예측할 수 없습니다; 둘째, vivo에서 전이 일반적으로 흑색 종 둥지 보다 큰 그리고 전시 더 복잡 한 내부 종양 다양성; 그리고 셋째, 종양-둥지 모델의 제한 된 생활 스팬, 인해 치료 일찍 시작 결과적으로 오히려 기존 종양 둥지의 회귀를 일으키는 대신 종양 파생물을 억제.
이러한 제한 organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델을 극복 하기 위해 생성 될 수 있습니다. 여 자란 250 전이성 흑색 종 세포 교수형에 14 일20에 대 한 드롭, spheroids reproducibly 생성 되 가능한 흑색 종 세포를 약 500 µ m 흉내 낸 비의 최종 직경을 가진 조밀한 구조를 제시 나가도록 구성 된 종양 노드, 마이크로-전이, 또는 간 모 세관 마이크로 영역 단단한 종양21,22의입니다. 일반적으로, 흑색 종 셀 줄은 교수형을 통해 spheroids의 생성에 대 한 적합 한 삭제 방법; 그러나 세포에서 파생 하는, 더 많은 고급 전이성 종양 단계 양식 초기 진행 단계, 예를 들어는에서 파생 된 셀 라인에 비해 더 단단한 spheroids.
일부 셀에 대 한 그것은 교수형의 점도 향상 시키기 위해 적절 한 회전 타원 체 형성에 유리한 문화 매체를 드롭. 이 10-50% 메 틸-셀 루 로스 문화 매체의 추가 의해 달성 될 수 있다. 메 틸 셀 루 로스에 대 한 100 mL 유리병에 자기 볶음 바 솔루션, 오토 클레이 브 1.2 g 메 틸 셀 루 로스를 함께 주식. 100 mL 따뜻한 (60 ° C) 매체와 저 어 실 온에서 20 분 및 또 다른 1-2 h 4 ° c.에 추가 2 h x g 5000에 대 한 재고 솔루션을 원심 고 사용까지 4 ° C에서 점성 상쾌한을 저장 합니다.
전체 피부 흑색 종 회전 타원 체 모델의 적절 한 유효성 검사 나 피부 모델 건설 주 1에서 발판 사실 그 정의 된 흑색 종 spheroids 수 있는-적어도 통계적으로-통합 될 피부 섬유 아 세포/콜라겐에 의해 제공 됩니다 허용 그들은 25-27 일에 대 한 표 피 분화 동안 공동 개발. Spheroids 표시와 피부는 투명 한 내 흰 점이 젤 어떤 확대 장치 (그림 2) 없이 볼 수 있기 때문에 직접 뿌리기, 후 spheroids의 수익률을 분석할 수 있습니다. 그 결과, 3D 피부 모델 교양 있었다 생체 외에서 내 종양의 높은 수준을 보여주는 약 42 일의 총 항구 성숙한 흑색 종 spheroids 차별화15셀 생성 됩니다.
조직학 모양과 매우 비슷합니다 나가도록 비 인간 흑색 종 피부 전이 vivo 에서15 (그림 6 중에 흑색 종 spheroids의 셀룰러 분배 보여 피부 흑색 종 회전 타원 체 모델의 H & E 염색 ). 흑색 종 세포의 2 개의 모집단이이 조건 하에서 명확 하 게 구별할 수 있습니다: 주변 proliferating 부분 모집단 및 중앙 부분 모집단의 주로 구성 된 수축 된, apoptotic 또는 괴 사 성 세포, 소위 형성 "괴" 센터입니다. Immunohistochemically 생활과 모집단 확산 감지할 수 있습니다 확산 표식 기-67에 대하여 항 체를 사용 하 여 반면 세포 괴 사 성 센터의 TUNEL 염색15에 의해 구상 될 수 있다. 이 특정 종양 세포 모집단 분포는 영양분과 catabolic 폐기물 축적 중앙 부분에 산소의 부족에서 유래한 회전 타원 체 크기 (≥500 µ m)에 의해 보증 된다. 여기에 안정적이 고 재현 organotypic의 생성 하면 제공 프로토콜에 따라 인간의 전체 간격 피부 모델 포함 인간 흑색 종 피부 전이 흉내내는 인간 흑색 종 spheroids. 이 모델 포함 약물 테스트, 응용 프로그램, 독 소의 심사 성형 화합물의 영향 또는 흑색 종 파생물 및 치료 치료 레이저.
그림 1 : 3D organotypic 피부 재구성의 재배 매체와 공기-액체 인터페이스에 빠져들. 하루에 기본 keratinocytes 피부 구획 기본 섬유 아 세포의 구성 위에 시드는 0에 포함 콜라겐 유형 나 매트릭스. 3D 피부 재구성 EGM와 7 일 동안 침수 재배 유지, 삽입 벽에서 분리 하 고 축소 시작. 주 8에서 삽입 6-웰 스 전송 되며 표 피 계층 수 있도록 공기 액체 인터페이스에서 재배. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 피부 구획에 포함 하는 흑색 종 spheroids 흰 반점으로 나타납니다. 동안 피부 구획 3D 피부 재구성, 흑색 종 spheroids의 정의 된 수의를 준비 하 고 섬유 콜라겐 유형 나 믹스에 추가할 수 있습니다. 일단 피부 젤 정착 했다 흑색 종 spheroids 흰 반점으로 표시 된다.
그림 3 : 3D organotypic 피부 모델 건설의 계획. 지방 조직 피부 샘플에서 제거 하 고 작은 조각으로 잘라. 4 ° C에서 하룻밤 dispase 솔루션으로 부 화 진 피에서 표 피 분리를 촉진 한다. 격리 된 기본 섬유 아 세포와 keratinocytes 별도로 재배와 4-6, 3-4, 통로 사이 각각 사용 있어야 합니다. 그 후, 3D 피부 모델의 생성 프로토콜에 설명 된 대로 진행할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 3D organotypic 피부 재구성 표시 차별화 수준을 정상적인 인간의 피부와 비슷합니다. 파라핀 피부 등가물의 섹션 (A) 정상에 비해 인간의 피부 (B) keratins 14의 표현에 대 한 스테인드 했다 (빨간색: λ전 554 nm; λem 568 nm) 및 10, involucrin (녹색: λ전 490 nm; λem 525 nm ), filaggrin (녹색: λ전 490 nm; λem 525 nm), 및 laminin 5 (녹색: λ전 490 nm; λem 525 nm), confocal 형광 현미경으로 분석. 세포 핵 시각화 했다 DAPI 얼룩에 의해 (파란색: λ전 340 nm; λem 488 nm). 피부 등가물 밝혀 적절 한 표 피 계층 정상적인 인간 피부에서 보듯이 표 피의 개별 레이어를 형성의 3 차원 전체 두께의 Immunohistochemical 검사. 낮은 표 피 층에서 세포 각 질 14에 대 한 긍정적인 스테인드, 하는 동안 더 많은 각 질 10와 involucrin 얼룩 위에 기초 층에서 세포 분화. 지층 corneum 가까이 매우 차별화 된 셀 filaggrin 표현. Laminin 5 얼룩 기저 lamina 생성 순수 피부 구획 (최저 패널)에 표 피를 연결 하는 것을 보여준다. 이 그림 Voersmann 그 외 여러분 에서 촬영 되었습니다. 허가 15 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 수와 자연스럽 게 형성 된 흑색 종 둥지의 크기를 예측할 수 없습니다. 등가물 흑색의 정의 수를 혼합 하 여 얻을 수 있습니다 전체 피부의 피부 구획에 드 노 보 흑색 종 둥지 형성 세포 콜라겐 유형에서 두 셀 형식 포함 기본 섬유 아 세포와 난 매트릭스. 수와 자연스럽 게 형성 된 흑색 종 둥지의 크기만 약 21 일 후 성숙한 3D 피부 재구성에서 분석할 수 있습니다. 두 개의 샘플 (A)에서 같이, (B), 숫자와 크기의 흑색 종 둥지 개별 피부 재구성 사이 다를 수 있습니다. 결과적으로, 그것은이 모델의 유효성을 검사 하 고 치료 영향을 예측 하기 어렵습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 피부 등가물에 통합 하는 흑색 종 spheroids 인간 피부 흑색 종 전이의 주요 특징을 정리. H & E 피부 등가물에 포함 하는 종양 spheroids의 파라핀 섹션 스테인드 나가도록 비 인간 피부 흑색 종 전이 vivo에서주요 기능을 공유 하는 spheroids을 공개 했다. 셀의 두 모집단은 명확 하 게 인지할 수: 주변 생활 부분 모집단 및 중앙 부분 모집단의 주로 구성 된 수축 된, apoptotic 또는 괴 사 성 세포, "괴" 센터를 형성. 회전 타원 체 크기 종양 세포 모집단의이 분포를 보장 합니다. 이 그림 Voersmann 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 허가 15 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기 소개 하는 organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델 영장 내 종양의 깊은 이해에 대 한 새로운 통찰력 및 종양-호스트 상호 작용, 그리고 종양 개발의 분자 메커니즘을 연구 하는 고급 심사 플랫폼을 제공할 수 있습니다 및 미래에 치료 저항입니다.
최고의 보장을 생리 그리고 vivo에서 피부의 상태를 흉내 낸 재구성, 1 차 셀의 품질은 매우 중요. 위에서 설명 했 듯이, 청소년 또는 태아 피부 세포 최저 차별화 등급을 표시 하 고 따라서 가장 적합 한 전체 간격 피부 등가물을 생성 하는. 첫 번째 가능한 품질 관리는 keratinocytes 시드 및 평형 EGM (프로토콜 섹션 8.2 및 8.3)을 젤 후 하루 2에서 피부 수축 정도 이다. 젤 피부 섬유 아 세포의 최고의 품질로 대부분을 축소 됩니다. 또한, 너무 적은 또는 너무 많은 섬유 아 세포의 통합 피부 수축과 따라서 피부 구획에는 상피의 첨부 파일 손상 될 수 있습니다. 이 프로세스에서는 피부와 표 피 세포 사이의 광범위 한 크로스 토크 때문에이 차례로 상피 분화, 타협 것입니다.
1 차 셀의 품질은 또한 비판적으로 셀 confluency 셀의 통과에 따라 달라 집니다. Keratinocytes ≥80 %confluency 재배 하는 경우 그들은 즉시 확산을 중지 하 고 분화 하기 시작. 그것은 그러므로 40-70 %confluency 뿌리고 하는 동안 그들을 문화 통로 3-4 보다 나중 아니 그들을 사용 하는 것이 중요. 섬유 아 세포는 덜 민감한 하지만 나중에 4-6 구절 보다 사용할 수 없습니다. 또한 주의 모든 1 차 셀 및 셀 라인 organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델을 생성 하는 데 사용 교양 항생제의 자유롭고 따라서 오염 위험이 높습니다. 그러나, 항생제의 추가 개별 세포의 생리 변경 하 고 따라서 피부 등가물의 품질을 감소 시킨다.
일반적으로 종양의 회전 타원 체 형성 종양 세포 라인의 거의 모든 종류에서 그리고 또한 갓 환자 자료에서 분리 된 종양 세포에서 가능 하다. 초기 셀 번호 또는 재배에 최적의 회전 타원 체 크기를 얻기 위해 사용 하는 셀 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 150-200 µ m의 크기는 회전 타원 체에 포함 된 모든 셀 수 있습니다 여전히 충분히 함께 제공 간단한 확산 통해 영양소. 크기 ≥500 µ m와 spheroids만 세포질 감 별 법의 고차를 표시 하 고 나가도록 비 종양 조직22의 일반적인 기능을 나타냅니다.
Organotypic 흑색 종-회전 타원 체-피부-모델 여기 개발은 특히 적당 한 종양-호스트 상호 작용을 공부 하 고 흑색 종 마약 vivo에서에서 테스트에 대 한-같은 조건15. 아직도, vivo에서 흑색의 환경은 훨씬 더 복잡 한, 면역 세포 및 내 피 세포를 포함 하 여 관련 된 종양 세포 유형의 다양 한 은닉. 때문에 적절 한 기본 면역 세포의 조직 적합성과 문제에 직면, 이러한 모델은 아직 적절 하 게 면역 치료 접근을 모니터 할 수 없습니다.
그럼에도 불구 하 고, 흑색 종 spheroids 갓 격리 환자 자료에서 생성 될 수 있습니다 그리고 전체 피부 재구성에 포함, 일단 수 있습니다 개별 약물으로 서브 상영 플랫폼. 피부 재구성으로 흑색 종 전이의 조각도 통합 맞춤형된 치료 방법에 약물 조합을 테스트 불가입니다. 만 가장 유망한 새로운 치료 개념은 했다고 앞으로 임상 테스트에 따라서이 대 한 잠재적인 새로운 치료의 감손 율을 줄일 수 있도록 하는 organotypic 3D 피부 흑색 종 모델을 포함 하 여 전 임상 시험에서 질환과 임상에서 치료 성공의 속도 증가.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 3D organotypic 흑색 종-회전 타원 체-피부-모델을 수립 하 고 제공 하는 우수한 프로토콜에 대 한 한 나 Voersmann를 감사 합니다. 저자는 또한 중요 한 기술 지원에 대 한 Silke 부시를 감사합니다. 작품 BMBF e에 의해 지원 되었다: 메 드 프로그램 "흑색 종 감도" 031A423A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
| Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
| Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
| 24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
| cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
| Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
| Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
| Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
| juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
| juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
| DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
| Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
| EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
| Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
| Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
| Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
| dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
| L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
| Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
| anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
| anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
| anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
| anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
| anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
| secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
| secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |
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