En 3D Organotypic melanom sfäroid hud modell

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att generera en 3D organotypic melanom sfäroid hud modell som recapitulates både arkitekturen och flercelliga komplexiteten av en orgel/tumör i vivo men samtidigt rymmer systematisk experimentell ingripande.

Abstract

Elakartad omformning av melanocyter, cellerna med pigment av mänsklig hud, orsakar bildandet av melanom, en mycket aggressiv cancer med ökad metastatisk potential. Nyligen, mono-kemoterapier fortsätta att förbättra genom melanom specifika kombinationsbehandlingar med riktade kinashämmare. Metastaserande melanom är fortfarande, en livshotande sjukdom eftersom tumörer uppvisar primär resistens eller utveckla resistens mot nya terapier, därmed återfå tumörframkallande kapacitet. För att förbättra terapeutiska framgången av malignt melanom, är bestämning av molekylära mekanismer som ger resistens mot konventionella behandlingsmetoder nödvändig. men, det kräver innovativa cellulära in vitro- modeller. Här, vi införa en in vitro- tredimensionella (3D) organotypic melanom sfäroid modell som kan skildra i vivo arkitekturen av malignt melanom och kan motivera nya insikter i intra-tumoral samt tumör-värd-interaktioner. Modellen innehåller definierade antal mogna och differentierade melanom spheroids i 3D full människohud återuppbyggnad modell bestående av primära hudceller. De inbäddade melanom spheroids cellulära sammansättningen och differentiering status är liknande till en av kutana melanom metastaser i vivo. Med denna organotypic melanom sfäroid modell som en drog som screening plattform kan stödja identifiering av responders till valt kombinationsbehandlingar, samtidigt skona onödig behandling bördan för icke-responders, därigenom öka nyttan av Terapeutiska interventioner.

Introduction

Den mänskliga huden består av två skilda fack som fyller olika funktioner för att skydda kroppen från skadliga miljöeffekter¹. Lägre dermal kupén består av en fibro-elastisk bindväv. Den består av löst sammanhållen kollagen och elastin fibrer som syntetiseras av fibroblaster, som serverar en mekanisk barriär-funktion. Dermis är separerad från övre epidermis av den basala lamina som produceras som ett extracellular matris på grund av en ständig kommunikation mellan båda hud fack. I motsats till dermis, epidermis är ett skivepitel som främst består av keratinocyter och kan göras åtskillnad mellan in i fyra lager. I stratum basale består av odifferentierade basala keratinocyter som ständigt följer hudens stamceller stratifiera genom de olika stadierna av stratum spinosum och stratum granulosum i stratum corneum att skydda kroppen mot uttorkning och infektioner². Melanocyter justeras på basala membranet och kommunicera via dendritiska förlängningar med flera keratinocyter. De producerar pigmentet melanin för att skydda huden vävnad från de skadliga effekterna av UV-strålning, som hudens åldrande, immunsuppression, inflammation och induktion av icke-melanom hudcancer. UV strålning bidrag till omformningen av melanocyterna till malignt melanom, men är fortfarande under debatt³.

Melanom utveckling är differentierade i olika tumör progression etapper, och kännetecknas av vissa genetiska, morphologic och histologiska förändringar⁴. De har sitt ursprung antingen de novo eller från en medfödd eller förvärvad nevus på grund av en lokal ökning av melanocyte spridningen orsakar godartade tumörer. Denna föregångare lesion kan konvertera till strukturellt modifierade dysplastiska vävnad innehållande atypic celler, som får fortsätta att maligna etapp, radiella tillväxtfasen (RGP). Denna tidiga tumör progression fas kännetecknas av celler radiellt frodas inom epidermis, visar några lokalt invasiv celler inom papillär dermis. Under efterföljande vertikal tillväxt fas (VGP) melanom visar celler redan en metastaserande och invasiv fenotyp genom att bryta igenom den basala lamina att infiltrera de djupa delarna av dermis samt den subkutana vävnad⁵. Slutligen representerar metastaserande melanom (MM) mest aggressiva progression scenen med metastaserande celler systemiskt sprider sig i blod- och lymfa systemet att invadera distalt organ såsom lever, lungor och hjärna⁶.

Hittills har tidig diagnos följt av kirurgi är fortfarande den mest effektiva behandlingen av malignt melanom. Prognosen för patienter med fjärrmetastaser, förblir dock särskilt dålig⁷, eftersom klassisk kemoterapiregimer ger endast lite överlevnad nytta^8,9. Dock efter decennier av stagnation, har senaste framstegen inom riktade terapier avsevärt förbättrat prognosen för malignt melanom.

Dysreglering av två stora mitogen aktiveras spridningsvägar, den RAS-RAF-MEK-ERK och signalvägar som PI3K-AKT-PTEN, presentera viktiga drivkrafter för melanom progression, särskilt när konstitutivt aktivera punktmutationer av den proto-onkogener BRAFV600 och Regleringsmyndigheterna är närvarande¹⁰. Därför lovade uppfinningen av riktade kinashämmare terapeutiska fördelar för patienter med metastaserande melanom. En mångfald av kliniska prövningar som utförs på denna punkt har inte uppnått betydande fördelar för patienter med metastaserande melanom. Nästan alla svaren är partiska, med en subpopulation av patienterna visar primär resistens. Dessutom hos förvärv av sekundära motstånd leder till återfall majoriteten av patienter^11,12.

Det blir tydligt att analys av mutationsstatus ensam inte är tillräcklig för att utveckla den mest potenta terapeutisk strategin. Nya snabba och tillförlitliga diagnostiska verktyg är nödvändiga för att systematiskt registrera och analysera lyhördheten för enskilda cancerceller. Majoriteten av för närvarande tillgängliga uppgifterna om mänskliga melanom har erhållits från tvådimensionell (2D) melanom cellkulturer. Tumörceller, dock vuxit i 3D Tillåt intercellulära överhörning mellan differentierad cancer cell subpopulations samt mellan cancerceller och icke-omvandlad omgivande värd vävnad. Därför skulle det vara bäst att rekonstruera 3D-miljö där melanom utvecklas, för att användas som en preklinisk screening modell^13,14.

Protocol

Alla mänsklig vävnad arbete utfördes med hjälp av godkända institutionella protokoll.

1. separation av Dermis och Epidermis från mänsklig hud (juvenil förhud från omskärelse)

1. Placera förhuden (vanligtvis 1-2 cm²) i en icke-häftande sterila cell kultur maträtt (Ø 10 cm) och täck den med 10-12 mL fosfatbuffrad koksaltlösning⁺ (PBS, 0,5 mM MgCl₂, 0.9 mM CaCl₂, pH 7,2 = PBS⁺). Ta bort alla överskott (fett) vävnad med hjälp av steril skalpell och pincett.
2. Skära huden i 3 x 5 mm bitar, tvätta dem med PBS och överföra dem till en icke-häftande sterila cell kultur maträtt (Ø 6 cm). Täcka vävnad bitar med 5-7 mL dispase lösning (2 U/mL i PBS). Försegla cell kultur skålen med paraffin film och inkubera i 16 h vid 4 ° C.
3. Återkalla den epidermala från dermal delen med två steril pincett. Överföra dissekerade vävnad bitar till enskilda icke-häftande cell kultur rätter (Ø 6 cm) och täcka dem med PBS⁺.

2. isolering av primära keratinocyter från Epidermis

1. Försiktigt bort PBS⁺ från cell kultur skålen med Pasteur pipett och tvätta epidermal tissue bitar (avsnitt 1.3) med PBS. Epidermis, skuren i mindre bitar (1 mm²) och samla dem i en 50 mL konisk slang. Tillsätt 10 mL 1 x Trypsin-EDTA (som förvärmts till 37 ° C) och inkubera i 5 minuter i ett vattenbad vid 37 ° C. Vortex vävnad suspensionen varje 2 min.
2. Stoppa den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 1 mL fetalt kalvserum (FCS). Att resuspendera cellerna genom pipettering upp och ner med 10 mL plast pipett för 4 min. försöka undvika bubblor och skum bildas.
3. Pipettera cellsuspensionen i en cell sil (por storlek 100 µm), placerad ovanpå en färsk 50 mL koniska tub, och skölj 3 x 5 ml PBS. Centrifugera cellerna vid 200 x g för 5 min. Återsuspendera cellpelleten i 2-6 mL odlingsmedium som innehåller 1% (v/v) gentamycin. Bestämma antalet cell manuellt genom att räkna celler i en hemocytometer och utsäde 6 x 10⁵ celler i en T75 cell kultur kolv.

3. odling av primära keratinocyter

1. Inkubera primära keratinocyter isolerade i steg 2,3 i en cell inkubator vid 37 ° C och 5% CO₂ i keratinocyter medium utan FCS, 50-70% konfluens.
2. Till passagen av keratinocyter noggrant bort mediet, tillsätt 5 mL PBS-EDTA och inkubera cellerna under 10 minuter vid 37 ° C. Kontrollera om celler har börjat lossna från kultur kolven under ett ljusmikroskop (4 X förstoring: celler visas avrundade men är fortfarande kopplade!). Om inte, Byt ut gamla PBS-EDTA med färska PBS-EDTA och åter Inkubera i en annan 10 min vid 37 ° C.
3. Tillsätt 5 mL 1 x Trypsin-EDTA till rundade celler fortfarande täckt med 10 mL PBS-EDTA och åter Inkubera dem för 1-3 min vid 37 ° C. Stoppa den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 1 mL FCS och samla in fristående cellerna i en 50 mL konisk slang. Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min, återsuspendera pelleten i keratinocyter medium och utsäde 6 x 10⁵ celler i en färsk T75 cell kultur kolv.
   Obs: För att generera organotypic hud rekonstruerar, den primära keratinocyter bör användas nej senare än passage 3-4.

4. isolering av primära fibroblaster från Dermis

1. Skär den dermal vävnaden (avsnitt 1.3) i mindre bitar (1 mm²) och överföra dem till en 50 mL konisk slang. Tillsätt 10 mL kollagenas-lösning (5 U/mL i PBS⁺) och inkubera i 45 min i ett vattenbad vid 37 ° C. Centrifugera blandningen av vävnad och celler vid 200 x g i 5 min.
2. Tvätta cellpelleten två gånger med 10 mL DMEM innehållande 4,5 g/L glukos och L-glutamin, men utan L-pyruvat. Slutligen Återsuspendera vävnad bitarna i 2 mL DMEM som innehåller 1% (v/v) gentamycin och 10% FCS. Överföra dem till en T25 cell kultur kolv och inkubera i en cell inkubator vid 37 ° C och 5% CO₂ dem över natten.
   Obs: Den lilla volymen tillåter fibroblaster att migrera ur vävnad-skräp och tvingar dem att fästa kultur kolven.
3. Nästa morgon, lägga till ytterligare 6 mL DMEM/Gentamycin/FCS och Inkubera under 2-3 dagar vid 37 ° C tills cellerna har nått 80-90% konfluens.

5. odling av primära fibroblaster

1. Passage av fibroblaster, ta bort mediet och tvätta vidhäftande celler med PBS. Tillsätt 5 mL 1 x Trypsin-EDTA och Inkubera under 3 minuter vid 37 ° C.
2. Stoppa den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 5 mL DMEM/FCS och samla in fristående cellerna i en 50 mL konisk slang. Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min, återsuspendera pelleten i DMEM medium och frö 6 x 10⁵ celler i en färsk T75 cell kultur kolv.
   Obs: För att generera organotypic hud rekonstruerar, primära fibroblaster ska användas inte senare än passage 4-6.

6. generering av 3D melanom Spheroids Via metoden hängande droppe

1. Kultur melanomceller (t.ex., 451-LU eller någon melanom cell fodrar av intresse) enligt allmänna protokoll, använda RPMI innehållande 10% FCS¹⁵.
   1. För att generera melanom spheroids av liknande storlek och kvalitet, tvätta melanom cellerna i PBS, tillsätt 5 mL av 1 x Trypsin-EDTA i PBS till celler i en T175 cell kultur kolv, och Inkubera under 3-5 min i rumstemperatur (RT). Neutralisera Trypsin genom att tillsätta 5 mL RPMI/10% FCS. Skörden cellerna genom centrifugering vid 200 x g för 5 min. återsuspendering cellpelleten i RPMI/FCS med en slutlig koncentration på 10 000 celler/mL som bestäms genom räkning i en hemocytometer.
2. Plats 40 x 25 µL (= 250 celler) av cellsuspensionen på insidan av locket till en steril icke-häftande cell kultur maträtt (Ø 10 cm) med hjälp av en elektronisk multi pipett. Med en snabb men smidig rörelse, vända locket och placera den på respektive cell kultur skålen innehållande 5 mL PBS.
   1. Kultur ”hängande droppe rätter” i en cell inkubator vid 37 ° C och 5% CO₂ för 10-14 dagar, beroende på det celltyp som används.
      Obs: Celler från MM tillväxtfasen vanligtvis växer snabbare och bilda mer solid spheroids i den hängande droppe jämfört melanomceller som härrör från RGP eller VGP. För individuell utvärdering, iaktta sfäroid tillväxt under ett par kikare eller ett ljusmikroskop (4 X förstoring). Spheroids blir vanligt, kan upptäckas efter 48 h under ett par kikare eller ett ljusmikroskop (4 X förstoring). Efter 10-14 dagar syns de utan någon förstoring enhet.
3. 5 dagar efter den första drop spotting, tillsätt 10 µL av färska RPMI/10% FCS medium till varje droppe. Därefter exchange 10 µL av medium varannan dag. Användning av en elektronisk dispenser är till stor hjälp i det här steget.
4. Beroende på celltyp av, skörda de spheroids (se avsnitt 10 för detaljer) efter 10-15 dagar genom att försiktigt skölja dem av cell kultur maträtt locket med PBS. Samla dem i en frisk icke-häftande cell kultur maträtt.
   Observera: Perioden odling beror på tumören tillväxtfasen av melanomceller när de ursprungligen härrör, t.ex., spheroids härrör från 451-LU celler växer till cirka 500 µm i diameter inom 12 dagar från odling i den hängande droppe¹⁵ .

7. generering av Dermal facket Organotypic Full hud rekonstruerar

1. Generera hud modeller använder 24-väl cell mikroporös membran skär (pore storlek 8 µm) placeras i 24 brunnar.
   Notera: Se till att inte använda hängande men ständiga skär, eftersom de kommer att placeras i en 6-well platta för luft-vätska odling i ett senare skede.
2. Förbereda de gel neutralisering lösning (GNL)¹⁵, liksom kultur media kallat MM och endotel tillväxt medier (EGM)^16,17. För att förhindra koagulation, store kollagen typ I (oftast från rat tail, 3,5-4 mg/mL i 0,02 N ättiksyra) på is fram till användning, eftersom det börjar gel på RT.
3. Återsuspendering 1 x 10⁵ fibroblaster per skär i GNL och snabbt blanda cellsuspension med kollagen i förhållandet 1:3 i en slutlig volym av 500 µL/infoga. Mix av försiktigt pipettering upp och ner för att undvika bubbla bildandet som bubblor kan försämra kvaliteten på huden rekonstruera.
4. Tillåta de enskilda dermal gelerna att reglera genom att hålla dem utan medium på RT i 30 min i en steril huva. Därefter täcker varje gel med DMEM innehållande 4,5 g/L glukos, 1% L-glutamin, 10% FCS, och utan L-pyruvat, och inkubera över natten vid 37 ° C.

8. generering av Epidermal facket Organotypic Full hud rekonstruerar

1. Nästa dag ta bort mediet från de dermal gelerna och temperera dem med extra bolagsstämma media (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/mL gentamicin) för 2 h vid 37 ° C. Dra mediet och noggrant utsäde 1 x 10⁵ keratinocyter resuspended i 100 µL EGM ovanpå dermal gelen.
2. Inkubera i rekonstruerar för 1,5 h vid 37 ° C att tillåta den keratinocyter att följa dermal facket.
   Obs: Under denna inkubationstid gelerna kommer att börja krympa på grund av fibroblast-inducerad sammandragning, och således åtminstone delvis loss från infoga väggarna.
3. Täcka huden motsvarigheterna med ungefärligt 800 µL extra bolagsstämma och ta försiktigt bort de kvarvarande gel från infoga väggen med en liten (vit) pipettspetsen. Kultur hud motsvarigheterna nedsänkt i extra bolagsstämma för 7 dagar i en cell inkubator vid 37 ° C, 5% CO₂, och ändra medium varannan dag.
   Obs: Under denna tid motsvarigheten i huden kommer att krympa avsevärt.

9. luft-vätska odling av Organotypic Full hud rekonstruerar

1. På dag 8 infoga överföring varje i en enskild brunn 6-bra platta. Bara lägga 1,2-1,4 mL MM medium till varje brunn, så att den huden rekonstruera levereras med medium från botten av brunnen men täcks inte med medium.
   Obs: Odling på luft-vätska gränssnittet tillåter stratifiering av epidermal del och inrättande av en full cornified lager (hornlagret).
2. Under de kommande dagarna 10-17, ändra mediet som anges i avsnitt 9,1 varannan dag. Lägg till droger eller andra stimuli som behövs för att mediet under denna period. Ta försiktigt bort den full hud rekonstruera mikroporös membran infoga med böjd pincett för ytterligare analys, t.ex., immunhistokemisk analys (figur 1).

10. generering av Organotypic melanom sfäroid hud modeller

1. För att integrera de melanom spheroids i dermal facket av de organotypic full hud rekonstruerar, skölj noggrant spheroids (efter steg 6,4) av locket av hängande droppe cell kultur skålen med PBS. Samla 10-20 spheroids/infoga i en steril icke-häftande cell kultur maträtt. Ta försiktigt bort överdriven PBS med en Pasteur-pipett.
2. Aspirera spheroids i minsta volym som möjligt av extra bolagsstämma. Vid denna punkt iaktta och räkna spheroids med blotta ögat, utan ytterligare förstoring enhet. Ta 10-20 spheroids per hud modell/gel, som anges i steg 10.1.
3. Överföra dem till önskad volym av GNL innehållande fibroblaster (under steg 7,3) och blanda med kollagen typ jag. Från detta steg på Fortsätt som beskrivet i avsnitt 7,3-9,1.
   Obs: Tumör spheroids blir synliga i dermal gel som vita fläckar (figur 2)

Representative Results

Framgångsrik behandling av melanom metastaser kan påverkas av överhörning mellan tumörceller samt mellan tumör och icke-omvandlad värdceller. Syftet att utveckla organotypic modeller av cancer i vitro är att tillhandahålla lämpliga prekliniska testsystem som recapitulate 3D organisation och komplexiteten av mänskliga melanom invivo. Detta gör studien av den terapeutiska effekten på tumören inom en organotypic miljö och de negativa effekterna på den omgivande primära vävnaden parallellt.

För att utveckla de bästa organotypic hud modellerna, är kvaliteten på de primära cellerna avgörande. Det är fördelaktigt att använda juvenil primära fibroblaster och keratinocyter, eftersom de är vanligtvis mindre differentierade jämfört med vuxna primära hudceller. Juvenil hud celler kan antingen isoleras från juvenil Förhud som beskrivs i avsnitten protokoll 1-5, men kan också köpas från företag som prenatala primära fibroblaster och keratinocyter. Om inköp, är det nödvändigt att beställa celler från olika givare att undvika givare-specifika resultat, t.ex., för drog känslighet. Hela protokollet visas som ett system i figur 3.

Kvalitetskontroll av 3D full-hud medel kräver immunhistokemisk analys. Ett första intryck kan erhållas genom Hematoxylin-Eosin (H & E) färgning av paraffin inbäddade sektioner (3 µm). Detaljerad analys av kvaliteten på epidermal differentiering och bildandet av den basala lamina mellan dermis och epidermis kräver immunhistokemisk analys med specifika antikroppar mot en epidermal stratifiering markör. Detta gör att skilja mellan odifferentierade, mycket proliferativ celler ligger nära basala membranet och högt differentierade och keratiniserad cellerna på den hornlagret genom bildandet av distinkta epidermala skikt mellan . Som framgår av immun-histologiska färgning (figur 4), differentiering av keratinocyter i epidermis kunde uppnås liknar normal hud: främst de odifferentierade cellerna från den lägsta epidermala skikten (stratum basale och stratum spinosum) fläcken positivt för keratin 14, medan de mer differentierade cellerna från supra-basal lagren (stratum granulosum och hornlagret) fläckar positivt för keratin 10 och involucrin. Följaktligen kunde filaggrin färgning endast observeras i högt differentierade celler i stratum corneum. Viktigast av allt, avslöjar laminin 5 färgning att en basala lamina genererades för att fysiologiskt ansluta den epidermala till dermal facket av den konstgjorda hud rekonstruera. Detta bevisar att en kommunicerande organotypic närmiljön har genererats till värd melanomceller eller spheroids för fysiologiska och patofysiologiska analys.

I syfte att melanom drogkontroll, kan enda melanomceller också integreras i dermis av full hud medel att tillåta de novo melanom boet bildandet^18,19. Därför melanomceller kombinerat med primära fibroblaster i förhållandet 5:1, centrifugeras tillsammans vid 200 x g i 5 min och resuspended i GNL före blandning med kollagen. Som ett resultat, bildar melanom cell Bon spontant i dermal facket. Enligt vår erfarenhet fas endast celler av metastaserande tillväxten formuläret korrekt Bon, jämfört med melanomceller RGP eller VGP¹⁵. En stor nackdel med dessa typer av modeller är det faktum att antal och storlek av melanom Bon bildade kan inte förutsägas, och kan variera mellan enskilda hud rekonstruerar, oberoende av någon behandling. Till exempel kan 1000 celler seedade i dermal facket få 10 Bon bestående av 100 celler eller 100 Bon bestående av 10 celler varje (figur 5). Dessa biologiska variabler presentera med tre brister: först, antal och storlek av melanom Bon bildade är oförutsägbara; andra av metastaser i vivo är normalt större än melanom Bon och uppvisar en mer komplex intra-tumoral mångfald; och det tredje på grund av den begränsade livslängden för tumör-nest modeller, behandling initieras tidigt, och följaktligen snarare hämmar tumör utväxt i stället för orsakar regression av befintliga tumör Bon.

För att övervinna dessa begränsningar organotypic melanom sfäroid hud modeller kan genereras. Genom odling 250 metastaserande melanom celler i en hängande droppe för 14 dagar²⁰, genereras spheroids reproducibly bestående av livskraftiga melanom celler presentera en kompakt struktur med en slutlig diameter av ungefärligt 500 µm härma icke vaskulariserad tumör noder, mikro-metastaser eller Inter kapillär micro regioner solida tumörer^21,22. I allmänhet någon melanom cell fodrar är lämplig för generering av spheroids via hängande släpp metoden; dock celler härstammar från mer avancerad metastaserande tumör stadier form mer solid spheroids jämfört med cellinjer som härstammar från tidiga progression, t.ex., RGP.

För vissa celler, är det fördelaktigt för korrekt sfäroid bildandet att öka viskositeten av hängande droppe odlingsmedium. Detta kan uppnås genom tillsats av 10-50% metyl-cellulosa till odlingsmediet. För metyl-cellulosa stamlösning, autoklav 1,2 g metyl-cellulosa tillsammans med en magnetisk uppståndelse bar i en 100 mL glasflaska. Tillsätt 100 mL förvärmd (60 ° C) medium och rör för 20 min i rumstemperatur och en annan 1-2 timmar vid 4 ° C. Centrifugera stamlösning för 2 h vid 5 000 x g och lagra trögflytande supernatanten vid 4 ° C fram till användning.

Korrekt validering av full hud melanom sfäroid modeller tillhandahålls av det faktum att ett definierat antal av melanom spheroids kan - åtminstone statistiskt - integreras dermal fibroblast/kollagen schavotten jag på dag 1 av hud modell konstruktion, vilket gör att dem att gemensamt utveckla under epidermal differentiering för 25-27 dagar. Avkastningen av spheroids kan analyseras direkt efter sådd, eftersom spheroids visas som vita fläckar inom de transparenta dermal gel och kan ses utan någon förstoring enhet (figur 2). Som ett resultat, genereras en 3D hud modell att hamnar mogen melanom spheroids, som hade varit odlade i vitro för sammanlagt ca 42 dagar, visar den högsta nivån av intra-tumoral cell differentiering¹⁵.

H & E färgning av hud melanom sfäroid modellen avslöjar den histologiska utseendet och cellulära distribution av melanom spheroids att vara mycket lik en av icke-vaskulariserad mänskliga melanom hud metastaser i vivo¹⁵ (figur 6 ). Två subpopulations av melanomceller är klart urskiljbara under dessa förhållanden: en perifer prolifererande subpopulation och en central subpopulation som huvudsakligen består av krympta, apoptotiska eller nekrotiska celler, bildar den så kallade ”nekrotisk” Center. Immunohistochemically lever och frodas subpopulations kan upptäckas med hjälp av antikroppar mot spridning markören KI-67, medan celler av nekrotisk center kan visualiseras med TUNEL-färgning¹⁵. Denna viss fördelning av tumör cell subpopulations rättsordning sfäroid storlek (≥500 µm), följd av brist på näringsämnen och syre i den centrala delen där katabola avfall ackumuleras. Med modell av human fullhudsskador hud efter protokollet förutsatt här kommer att genereringen av en tillförlitliga och reproducerbara organotypic och inbäddade mänskliga melanom spheroids som efterliknar mänsklig melanom hud metastaser. Tillämpningar av denna modell inkludera drogtester, screening av toxiner, påverka av kosmetiska föreningar eller laserbehandling på melanom utväxt och behandling.

Figur 1 : Odling av 3D organotypic hud rekonstruerar nedsänkt med medium och på luft-vätska gränssnittet. På dag inbäddade 0 primär keratinocyter är seedade ovanpå dermal facket bestående av primära fibroblaster i en kollagen typ jag matris. 3D hud rekonstruerar bo odlade under vatten med extra bolagsstämma i 7 dagar, loss från infoga väggen och börja krympa. Vid dag 8 skären överförs till 6-brunnar och odlas på gränssnittet luft-vätska att tillåta epidermal stratifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Melanom spheroids inbäddade i dermal facket syns som vita fläckar. Medan förbereda dermal facket av den 3D hud rekonstruera, ett definierat antal melanom spheroids kan läggas till den fibroblast kollagen typ jag blanda. När dermal gelen har lagt sig, blir melanom spheroids synliga som vita fläckar.

Figur 3 : Systemet av 3D organotypic hud modellera konstruktion. Ta bort fettvävnad från huden provet och skär den i mindre bitar. Inkubation med dispase lösning över natten vid 4 ° C underlättar separationen av överhuden från läderhuden. Isolerade primära fibroblaster och keratinocyter bör odlas separat och används mellan passage 4-6 och 3-4, respektive. Generering av 3D hud modellen kan därefter fortsätta som beskrivs i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : 3D organotypic hud rekonstruerar Visa en differentiering nivå liknar normal human hud. Paraffin avsnitt av huden motsvarigheter (A) jämfört med normal human hud (B) var målat av uttryck för keratins 14 (röd: λ_ex 554 nm; λ_em 568 nm) och 10, involucrin (grön: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm ), filaggrin (grön: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm), och laminin 5 (grön: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm), och analyseras med confocal fluorescens Mikroskop. Cellkärna var visualiserat av DAPI färgning (blå: λ_ex 340 nm; λ_em 488 nm). Immunhistokemisk undersökning av 3D full-tjockleken på huden medel visade korrekt epidermal stratifiering bildar distinkta skikt i överhuden som sett i normal human hud. Medan celler från den lägsta epidermala skikten målat positivt för keratin 14, differentierade mer celler från supra-basala lagret visade keratin 10 och involucrin färgning. Mycket differentierade celler nära den hornlagret uttryckt filaggrin. Laminin 5 färgning visar att en basala lamina genereras för att fysiologiskt ansluta den epidermala till dermal facket (lägsta panel). Denna siffra har tagits från Voersmann et al. ¹⁵ med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 : Antal och storlek av spontant bildade melanom Bon kan inte förutsägas. De novo melanom boet bildandet i dermal facket av full hud medel kan uppnås genom att blanda ett definierat antal melanom celler med primära fibroblaster till bädda in båda celltyper i kollagen typ I matrix. Antal och storlek av spontant bildade melanom Bon kan endast analyseras från en mogen 3D hud rekonstruera efter ca 21 dagar. Som skildras från två prover (A) och (B), antal och storlekar av melanom Bon kan variera mellan enskilda hud rekonstruerar. Följaktligen är det svårt att verifiera dessa modeller och förutsäga den terapeutiska effekten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 : Melanom spheroids integreras i huden medel recapitulate nyckel dragen av mänskliga kutana melanom metastas. H & E målat paraffin avsnitt av tumör spheroids inbäddade i huden medel avslöjade spheroids dela viktiga funktioner med icke-vaskulariserad mänskliga kutana melanom metastaser i vivo. Två subpopulations av celler är tydligt urskiljbar: en perifer levande subpopulation och centrala subpopulation huvudsakligen bestående av krympta, apoptotiska eller nekrotiska celler, bildar stadens ”nekrotisk”. Denna fördelning av tumör cell subpopulations garanteras av sfäroid storlek. Denna siffra har ändrats från Voersmann et al. ¹⁵ med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Organotypic melanom sfäroid hud modell införs här garanterar nya insikter för en djupare förståelse av intra-tumoral och tumör-host interaktion, och föreskriva en avancerad screening plattform för att studera molekylära mekanismer för tumörutveckling och terapimotstånd i framtiden.

Att garantera bäst fysiologiska och i vivo härma villkor av hud rekonstruerar, kvaliteten på de primära cellerna är av yttersta vikt. Som nämnts ovan, juvenil eller prenatala hudceller Visa lägsta differentiering betyget och passar därför bäst att generera fullhudsskador hud medel. Första möjliga kvalitetskontroll är omfattningen av dermal kontraktion vid dag 2 efter sådd keratinocyter och equilibrating gelen till extra bolagsstämma (protokoll avsnitt 8.2 och 8.3). Dermal geler krymper mest med den bästa kvaliteten av fibroblaster. Också, försämra integrationen av för få eller för många fibroblaster dermal kontraktion och följaktligen fastsättning av den epidermala dermal facket. Detta kommer att i sin tur äventyra epidermal differentiering, eftersom denna process kräver en omfattande överhörning mellan dermala och epidermala celler.

Kvaliteten på primära celler är också kritiskt beroende av den cellen konfluens samt passagen av cellerna. Om keratinocyter odlas till ≥80% konfluens de omedelbart stoppa allt fler och börja att skilja. Det är därför viktigt att kultur dem till 40-70% konfluens under passaging och använda dem nej senare än passage 3-4. Fibroblaster är mindre känsliga men bör inte användas senare än passage 4-6. Observera även att alla primära celler och cellinjer som används för att generera organotypic melanom sfäroid hud modeller är odlade utan antibiotika, och därför förorening risken är hög. Men tillägg av antibiotika ändras physiologyen av de enskilda cellerna och därför minskar kvaliteten på huden motsvarigheterna.

I allmänhet är sfäroid tumörbildning möjligt från nästan alla typer av tumör cellinjer och även från tumörceller nymalen isolerade från patientmaterial. Den initiala cell och/eller odling tid för att få optimal sfäroid storlekar kan variera beroende på vilken celltyp används. Upp till 150-200 µm, kan alla celler som ingår i en sfäroid fortfarande tillräckligt levereras med näringsämnen via enkel diffusion. Endast spheroids med storlekar ≥500 µm visar en hög grad av celldifferentiering och representerar typiska drag av icke-vaskulariserad tumör vävnad²².

Organotypic melanom-sfäroid-hud-modellen utvecklades här är särskilt lämpliga att studera tumör-host interaktioner och för melanom drogtester under in-vivo-gillar villkor¹⁵. Ändå är miljön av melanom i vivo ännu mer komplex, hyser en mängd tumör associerade celltyper, däribland immunceller och endotelceller. Eftersom tillägg av ordentlig primära immunceller står inför problem med histocompatibility, ännu dessa modeller inte möjlighet att på lämpligt sätt övervaka immun-terapeutiska metoder.

Dock melanom spheroids kan genereras från färska isolerade patientmaterial och när ingår i den fullständiga hud rekonstruera, kan tjäna som enskilda drog screening plattformar. Även integrering av bitar av melanom metastaser i huden rekonstruerar är tänkbart att testa läkemedelskombinationer i en skräddarsydda behandlingsmetoder. Inklusive organotypic 3D hudmelanom modellen i prekliniska tester kommer sannolikt att bidra till att säkerställa att endast de mest lovande nya terapeutiska koncept tas fram i kliniska tester, därmed minska förslitningen andelen potentiella nya behandlingar för detta sjukdom och öka graden av terapeutisk framgång i kliniska prövningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
fetal serum albumin (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	add 10 % to cell culture medium
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X dilute in PBS
RPMI	Thermo Fisher Scientific	61870010	for cultivation of melanoma cell lines
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	for cultivation of primary fibroblasts
Dispase	Gibco life technologies	17105041	2U/ml, dissolve in PBS
Collagen type I	BD Biosciences	354249	usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml
24-well inserts Nunclon	Nunc	140629	8 µm pore size; use standing, not hanging inserts!
cell strainer	BD Falcon	352360	yellow
Gentamycine	Thermo Fisher Scientific	15750060	dissolve in PBS
Keralife keratincyte medium	Cell Systems		do not add FCS or antibiotics
Collagenase	SERVA	17454	NB4 standard grade
juvenile human keratinocytes	Cell Systems	FC-0007	alternative to own preparation from juvenile foreskin
juvenile human fibroblasts	Cell Systems	FC-0001	alternative to own preparation from juvenile foreskin
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate	Gibco life technologies	41965	mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium;          mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine	Gibco life technologies	21765-029	add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)
EGF	Gibco life technologies	13247-051	add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium
Calcium chloride	Merck Chemicals	2381	add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium
Selenic acid	Alfa Aesar	18851	add 53 nM for the generation of EGM and MM medium
Insulin	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E-0135	add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
P-Ethanolamine	Sigma-Aldrich	P-0503	add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium
Holo-Transferrine	Sigma-Aldrich	T-0665	add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Triiodthyronine	Sigma-Aldrich	T-6397	add 20 pM for the generation of EGM and MM medium
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-088816	add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	add 10 nM only for the generation of EGM medium
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	add 15 mM for the generation of EGM and MM medium
Serine	Sigma-Aldrich	S-4311	add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
Cholinchloride	Sigma-Aldrich	C-7017	add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lot 086K0361	add 2 % for the generation of EGM and MM medium
Adenine	Sigma-Aldrich	A-9795	add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium
L-Glutamine	PromoCell	C-42209	add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium
Strontiumchloride	Sigma-Aldrich	255521	add 1 mM for the generation of EGM and MM medium
anti cytokeratin 10 antibody	Dako	M7002	1:50
anti cytokeratin 14 antibody	Santa Cruz	sc-53253	1:200
anti laminin 5 antibody	Santa Cruz	sc-32794	1:50
anti filaggrin antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-13440	1:50
anti involucrin antibody	Acris Antibodies	AM33368PU	1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled	LifeSpan Biosciences	LS-C153907	1:50
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled	Jackson Immuno Research	115-165-003	1:1000
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	1:100