Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

جيل مونومر Exon1 هونتينجتين الأصلية، وليس تمييز وييفات استخدام استراتيجية انصهار السومو

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular and Chemical Biology of Neurodegeneration, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

نقدم هنا، بروتوكول قوية ومحسنة لإنتاج كميات مليغرام من مونومرات أصلية وخالية من العلامة وييفات من exon1 البروتين هونتينجتين (Httex1) استناداً إلى الانصهار عابرة من معدل ubiquitin الصغيرة ذات الصلة (سومو).

Abstract

مرض هنتنغتون (HD) مرض موروثة الأعصاب قاتلة الناجمة عن عملية توسيع المساعدة النقدية (إيه ثري سيكس) في إكسون أول من الجينات عالية الدقة، أسفر عن التعبير عن البروتين هونتينجتين (Htt) أو الطرفي ن أجزاء منه مع (polyglutamine الموسعة الامتداد polyQ).

Exon1 البروتين هونتينجتين (Httex1) هو أصغر جزء Htt أن يلخص العديد من ميزات عالية الدقة في الخلوي والحيوان نماذج، وهو أحد أجزاء الدراسة على نطاق واسع من Htt. صغر حجم Httex1 يجعله تجريبيا أكثر قابلية لتوصيف الفيزيائية الحيوية باستخدام التقنيات القياسية وعالية الدقة بالمقارنة مع أجزاء أطول أو Htt كاملة الطول. ومع ذلك، تجميع عالية الميل للمسخ Httex1 (mHttex1) مع polyQ زيادة المحتوى (إيه فور تو) جعلت من الصعب لتطوير كفاءة التعبير وأنظمة تنقية إنتاج هذه البروتينات بكميات كافية، وجعلها متاحة العلماء من مختلف التخصصات دون استخدام البروتينات الانصهار أو غيرها من الاستراتيجيات التي تغير التسلسل الأصلي للبروتين. نقدم هنا طريقة قوية ومحسنة لإنتاج كميات مليغرام من أصلي، العلامة خالية Httex1 استناداً إلى الانصهار عابرة من معدل ubiquitin الصغيرة ذات الصلة (سومو). بالبساطة والكفاءة الاستراتيجية سيقضي على الحاجة إلى استخدام تسلسلات غير أصلي من Httex1، وبالتالي جعل هذا البروتين أكثر متاحة للباحثين وتحسين إمكانية تكرار نتائج التجارب في مختبرات مختلفة. ونحن نعتقد أن هذه السلف سيسهل أيضا الدراسات المستقبلية الرامية إلى توضيح العلاقة بنية الدالة Htt، فضلا عن تطوير أدوات تشخيص الرواية والعلاجات لعلاج أو إبطاء التطور من [هد].

Introduction

Htt هو بروتين كاتشين 348، وقد تورط في عدة وظائف فسيولوجية1. عندما Htt يحتوي على منطقة polyQ موسعة من بقايا أكثر من 36 في نهايته N، فإنه يتسبب HD2،3. علم الأمراض HD يتميز بتضمينات الخلوية في المخطط واللحاء، مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية وضمور الأنسجة المتضررة4،5. تم اكتشاف الجثة العقول من المرضى عالية الدقة في عدة أجزاء Htt ن--المحطة الطرفية التي تحتوي على المسالك تكرار polyQ ويعتقد يمكن إنشاؤها بواسطة المعالجة بروتيوليتيك ل البروتين هونتينجتين6. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن Httex1 أيضا يمكن أن يتشكل بسبب الربط مرناً الشاذة. يحتوي Httex1 على الطفرة polyQ المرضية وما أوفيريكسبريشن في الحيوانات يمكن أن الخص العديد من السمات الرئيسية هد7، وبالتالي إبراز دور مركزي ممكنة لهذا الجزء في هد علم الأمراض والأمراض تطور6، 8،9.

سبب تجميع عالية الميل للمسخ Httex1 (mHttex1) مع polyQ توسيع المسالك، تستند غالبية النظم القائمة على التعبير الانصهار عابرة من Httex1 للبروتينات (مثل الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST)، ثيوريدوكسين (TRX) أو مالتوس-ملزمة-البروتين (MBP) و/أو الببتيدات (بولي-الحامض الأميني) أن تحسين متفاوتاً في التعبير والذوبان في الاستقرار وتنقية10،11،،من1213،14 ،،من1516،17،،من1819،20،21،22،23 ،،من2425،26،،من2728. شريك الانصهار ترتبط Httex1 مع سلسلة قصيرة تحتوي على موقع انقسام البروتياز مثل التربسين، ذكر أحفر حوزتي الفيروس (TEV) أو بريسسيسيون للسماح للانقسام وإطلاق سراح Httex1 قبل الشروع في تجميع أو تنقية. وتشمل أوجه القصور في هذه الطرق إمكانية ترك مخلفات إضافية نظراً للانقسام وغير تراسيليس وإنشاء أجزاء مبتورة بسبب ميسكليفاجي ضمن تسلسل Httex1، بالإضافة إلى عدم التجانس نظراً للانقسام وغير مكتملة ( انظر فيفيغ et al. لمزيد من المناقشات المتعمقة عن مزايا وقيود هذا النهج)10. لمعالجة هذه القيود، وضعنا مؤخرا استراتيجية تعبير تمكين توليد Httex1 خالية من العلامة الأصلية للمرة الأولى باستخدام انصهار الطرفي ن عابرة من سينيتشوسيستيس sp. (Ssp) انتئين دناب إلى Httex110. بينما الانقسام انتئين traceless ومحددة وتعطي كمية ملغ من البروتينات، فإنه لا يزال يعاني اثنين من العوائق التي يمكن أن تقلل من العائد: إلا وهي سابقة لأوانها الانقسام من انتئين التي يمكن أن تحدث أثناء التعبير، وحقيقة أن يحدث انشقاق أكثر عدة ساعات، مما قد يؤدي إلى فقدان البروتين نظراً للتجميع، لا سيما بالنسبة Httex1 مع تكرار polyQ الموسع.

لمعالجة هذه القيود وصقل استراتيجيتنا لإنتاج أصلي، خالية من علامة Httex1، طورنا نظام تعبير جديد يستند إلى الانصهار عابرة من السومو، أكثر تماما الخميرة هومولوج Smt3 إلى Httex1. تطبيق نظام السومو لإنتاج البروتينات المؤتلف نشرت لأول مرة في عام 200429، حيث اتضح زيادة معدل التعبير والذوبان من البروتين الانصهار السومو. يمكن المشقوق العلامة السومو من أوبيكويتين مثل البروتين-خاصة بحوزتي 1 (ULP1)، التي لا تتطلب اعتراف بموقع، ولكن يعترف هيكل التعليم العالي السومو ويلغي عمليا إمكانية ميسكليفاجي30. وعلاوة على ذلك، الانقسام و ULP1 بوساطة سريع وتراسلس ولا تترك بقايا إضافية. الانقسام سابق لأوانه للعلامة الانصهار، كما لاحظت مع انتئين أوتوكاتاليتيك10، هو تجنبها تماما بشرط حوزتي الخارجية. في حين أن استراتيجية سومو يستخدم على نطاق واسع في الوقت الحاضر للبروتين المؤتلف إنتاج31،،من3233، نظهر في هذه الورقة أنها مفيدة بشكل خاص للجيل من المختلين جوهريا، بروتين أميلويدوجينيك المعرضة للتجميع، مثل Httex1. ونحن نعتقد أن البساطة والكفاءة ومتانة أسلوبنا سومو-المستندة إلى الانصهار سوف تجعل Httex1 الأصلية، وخالية من علامة أيسر منالاً للباحثين من مختلف التخصصات والقضاء على الحاجة إلى استخدام تسلسلات غير أصلي من Httex1 في المختبر . وهذا تقدم هام التي ستسهل الدراسات المستقبلية توضيح علاقة بنية الدالة Httex1.

يصف البروتوكول تنقية Httex1 من 12 ل ثقافة البكتيرية، ولكن البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لمقياس أصغر أو أكبر للإنتاج. وصف البروتوكول إنتاج نوع البرية Httex1 (wtHttex1) مع polyQ طول تكرار أدناه (23Q) والمسخ Httex1 (mHttex1) مع polyQ تكرار طول أعلاه (43Q) على عتبة المسببة للمرض (36Q).

Protocol

1-التعبير عن المؤتلف Httex1 23Q و 43Q

  1. إعداد المخازن المؤقتة المطلوبة والحلول. إعداد 1000 × الحل الأسهم الأمبيسلّين (أمبير، 100 مغ/مل)، والتصفية (0.2 ميكرومتر)، الكوة ومخزن في-20 درجة مئوية. إعداد متوسطة مرق (رطل) ليسوجيني (ز 25 رطل ميلر الواحدة ل 1 ح2س)، اﻷوتوكﻻف. إعداد 1 م الأيزوبروبيل ß-د-1thiogalactopyranoside (إيبتج) الأسهم حل وتصفية (0.2 ميكرومتر)، قاسمة ومخزن في-20 درجة مئوية.
  2. تحويل المواد الكيميائية المختصة كولاي ب ER 2566 مع ناقل pTWIN1، التي تحتوي على Httex1 البشرية التي تنصهر فيها علامة N-محطة His6-سومو مع أسلوب الصدمة الحرارة34.
    ملاحظة: كما تم استخدام سلالة BL21 DE3 كولاي . ومع ذلك، في هذه الحالة قد لوحظ زيادة كمية ترونكاتيونس.
  3. تطعيم 200 مل من رطل والمتوسطة مع 1 × أمبير في قارورة مخروطية الشكل 1 لتر بإضافة مستعمرة واحدة من لوحة أجار مع تلميح ماصة معقمة. احتضان الثقافة في 30 درجة مئوية و 180 لفة في الدقيقة ح 20 (بين عشية وضحاها) في حاضنة البكتيري.
  4. يأخذ عينة 1 مل من الثقافة مع ماصة معقمة. قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) من العينة مع ومبومو بلاستيك القابل للصرف وفوتومتريه (احترام القياس تتراوح بين 0.1 و 1، مخفف مع رطل-متوسط إذا لزم الأمر). حساب مقدار بريكولتوري الذي سيؤدي إلى انطلاق OD600 0.05 في ثقافة 3 لتر (مع بريكولتوري OD600 = 3 يعني 50 مل).
  5. تطعيم أربع ثقافات (كل 3 لتر من رطل والمتوسطة مع 1 × أمبير في قارورة ل 5)، بإضافة المبلغ المحسوب بريكولتوري مع ماصة معقمة. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة في حاضنة جرثومية.
  6. كل 30 دقيقة، أخذ عينة 1 مل من الثقافة مع ماصة معقمة. قياس OD600 من العينة مع ومبومو بلاستيك القابل للصرف وشحني. عندما وصلت إلى OD600 0.1 (عادة بعد 1-2 ساعة)، تعيين درجة حرارة الحاضنة البكتيرية إلى 14 درجة مئوية ويستمر الاحتضان أثناء التبريد. كل 30 دقيقة، أخذ عينة 1 مل من الثقافة مع ماصة معقمة. قياس OD600 من العينة مع ومبومو بلاستيك القابل للصرف وشحني.
    ملاحظة: قد تختلف الوقت لتبريد الثقافات مع الحاضنة المستخدمة، حيث قد يكون الوقت ليبدأ التبريد لتكييفها تبعاً لنوع حاضنة المستخدمة. ومع ذلك، تغيير التدرج درجة الحرارة ينبغي فقط أثرا صغيرة على العائد كما يبدو أن البروتين الانصهار سومو مستقر تماما.
  7. عندما وصلت OD600 0.3-0.4 (عادة بعد ح 1-2)، وأخذ عينة التعريفي قبل الثقافة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل أوفيريكسبريسيون. حساب حجم العينة التي تعطي كمية مماثلة من الخلايا وإشارة جيدة في أخذ الملون الحزب الديمقراطي الصربي صفحة: هلام جيدا 10: وحدة التخزين = 0.2 مل/OD600؛ تأخذ النصف بالنسبة لجل جيدا 15.
    1. لثقافة بكتيرية مع OD600= 0.4، تأخذ 500 ميليلتر. تأخذ حجم المحسوبة من ثقافة البكتيرية مع ماصة معقمة. تدور أسفل العينة (18000 × ز، 4 درجة مئوية، 2 دقيقة) وتجاهل المادة طافية. الحفاظ بيليه في-20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام لتحليل (الخطوة 1، 11).
  8. حمل التعبير البروتين قبل مل 1.2 بيبيتينج حل الأسهم إيبتج 1 م لكل حل الثقافة 3 لتر (التركيز النهائي 0.4 مم). ما زالت تفرخ الثقافة في 14 درجة مئوية ح 16 (بين عشية وضحاها).
    ملاحظة: درجة الحرارة سوف عادة وصلت ~ 20 درجة مئوية بحلول الوقت الذي يتم إضافة إيبتج، اعتماداً على أداء الحاضنة.
  9. يأخذ عينة التعريفي ما بعد الثقافة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل أوفيريكسبريشن، اتباع الإجراء الموضح في الخطوة 1، 7.
  10. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في أنابيب 1 لتر (3993 x ز، 4 درجة مئوية، 10 دقيقة). تجاهل المادة طافية وإبقاء بيليه الخلية على الجليد والانتقال مباشرة إلى التنقية.
  11. تحليل overexpression من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة35،36. ريسوسبيند العينات قبل وبعد التعريفي في 20 ميليلتر لتشغيل المخزن المؤقت و 20 ميليلتر من 2 × تحميل صبغ. حرارة العينات لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية في كتلة حرارة وتحميل 20 ميليلتر في جل 15% بينما لا تزال ساخنة. تشغيل هلام لمدة 90 دقيقة في 180 ف وصمة عار الهلام مع أخذ صبغ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مقارنة مع نتائج الممثل في الشكل 1ج.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا، يمكن تجميد بيليه الخلية وتخزينها في-80 درجة مئوية لعدة أسابيع. لتحقيق أفضل النتائج، من المستحسن استخدام بيليه البكتيرية الطازجة وتجنب تجميد. تجميد أذاب قد يؤدي إلى تحلل الخلايا وتدهور Httex1. هذا قد تقلل المحصول ونوعية البروتين.

2-خلية تفسخ وتنقية له6-سومو Httex1 الانصهار البروتين معطلة تقارب معدنية اللوني (ايماك)

  1. إعداد 2 لتر من المخزن المؤقت A في زجاجة زجاج (50 مم تريس (هيدروكسيميثيل)-أمينوميثان (تريس)، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 15 ملم). تحضير 1 لتر من المخزن المؤقت ب (50 مم تريس، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 500 مم ايميدازول الأس الهيدروجيني 7.4) في زجاجة زجاج. وبعد تذويب الأملاح، ضبط درجة الحموضة مع 10 N HCl وتصفية الحلول في زجاجات جديدة مع عامل تصفية أعلى زجاجة (0.65 ميكرون). إعداد من فلوريد x phenylmethylsulfonyl 1000 (بمسف، 0.3 M) الأسهم الحل، الكوة إلى 100 ميليلتر ومخزن في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: البروتوكول يهدف إلى تمكين إكمال كافة الخطوات من تحلل الكريات البكتيرية على عكس مرحلة عالية الأداء اللوني السائل (RP-[هبلك]) تنقية و lyophilization ضمن ح 8-9. للحد من التراكم وبروتيوليسيس، من المستحسن للعمل بسرعة دون التوقف والقيام بكافة الخطوات في 4 درجات مئوية أو على الجليد.
  2. إضافة 100 ميليلتر لحل بمسف الأسهم وخمسة أقراص (1 كل 30 مل حجم النهائي) من مثبطات البروتياز إلى 100 مل من المخزن المؤقت ليبرد قبل إضافة ألف بيليه البكتيرية إلى المخزن المؤقت وتجانسه التعليق بالتحريك مع شريط إثارة مغناطيسية وبيبيتينج صعودا وهبوطاً أي ال ماصة معقمة 10 مل (~ 30 دقيقة).
  3. تقسيم تعليق البكتيريا إلى مختبرين 40 مل في أنابيب بلاستيكية يمكن التخلص منها 50 مل. Sonicate كل قاسمة في دفعة مياه/جليد لتحلل الخلية (السعة 70%، سونيكاتيون إجمالي الوقت 5 دقائق، فترات من 30 s سونيكاتيون، 30 s وقفه).
    ملاحظة: من المهم أن العينة لا تصل الحرارة أثناء الخطوة sonication. ينصح بإضافة بعض الماء إلى حمام الثلج لتحسين تبديد الحرارة أثناء sonication. قد يكون إجراء سونيكيشن على التكيف مع ما إذا كان يتم استخدام أداة مختلفة. ينبغي العمل، فضلا عن أساليب تحلل أخرى مثل "الصحافة الفرنسية" أو من ميكروفلويديزير وقد تكون مفيدة لتجنب التسخين لتجميع العينة والبروتين. هذه الأجهزة لم تكن متوفرة في المختبر، وحصلنا على نتائج جيدة مع لدينا بروتوكول sonication.
  4. أخذ عينة من 50 ميليلتر من للصوديوم دوديسيل كبريتات جل polyacrylamide التحليل الكهربي (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). الطرد المركزي العينة (18000 × ز، 4 درجة مئوية، 2 دقيقة) و "الماصة؛" الكسر القابلة للذوبان في أنبوب اختبار جديد. ريسوسبيند الكسر غير قابلة للذوبان في 50 ميليلتر من المخزن المؤقت أ مع ماصة. تبقى العينات على الجليد حتى الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل (الخطوة 2، 6).
  5. توضيح بالطرد المركزي (39191 x ز، 4 درجة مئوية، 60 دقيقة).
  6. أثناء خطوة الطرد المركزي، تحليل خطوة تحلل الخلية من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. إضافة 50 ميليلتر من 2 × تحميل صبغ للكسر القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان لعلى التوالي. الحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية وتحميل 2 ميليلتر في جل 15% بينما لا تزال ساخنة. تشغيل هلام لمدة 90 دقيقة في 180 ف وصمة عار الهلام مع أخذ صبغ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مقارنة مع نتائج الممثل في الشكل 1ج.
  7. تصفية المادة طافية (0.45 ميكرومتر، مرشحات المحاقن). أخذ عينة من 20 ميليلتر من المادة طافية المصفاة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل (الخطوة 2.11).
    ملاحظة: عادة، كمية من 90 إلى 100 مل من المادة طافية والموضحة، والتي تمت تصفيتها يتم الحصول عليها. بشكل عام، تكفي 3 حقنه مرشحات. في حالة مرهقة الترشيح، في محاولة لزيادة سرعة الطرد المركزي و/أو الوقت.
  8. عزل البروتين الانصهار Httex1 سومو His6 من البكتيريا أوضح ليستي التي تقارب معدنية المعطل تداولها اللوني (ايماك) على نظام سرعة أداء لوني سائل (فبلك) في 4 درجات مئوية37.
    1. ملء توضيح إلى سوبيرلوب والحمل على العمود ني-جاتا (تجريده وتنظيفها وإعادة شحنها وفقا لدليل الشركة المصنعة، فارغة سابقة تشغيل مستحسن) في أحجام العمود 2 مل/دقيقة تمر 10 (السيرة الذاتية، 200 مل) المخزن المؤقت A في 10 مل/دقيقة لغسل من البروتينات غير منضم.
    2. الوت البروتين الانصهار مع 2.5 استخدام السيرة الذاتية (50 مل) من 100 ٪ من المخزن المؤقت ب في 2 مل/دقيقة بحجم جزء من 50 مل لتحميل والغسيل ومل 5 شطف. مقارنة مع نتائج الممثل في الشكل 1د.
  9. أخذ عينة من كل جزء للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل (20 ميليلتر) وتجمع الكسور التي تحتوي على البروتين الانصهار وفقا لذروة chromatogram ايماك. إضافة (2S، 3S)-1,4-مكررا (سولفانيل) غاز البوتان-2، 3-ديول (DTT) ولسيستين (تركيز نهائي 100 ملم) كمسحوق وتذوب بعكس الأنبوب بلطف.
    ملاحظة: في تجربتنا نقاء البروتين الانصهار في كسور مختلفة قابلة للمقارنة. وكإجراء وقائي، ينبغي تجميع الكسور البروتين المنقي الانصهار بسرعة بعد ايماك لمنع تجميع الكسور مركزة بشكل كبير. وبالإضافة إلى ذلك، من المستحسن المضي مباشرة إلى انشقاق العلامة السومو وتنقية [هبلك]. إذا لزم الأمر، يمكن إيقاف البروتوكول هنا. الحل المخفف من البروتين الانصهار تم تجميدها في نيتروجين سائل والمخزنة في-80 درجة مئوية وتنقيته بعد ذوبان الجليد دون إجراء تخفيض كبير في الغلة. تخزين الحل المخفف للبروتين الانصهار في 4 درجات مئوية عن ح 24 كما يعطي نتائج مماثلة.
  10. تحليل ايماك بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة. إضافة 20 ميليلتر من تحميل صبغ لكل عينة. تحميل 2 ميليلتر من المواد الخام (2.7) والكسر غير منضم والكسر الغسيل وكل جزء من ذروة شطف في جل 15%. تشغيل هلام لمدة 90 دقيقة في 180 ف وصمة عار الهلام مع أخذ صبغ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مقارنة مع نتائج الممثل في الشكل 1د.

3-الانقسام له6-سومو-العلامة وتنقية [هبلك]

تنبيه: حامض Trifluoroacetic (تفا) سائل متقلبة ويمكن أن يسبب حروق شديدة حتى التعامل مع الرعاية. القيام بمعالجة كافة في غطاء دخان وارتداء معدات الحماية الشخصية الملائمة (أي، النتريل المتاح القفازات، ونظارات السلامة ومعطف مختبر).

  1. في زجاجة 5 لتر، إضافة 5 مل تفا مع المحاقن بلاستيكية إلى 5 لتر الماء ("ح ج:" المذيبات2س، 0.1% (تفا). إضافة 2.5 مل تفا مع حقنه بلاستيك باستخدام زجاجة 2.5 لتر من الاسيتو الانيتريل (الاسيتو الانيتريل باء: المذيبات، 0.1% تفا).
  2. تحضير النظام [هبلك] كما اقترحت الشركة المصنعة. إجراء تشغيل فارغة التأكد من عمود نظيفة.
  3. أخذ عينة من 100 ميليلتر من البروتين الانصهار قبل إضافة ULP1 لرصد رد فعل الانقسام قبل أوبلك (الخطوة 3، 5).
  4. نقل 20 مل البروتين الانصهار لأنبوب 50 مل جديدة وإضافة 0.4 مل من محلول الأسهم ULP1، واحتضان على الجليد. الحفاظ على البروتين الانصهار المتبقية على الجليد.
    ملاحظة: استخدم صاحب معلم الحفاز الجزء 403-621 من مبطلات Ubiquitin حدة مثل 1 (يشار إليها هنا "ULP1") تنشق العلامة السومو. البروتين الانصهار أكثر استقرارا من Httex1 ملصوق. من المستحسن عدم تنشق العلامة السومو من الدفعي بالكامل. بدلاً من ذلك، يستمر مع مختبرين للمساحة التي يمكن مباشرة وتماماً تطبيقه على العمود [هبلك].
  5. كل 10 دقائق، أخذ عينة من 100 ميليلتر من رد فعل الانقسام رصد التقدم المحرز عن طريق فائقة الأداء اللوني السائل (أوبلك). الطرد المركزي في النماذج (18000 دورة في الدقيقة، 4 درجة مئوية، 2 دقيقة) وتحليل 2 ميليلتر من المادة طافية من أوبلك (التدرج من 10% إلى 90% مذيب ب في ألف دقيقة 0.25 إلى 3، 10% ب 1 دقيقة، تشير إلى بناء على تعليمات من الشركة المصنعة للاستخدام الصك). مقارنة تشروماتوجرامس التي تم الحصول عليها للعينة قبل إضافة ULP1 والعينات التي تم أخذها. مقارنة النتائج مع نتائج الممثل في الشكل 2ب.
  6. بمجرد اكتمال السومو-انشقاق (ذروة البروتين الانصهار قد اختفى في UPLC chromatogram وهو تحويل بشكل كامل إلى ذروة السومو و Httex1 الظهور حديثا)، تصفية النموذج مع عامل تصفية المحاقن (0.22 ميكرومتر).
    ملاحظة: انشقاق السومو عادة سريع جداً (10-20 دقيقة في 4 درجة مئوية) ولذلك التحليل أوبلك مع وقت تشغيل من 4 دقيقة أداة قيمة لرصد رد فعل. تصفية العينة قبل [هبلك] تنقية أساسا إجراء وقائي لزيادة عمر العمود. يجب عدم تشغيل العينة عكر.
  7. تنقية العينة التي تم تصفيتها بالبرنامج العادي-[هبلك] (التدرج من المذيبات 25-35% ب في المذيبات أ، ما يزيد على 40 دقيقة في 15 مل/دقيقة (0-10 دقيقة: 5 ٪؛ 10-12.5 دقيقة: 5 إلى 25%، 12.5-52.5 دقيقة: 25 إلى 35%؛ 52.5 57.5 دقيقة 35 إلى 95%؛ تشير إلى بناء على تعليمات من الشركة المصنعة لاستخدام أداة). مقارنة مع نتائج الممثل في الشكل 2ج.
    ملاحظة: Httex1 وله6-سومو منفصلة أيضا من خلال البرنامج العادي-[هبلك]. ومع ذلك، يمكن أن تكون هناك كميات صغيرة من Httex1 المقطوعة في بداية ونهاية الذروة. جمع الكسور الصغيرة للحصول على الحد الأقصى من المواد النقية.
    تحذير: استخدام معدات السلامة الملائمة (أيمعطف مختبر والقفازات المعزولة ودرع وجه) عند التعامل مع سوائل التبريد.
  8. تحليل [هبلك]-الكسور بالرش الكهربائية التأين الكتلي (أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد، أوتوسامبلير، حقن 10 ميليلتر، تدفق 0.6 مل/دقيقة، المذيبات: 20% ب أ، لا عمود، تشير إلى بناء على تعليمات من الشركة المصنعة للاستخدام الصك) وأوبلك (التدرج من 10% إلى 90% مذيب ب في ألف مين 0.25 إلى 3، 10% ب 1 دقيقة، تشير إلى بناء على تعليمات من الشركة المصنعة للاستخدام الأداة.) تجمع الكسور النقاء مماثلة في أنابيب بلاستيكية 50 مل وتجميد في النتروجين السائل وليوفيليزي. تزن ونقل البروتين المجففة بالتبريد في أنابيب بلاستيكية 2 مل وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  9. توصيف المواد النقية UPLC وأي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد والحزب الديمقراطي الصربي صفحة. حل 100 ميكروغرام من Httex1 المجففة بالتبريد في 8 ميليلتر من تفا نظيفة في أنبوب 1.5 مل واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في أنبوبة الاختبار مغلقة. تتبخر بعناية تفا تحت غطاء دخان مع تيار من النيتروجين أو الأرجون. استخدام ضغط منخفض من النيتروجين/الأرجون لتجنب الخسائر في العينة.
    1. حل البروتين في 100 ميليلتر من ح22 تحليل سين ميليلتر من أوبلك و 5 ميليلتر من مرض التصلب العصبي المتعدد-دليل الاستدامة الاقتصادية كما هو الحال في الخطوة 3، 8. ميكس 20 ميليلتر من البروتين الحل مع 20 ميليلتر من 2 × تحميل صبغ.
    2. تحليل كميات من 1 ميكروغرام إلى 10 ميكروغرام من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. تشغيل هلام لمدة 90 دقيقة في 180 ف وصمة عار الهلام مع أخذ صبغ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مقارنة مع نتائج الممثل في الشكل 2د.

4-تصنيف وريسولوبيليزيشن من البروتينات Httex1

تنبيه: تفا سائل متقلبة ويمكن أن يسبب حروق شديدة حتى التعامل مع الرعاية. القيام بمعالجة كافة في غطاء دخان وارتداء معدات الحماية الشخصية الملائمة (أي النتريل المتاح القفازات، ونظارات السلامة ومعطف مختبر).

  1. إعداد 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) (كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 مم نا2هبو4، 2 مم خ2ص4، ودرجة الحموضة 7.4 ملم 137) من مسحوق خلط في أنبوب 50 مل. تصفية دببس الحل عن طريق فلتر 0.2 ميكرون قبل كل استعمال.
  2. حل 150 ميكروغرام من Httex1 المجففة بالتبريد في 12 ميليلتر من تفا نظيفة في أنبوب 1.5 مل واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في أنبوبة الاختبار مغلقة. تتبخر بعناية تفا تحت غطاء دخان مع تيار من النيتروجين أو الأرجون. استخدام ضغط منخفض من النيتروجين/الأرجون لتجنب فقدان عينة38.
    ملاحظة: بشكل عام، استخدام 4 ميليلتر تفا على حل وتصنيف 50 ميكروغرام من البروتين. هذا الإجراء سيتم إنشاء فيلم بروتين داخل جدران أنبوبة الاختبار. للحيلولة دون تجميع Httex1 فورا في الخطوات التالية، العمل مع مخازن تبريد مسبقاً والحفاظ على البروتين دائماً على الجليد وتجنب التركيزات العالية.
  3. حل البروتين مصنفة في 1 مل دببس قبل تبريد وضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4 مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم. تصفية الحل البروتين من خلال عامل تصفية الطرد مركزي كاتشين 100 في 1.5 مل أنابيب بلاستيكية (20000 س ز، 4 درجة مئوية، 20 دقيقة).
    ملاحظة: أن تركيز النظرية المحسوبة من Httex1 أعلى من التركيز النهائي المطلوب لحساب الخسارة المحتملة. خطوة الترشيح من الضروري إزالة أي المجاميع التي قد شكلت خلال انحلال البروتين.
  4. تحديد تركيز Httex1 استخدام منحنى معايرة UPLC استناداً إلى تحليل الأحماض الأمينية (الكشف في λ214) وإرسال 2 ميكروغرام من البروتين بتحليل الأحماض الأمينية للتحقق من صحة تركيز10. حساب مقدار دببس التي تحتاج إلى أن تضاف إلى الحصول على تركيز 3 ميكرومتر Httex1.
  5. تمييع البروتين إلى 3 ميكرومتر بإضافة المبلغ المحسوب من دببس إلى أنبوبة الاختبار. إبقاء الأنبوب على الجليد حتى الشروع في بروتوكول تجميع.
    ملاحظة: Httex1 لا يجب تخزين 43Q في الحل. دائماً إعداد حل بروتين جديدة استناداً إلى البروتوكول أعلاه. ويتم تخزين البروتينات Httex1 أفضل كمسحوق المجففة بالتبريد عند-20 درجة مئوية.

5-رصد لحركية التجميع من Httex1 43Q باستخدام أوبلك والتحليل الطيفي تلوانيه (CD) دائرية وتوصيف المجاميع بانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)

  1. إعداد اليورانيل فورمات لل كما ذكر سابقا39.
  2. بدء تجميع Httex1 43Q التي تفرخ حلاً 3 ميكرومتر في دببس عند 37 درجة مئوية (استخدام 1 مل من محلول أعدت كما هو موضح أعلاه في البروتوكول بالتفصيل).
    ملاحظة: يمكن أن يؤديها بتجميع Httex1 بتركيزات أعلى تبعاً لاحتياجات وأهداف التجربة.
  3. تحديد مقدار البروتين للذوبان باستخدام أوبلك في النقاط الزمنية المشار إليها (الساعة 0، 1، 2، 4، 6، 8 و 12، 24، 48 و 120 ح). للقيام بذلك، تأخذ قاسمة 35 ميليلتر وإزالة الركام غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي (20000 × ز، 4 درجة مئوية، 20 دقيقة). حقن ميليلتر 4 من المادة طافية أوبلك. حساب نسبة مركب قابل للذوبان استناداً إلى تغيير منطقة ذروة استخدام البرمجيات صك 40. مقارنة مع نتائج الممثل في الشكل 3ألف.
  4. وصف التغييرات في هيكل الثانوية باستخدام التحليل الطيفي CD في 0 وح 48. تأخذ قاسمة 100 ميليلتر وقياس اليبتيسيتي (1 مم الكوارتز ومبومو، 195 نانومتر إلى 250 نيوتن متر، 20 درجة مئوية، والبيانات تشير كل 0.2 شمال البحر الأبيض المتوسط، وسرعة 10 نيوتن متر/دقيقة، التكامل الرقمي الوقت 2 s، عرض النطاق الترددي من 1.0 nm). الحصول على الأطياف 6 العينة والمتوسط وسلس باستخدام عامل تصفية ثنائي الحد مع عرض الالتواء من 99. مؤامرة الأطياف ك بقايا يعني اليبتيسيتي المولى (θمخاطر)41. مقارنة مع نتائج الممثل في الشكل 3ب.
  5. وصف الخصائص الهيكلية والمورفولوجية للمجاميع التي تيم. وضع 3 ميليلتر من الحل البروتين على فورمفار/الكربون-مغلفة 200-مش شبكة، وخرج توهج نحاس لأدنى 1 يغسل الشبكة مرتين مع 15 ميكروليتر المياه، مرة واحدة مع 15 ميكروليتر فورمات اليورانيل 0.7% (w/v) ووصمة عار لمدة 30 ثانية مع 15 ميكروليتر من 0.7% w/v اليورانيل فورمات. القيام بتحليل تيم للشبكات. مقارنة مع نتائج الممثل في الشكل 3ج.

Representative Results

وأعرب عن Httex1 كولاي مع ن--المحطة طرفية في بلده6-العلامة السومو. يتم تلخيص نتائج الممثل للتعبير وتنقية البروتين الانصهار في الشكل 1. تسلسل Httex1 يتكون من مخلفات 2-90 Htt ويبدأ مع Ala2، لأن Met1 هو ملصوق تماما في فيفو42. الترقيم من الأحماض الأمينية التي تشير إلى متغير 23Q، يظهر التسلسل الكامل للبروتين الانصهار المعرب عنها في الشكل 1ألف. البلازميدات ستودع لدى أدجيني في المستقبل القريب أن تكون مشتركة مع المجتمع المحلي. ويبين الشكل 1بتخطيطي بلازميد والبروتين الانصهار أعرب. تعرب عن Httex1 His6-سومو على مستوى متوسط (الشكل 1ج) ومعظم من البروتين الانصهار موجود في جزء صغير قابل للذوبان بعد تحلل، سواء بالنسبة 23Q والخيار 43Q. وترحيل البروتين الانصهار أعلى من المتوقع، استناداً إلى الوزن الجزيئي. وهذا يرجع جزئيا إلى حظيرة سومو قوية ولكن في الغالب بسبب تكوين تسلسل غير عادية من Httex1، التي تحتوي على بقايا الجلوتامين وبرولين أساسا. Wildtype (23Q) والمسخ (43Q) يمكن إثراء البروتين الانصهار للنقاء ~ 80% من ايماك (الشكل 1د) يمكن تفسير وجود المشترك تنقية البروتين المضيف بمستوى منخفض نسبيا من التعبير Httex1 وعينه كبيرة حجم تطبيقه على العمود.

الانقسام له6-العلامة السومو وتنقية Httex1 يظهر في الشكل 2أ. أوبلك أداة فعالة لرصد الانقسام له6-سومو العلامة (الشكل 2ب). يستهلك في ذروة الأصلي من البروتين الانصهار وقمم جديدة والمنفصلين عن ذويهم جيدا اثنين الموافق له6-تظهر العلامة السومو و Httex1. رد فعل الانقسام وانتهى في 10-20 دقيقة. الغربية لطخة (البنك الدولي) بطيء جداً لرصد رد فعل الانقسام وكفاءة، ولكن قد أدرج في هذا الرقم كمرجع وإظهار مدى اكتمال الانقسام السومو. كلا Httex1 23Q و 43Q لا يمكن فصلها تماما عن له6-سومو الوسم بالبرنامج العادي-[هبلك] (الشكل 2ج) وتم الحصول على درجة نقاء عالية كما يتضح من تحليل أوبلك، مرض التصلب العصبي المتعدد، والحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 2د).

لتوضيح أن البروتينات Httex1 التي أعدها هذا الأسلوب الاحتفاظ بخصائص التجميع المتوقعة Httex1، قمنا بتقييم حركية فيبريليزيشن متحولة Httex1 عند 37 درجة مئوية قبل مقايسة ترسب، رصد التغييرات في هيكل الثانوية عن طريق مؤتمر نزع السلاح التحليل الطيفي، وتتميز مورفولوجية المجاميع بال. مجموعة بيانات تمثيلية من حركية التجميع لتشكيل فيبريل mHttex1 كما يحددها مقايسة ترسب يرد فيالشكل 3ألف. فقدان القابلة للذوبان Httex1 43Q على مر الزمن، بسبب تشكيل فيبريل كان كمياً أوبلك. ونلاحظ استنفاد كامل للبروتين للذوبان بعد 48 ساعة حضانة. بالإضافة إلى ذلك، عقدنا العزم بنية ثانوية من البروتين بالتحليل الطيفي CD (الشكل 3ب). تحولات 43Q Httex1 غير منظم (λدقيقة 205 nm) لتشكيل الغنية أساسا β-ورقة (λدقيقة 215 nm) بعد 48 ساعة حضانة. ويرافق هذا التغيير الهيكلي تشكيل المجاميع فيبريلار منذ فترة طويلة كما يمكن ملاحظته من تيم في 48 ساعة (الشكل 3ج).

Figure 1
الشكل 1 . التعبير وتنقية له6-البروتين الانصهار سومو Httex1. 
(أ) تسلسل الأحماض الأمينية له6-سومو-Httex1-سن بنيات الانصهار (له6-سومو باللون الأخضر و Httex1-سن في أورانج)؛ (ب) عامة التخطيطي للتعبير وتنقية البروتين الانصهار؛ (ج) تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة للتعبير وقابلية الذوبان من البروتين الانصهار بعد تحلل؛ (د) تشروماتوجرام لتنقية البروتين الانصهار ايماك وتحليل للكسور جانب الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (شريط أحمر: شريط الكسر غير منضم، الأزرق: أغسل الكسر، أسود بار: الكسور التي تحتوي على ذروة شطف)؛ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . الانقسام له6 سومو العلامة وتنقية البروتينات خالية من علامة Httex1-سن .
(أ) نظرة عامة التخطيطي؛ (ب) تحليل الانقسام والعلامة سومو مع ULP1 من أوبلك (الأزرق: قبل إضافة ULP1؛ الأسود: 20 دقيقة (23Q)، على التوالي 10 دقيقة (43Q) بعد إضافة ULP1) والبنك الدولي (MAB5492 1:2000، الماعز الثانوي المضادة بينها جسم الماوس)؛ (ج) تشروماتوجرام لتنقية RP-[هبلك] محضرة Httex1؛ دال: تحليل Httex1 المنقي من أوبلك، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وأي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد؛ الوزن الجزيئي المتوقع هو 9943 دا (23Q) ودا 12506 (43Q) على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . تجميع Httex1-43Q: المقايسة الترسب (أ) استناداً إلى أوبلك. (ب) الأطياف مؤتمر نزع السلاح للهيكل الثانوي في ح 0 و 48 حاء (ج) تيم ميكروجرافس من المجاميع في ح 48 (أشرطة مقياس هي 200 nm). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

في هذا البروتوكول، وقد اوجزنا إجراء فعال للحصول على كميات مليغرام من أصلي، تمييز Httex1 التي تحتوي على بقايا الجلوتامين 23 أو 43. وقد تحقق ذلك بالإعراب عن Httex1 كالتحام المحطة طرفية ج له6-العلامة السومو، التي تستخدم لعزل البروتين الانصهار من الخلية ليستي ايماك وهو المشقوق قبل تنقية [هبلك] من Httex1. بينما قد استخدمت استراتيجية السومو في إنتاج العديد من البروتينات الأخرى، لدينا أسلوب يظهر أن خصائص فريدة من نوعها السومو يمكن استخدامها أيضا لتوليد جوهريا اضطرابه، المعرضة للتجميع، بروتين أميلويدوجينيك التي أثبتت سابقا أن تكون الصعوبة بمكان التعامل معها وتنتج43،44. نقدم بروتوكول التي واضحة وسهلة الاستخدام وقابلة للمقارنة لوضع بروتوكول للجيل من البروتين "تصرفت بشكل جيد". سولوبيليزيس الانصهار السومو وتستقر Httex1 أثناء التعبير والخطوة تنقية ايماك. الانقسام سابق لأوانه للعلامة، كما لاحظت مع استراتيجية انتئين10 والتجميع لم تعد مشكلة.

البروتينات اضطرابه جوهريا عرضه للتدهور. في حين تدهور الطرفي ن في منطقة N17 ليست قضية استخدام هذا البروتوكول، يمكن أن تحدث ترونكيشنز في دلتا نهر اللؤلؤ Httex1. كما أن البروتينات مبتوراً متشابهة جداً إلى Httex1 في هيدروفوبيسيتي، تهمة، وحجم، وإزالتها بالوسائل الكروماتوغرافي التحدي، وبالتالي فمن الأفضل لمنع تكونها في المقام الأول. تخرج عن كثب للبروتوكول، تعمل دائماً على الجليد واستخدام كمية كافية من مثبطات البروتياز ينبغي أن تساعد الحفاظ على مستوى من الملاحظ اقتطاع منخفضة للغاية. تطبيق علامة انصهار في ج-محطة Httex1 يمكن إزالة truncations في دلتا نهر اللؤلؤ بسهولة كما سيفقد البروتين مبتوراً علامة تقارب كذلك. ومع ذلك، إذا كان التسلسل الأصلي الذي يحتاج إلى الإبقاء على هذا الخيار لا يمكن تطبيقها كما Httex1 ينتهي مع برولين والأفضل من معرفتنا هناك لا علامات الانصهار ج-محطة معروفة للحث على الانقسام وتراسلس وكفاءة بعد برولين.

الجزء الأكثر أهمية من البروتوكول هو التعامل مع Httex1 حررتها بعد انشقاق العلامة سومو ULP1. يجب تنقية البروتين مباشرة بالبرنامج العادي-[هبلك]. لحسن الحظ، وهذا هو فعل تتسم بالكفاءة والسرعة التي عادة ما يتم الانتهاء في 10-20 دقيقة في 4 درجات مئوية. وفي المقابل، المطلوب الاستراتيجية انتئين عدة ساعات للانقسام كاملة من انتئين، مما يتطلب مفاضلة بين الانقسام غير مكتملة وبداية التجميع من أجل تعظيم العائد. Workup سريع مطلوب للمسخ Httex1، كما أنها ستبدأ بتجميع بتركيز عال نسبيا في رد فعل الانقسام، بينما البديل 23Q مستقرة لفترة أطول. أثناء تنقية RP-[هبلك]، ميزة أخرى من السومو يصبح واضحا: حين انتئين دناب Ssp هو مسعور، وتتمسك بقوة بالعمود، سومو هو أكثر ماء والتيس تماما من العمود عكس المرحلة C4. على الرغم من أن ULP1 تجارية مكلفة جداً، يمكن أن تنتج البروتين بسهولة في عالية الغلة بعد29من البروتوكولات نشرت سابقا.

لا يمكن أن تكون الأهمية القصوى لتطبيق بروتوكول تفصيل قبل استخدام Httex1 التشديد. البروتينات polyQ المجففة بالتبريد مثل Httex1 مستقرة ويمكن أن تكون مخزنة في فترات طويلة، ولكن ليست تماما للذوبان في المياه والمخازن المؤقتة. يمكن أن يكون وجود ليغومرات بريفورميد أو ييفات أثر كبير على حركية التجميع والخصائص الفيزيائية ل البروتين45. يسمح البروتوكول تفصيل الموصوفة هنا التفصيل للبروتين، وإزالة الركام بريفورميد وجيل من حل أحادي Httex1 من عينة المجففة بالتبريد. لاحظنا مورفولوجيا حركية وفيبريل تجميع مماثلة للحصول عليها مع السومو واستراتيجية انتئين Httex1.

مقارنة بالطرق السابقة لإنتاج Httex1، الاستراتيجية سومو الموصوفة هنا يوفر العديد من المزايا، ويوسع نطاق الدراسات المحتملة للتحقيق في هيكل وخصائص وظيفية لهذا البروتين في الصحة والمرض. البروتين الانصهار سومو-Httex1 سهلة للتعامل، يمكن تجميد وتخزين أو الاحتفاظ في حل أجل 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة، في حين أن إجمالي mHttex1 الحرة بسرعة. الاستقرار والذوبان عالية من البروتينات الانصهار Httex1 سومو توفير قدر أكبر من المرونة التعامل مع البروتين و/أو إدخال تعديلات الانزيمية والكيميائيه في mHttex1 بخلاف ذلك لن يكون ممكناً بعد الانقسام. ويشمل ذلك إدخال التعديلات بوستترانسلاشونال، فلوروفوريس، وتدور التسميات، العلامات البيوتين، إلخ أن السلف المقدمة هنا 1) تسهيل الدراسات المستقبلية توضيح العلاقات بنية دالة من Httex1؛ 2) إنشاء أدوات جديدة للتحقيق Htt تجميع ونشر الأمراض؛ 3) تمكين تطوير فحوصات جديدة لتحديد الجزيئات التي تستقر المسخ Httex1 ومنع التجميع بها؛ و 4) تشجيع العلماء من الحقول الأخرى لكي تعمل على هذا البروتين والانضمام إلى سعينا لإيجاد علاج لمرض هنتنغتون.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح مع محتويات هذه المادة.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل أساسا من المنح المقدمة من مؤسسة يعقدها و "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية". ونشكر الدكتور صوفي فيفيغ لإجراء مناقشات مفيدة أثناء تطوير هذا النظام الجديد للتعبير وأعضاء آخرين من مجموعة لاشويل لتقاسم خبراتها مع هذا النظام التعبير وملاحظاتهم الإدخال وقيمة. ونشكر أيضا الأستاذ أوليفر هانتشيل لتوفير بلازميد ULP1. يشكر المؤلفون الدكتور جون وارنر باء والدكتور يونس ك. تانجاراج لاستعراض نقدي لهذه المخطوطة

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) EMS 22450
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids EMS FCF200-Cu-50
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics HellmaAnalytics 110-1-40
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA Witech SVA4730203
Ampicillin AxonLab A0839.0100
Luria Broth (Miller's LB Broth)  Chemie Brunschwig 1551.05
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) AxonLab A1008.0025
E. coli B ER2566 NEB NEB# E4130
Imidazole Sigma 56750-500G
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 Merck Millipore Corporation MAB5492
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) Licor 925-68070
PMSF AxonLab A0999.0005
HisPrep 16/10 column  GE Healthcare 28936551
C4 HPLC column Phenomenex 00G-4168.P0     10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed
Acetonitrile HPLC MachereyNagel C2502
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile Sarstedt AG 83.1826
Spectrophotometer semi-micro cuvette Reactolab S.A. 2534
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml GE Healthcare 18111382
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml Greiner Bio-One 7.160 102
 100 kD Microcon  fast flow filters Merck Millipore Corporation MRCF0R100
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor Sonics
Äkta 900 equipped with a fraction collector  GE Healthcare
Jasco J-815 Circular Dichroism Jasco
Waters UPLC system  Waters C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column  , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL
waters HPLC system Waters 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing
ESI-MS: Finnigan LTQ Thermo Fisher Scientific
lyophylizer instrument FreeZone 2.5 Plus
Tecnai Spirit BioTWIN  FEI electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV
37 °C shaking  incubator Infors HT multitron Standard
Biophotometer plus Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saudou, F., Humbert, S. The Biology of Huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  2. MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. Huntington's disease. Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).
  3. Li, S., Li, X. J. Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease. Molecular Neurodegeneration. 1, 19 (2006).
  4. DiFiglia, M. Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  5. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  6. Sathasivam, K., et al. Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).
  7. Mangiarini, L., et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell. 87 (3), 493-506 (1996).
  8. El-Daher, M. T., et al. Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation. EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).
  9. Lunkes, A., et al. Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).
  10. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  11. Georgalis, Y., et al. Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).
  12. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  13. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  14. Muchowski, P. J., et al. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).
  15. Heiser, V., et al. Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).
  16. Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation. Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).
  17. Tam, S., et al. The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).
  18. Nekooki-Machida, Y., et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).
  19. Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).
  20. Legleiter, J., et al. Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).
  21. Legleiter, J., et al. Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).
  22. Nucifora, L. G., et al. Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).
  23. Dahlgren, P. R., et al. Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation. Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).
  24. Poirier, M. A., et al. Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).
  25. Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy. Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).
  26. Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells. Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).
  27. Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation. Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).
  28. Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils. Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).
  29. Malakhov, M. P., et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).
  30. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  31. Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility. Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).
  32. Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System. Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).
  33. Reif, A., et al. Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6. Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).
  34. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  35. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).
  36. Lawrence, A. M., Besir, H. U. Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  37. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  38. Chen, S. M., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
  39. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  40. O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).
  41. Greenfield, N. J. Analysis of circular dichroism data. Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).
  42. Aiken, C. T., et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).
  43. Satakarni, M., Curtis, R. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).
  44. Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin. Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).
  45. Chen, S., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).

Tags

الكيمياء الحيوية، 136 قضية، HD، مرض هنتنغتون، هونتينجتين، نيوروديجينيريشن، بوليجلوتاميني، polyQ، تجميع وييفات، تكنولوجيا الانصهار سومو، التعبير البروتين وتنقية
جيل مونومر Exon1 هونتينجتين الأصلية، وليس تمييز وييفات استخدام استراتيجية انصهار السومو
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J.,… More

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J., Lashuel, H. A. Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy. J. Vis. Exp. (136), e57506, doi:10.3791/57506 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter