Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Generation af indfødte, ukodede Huntingtin Exon1 monomere og fibriller ved hjælp af en SUMO Fusion strategi

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular and Chemical Biology of Neurodegeneration, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Vi præsenterer her, en robust og optimeret protokol for produktion af milligram mængder af indfødte, tag-gratis monomerer og fibriller af exon1 af Huntingtin-protein (Httex1) baseret på den forbigående fusion af små ubiquitin relaterede modifier (SUMO).

Abstract

Huntington's chorea (HD) er en arvelig dødelig neurodegenerativ sygdom forårsaget af en CAG-udvidelse (≥36) i den første exon af HD-genet, hvilket resulterer i udtryk for Huntingtin-protein (Htt) eller N-terminale fragmenter heraf med en udvidet polyglutamin ( polyQ) strækning.

Exon1 af Huntingtin-protein (Httex1) er den mindste Htt-fragment, der sammenfatter mange af funktionerne i HD i cellulære og dyre modeller og er en af de mest studerede fragmenter af Htt. Den lille størrelse af Httex1 gør det eksperimentelt mere medgørlige til biofysiske karakterisering ved hjælp af standard og høj opløsning teknikker i forhold til længere fragmenter eller fuld længde Htt. Høj sammenlægning tilbøjelighed mutant Httex1 (mHttex1) med øget polyQ indhold (≥42) har imidlertid gjort det vanskeligt at udvikle effektive udtryk og vandrensningssystemer til at producere disse proteiner i tilstrækkelige mængder og gøre dem tilgængelige for forskere fra forskellige discipliner uden brug af fusion proteiner eller andre strategier, der ændrer den oprindelige sekvens af protein. Vi præsenterer her en robust og optimerede metode til produktion af milligram mængder af indfødte, tag-gratis Httex1 baseret på de forbigående fusion af små ubiquitin relaterede modifier (SUMO). Enkelhed og effektivitet af strategien vil eliminere behovet for at bruge ikke-hjemmehørende sekvenser af Httex1, således at gøre dette protein mere tilgængeligt for forskere og forbedre reproducerbarhed af eksperimenter på tværs af forskellige laboratorier. Vi mener, at disse fremskridt vil også fremme fremtidige undersøgelser sigter mod at belyse struktur-funktion relationer i Htt samt udvikle nye diagnostiske værktøjer og behandlingsformer til at behandle eller bremse udviklingen af HD.

Introduction

HTT er et protein, 348 kDa og har været involveret i flere fysiologiske funktioner1. Når Htt indeholder en udvidet polyQ regionen i mere end 36 restkoncentrationer i sin N-terminus, forårsager det HD2,3. HD patologi er karakteriseret af cellulære optagelser i striatum og cortex, som fører til neuronal død og atrofi af det berørte væv4,5. Flere N-terminale Htt fragmenter, der indeholder polyQ gentage tarmkanalen er blevet påvist i post mortem hjerner fra HD-patienter og menes at være genereret af proteolytiske behandling af huntingtin protein6. Nylige undersøgelser tyder på at Httex1 også kunne dannes som følge af afvigende mRNA-splicing. Httex1 indeholder den patologiske polyQ mutation og dens overekspression i dyr kan sammenfatte mange af de vigtigste funktioner i HD7, hvilket understreger en mulig centrale rolle i dette fragment i HD patologi og sygdom progression6, 8,9.

På grund af høje sammenlægning tilbøjelighed mutant Httex1 (mHttex1) med udvidet polyQ tarmkanalen, størstedelen af eksisterende udtryk systemer er baseret på den forbigående fusion af Httex1 til proteiner (f.eks glutathion-S-transferase (GST), thioredoxin (TRX) eller maltose-bindende-protein (MBPS) og/eller peptider (poly-histidin), varierende forbedre dens udtryk, stabilitet, rensning og/eller opløselighed10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Fusion partner er knyttet til Httex1 med en kort sekvens der indeholder en spaltning site for proteaser som trypsin, tobak etch virus (TEV) protease eller PreScission til at tillade kavalergang og frigivelse af Httex1 forud for indledningen af sammenlægning eller rensning. Mangler disse metoder omfatter mulighed for yderligere restkoncentrationer på grund af ikke-traceless kavalergang og oprettelsen af trunkerede fragmenter på grund af miscleavage inden for sekvensen af Httex1, ud over heterogenitet på grund af ufuldstændige kavalergang ( Se Vieweg et al. for mere tilbundsgående diskussion om de fordele og begrænsninger ved denne fremgangsmåde)10. For at løse disse begrænsninger, udviklet vi for nylig et udtryk strategi muliggør generation af tag-fri indfødte Httex1 for første gang ved at udnytte en forbigående N-terminale fusion af Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein til Httex110. Mens intein kavalergang er traceless og specifikke og udbytter mg mængden af proteiner, det stadig lider to ulemper, der kan reducere udbyttet: nemlig, for tidlig spaltning af den intein, som kan opstå under udtrykket, og det faktum, at spaltning opstår over flere timer, hvilket kunne føre til tab af protein som følge af sammenlægning, især for Httex1 med udvidet polyQ gentagelser.

At løse disse begrænsninger og raffinere vores strategi for produktion af indfødte tag-fri Httex1, vi udviklet et nyt udtryk system baseret på den forbigående fusion af SUMO, mere præcist gær homolog Smt3 til Httex1. Anvendelsen af SUMO system til produktion af rekombinante proteiner blev først offentliggjort i 200429, hvor en øget hyppighed af udtryk og Opløselighed af SUMO fusion protein blev demonstreret. SUMO tag kan kløves af proteaser ubiquitin som protein-specifikke protease 1 (ULP1), som ikke kræver en genkendelsessekvens, men genkender den tertiære struktur af SUMO og praktisk talt eliminerer muligheden for miscleavage30. Desuden en ULP1-medieret kavalergang er hurtig og traceless og efterlader ikke yderligere rester. Tidlig kløvningen af fusion-tag, undgås som observeret med autocatalytic intein10, helt ved kravet om en ekstern protease. Mens SUMO strategien er i dag udbredt for rekombinante protein produktion31,32,33, demonstrere vi i dette papir, det er især nyttigt for generation af et uløseligt uorganiseret, sammenlægning-liggende, amyloidogenic protein som Httex1. Vi mener, at enkelhed, effektivitet og robusthed af vores SUMO-fusion-baseret metode vil gøre indfødte, tag-gratis Httex1 mere tilgængeligt for forskere fra forskellige discipliner og eliminere behovet for at bruge ikke-hjemmehørende sekvenser af Httex1 in vitro- . Dette er et vigtigt fremskridt, der vil lette fremtidige undersøgelser for at belyse struktur-funktion relationen af Httex1.

Protokollen beskriver rensning af Httex1 fra 12 L bakteriekultur, men protokollen kunne tilpasses nemt for mindre eller større skala produktioner. Protokollen beskriver produktion af vildtype Httex1 (wtHttex1) med en polyQ repeatlængde nedenfor (23Q) og mutant Httex1 (mHttex1) med en polyQ gentage længde ovenfor (43Q) den patogene tærskel (36Q).

Protocol

1. angivelse af rekombinante Httex1 23Q og 43Q

  1. Forbered den nødvendige buffere og løsninger. Forberede 1000 x ampicillin (AMP, 100 mg/mL) stamopløsning, filter (0,2 µm), alikvot og opbevares ved-20 ° C. Forberede lysogeny bouillon (LB) medium (25 g LB Miller per 1 L H2O), autoklave. Forberede 1 M Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside (IPTG) stamopløsning, filter (0,2 µm), delprøve og butik på-20 ° C.
  2. Omdanne kemiske kompetente E. coli B ER 2566 med en pTWIN1 vektor, der indeholder menneskelige Httex1 sammenvoksede til en N-terminal His6-SUMO tag med heat shock metode34.
    Bemærk: E. coli BL21 DE3 stamme har også været brugt. Men i dette tilfælde en øget mængde af udeladelser blev observeret.
  3. Podes 200 mL af LB-medie med 1 x AMP i en konisk kolbe på 1 L ved at tilføje en enkelt koloni fra agar plade med en steril pipette spids. Inkuber kultur ved 30 ° C og 180 rpm for 20 h (natten) i en bakteriel inkubator.
  4. Tage en 1 mL prøve af kultur med en steril pipette. Måle den optisk tæthed på 600 nm (OD600) af prøven med en engangs plast kuvette og et fotometer (respekt måling spænder mellem 0,1 og 1, fortyndet med LB-medie, hvis nødvendigt). Beregningen af preculture, der vil resultere i en begyndende OD600 på 0,05 i en 3 L kultur (med en preculture OD600 = 3, der indebærer 50 mL).
  5. Podes fire kulturer (hver 3 L af LB-medie med 1 x AMP i en kolbe på 5 L), ved at tilføje det beregnede beløb for preculture med en steril pipette. Inkuber kulturer ved 37 ° C og 180 rpm i en bakteriel inkubator.
  6. Hvert 30 min, tage en 1 mL prøve af kultur med en steril pipette. Måle OD600 i eksemplet med en engangs plast kuvette og et fotometer. Når OD600 har nået 0,1 (typisk efter 1-2 h), indstille temperaturen af den bakterielle inkubator til 14 ° C og fortsætte inkubation mens køling. Hvert 30 min, tage en 1 mL prøve af kultur med en steril pipette. Måle OD600 i eksemplet med en engangs plast kuvette og et fotometer.
    NOTE: Tid til at køle kulturer kan variere med væksthuset bruges, så tid til at begynde køling skal muligvis tilpasses afhængigt af inkubator anvendes. Men skiftende temperaturgradient bør kun have en lille effekt på udbyttet som SUMO fusion protein synes at være helt stabil.
  7. Når OD600 har nået 0,3-0,4 (typisk efter 1-2 h), tage en pre induktion prøve af kultur for SDS-PAGE analyse af overekspression. Beregne stikprøvestørrelsen, der giver en tilsvarende mængde af celler og et godt signal på Coomassie farvede SDS-PAGE: For et 10 godt gel: volumen = 0,2 mL/OD600; Tag halvdelen af en 15 godt gel.
    1. For en bakteriekultur med en OD600= 0,4, tage 500 µL. Tage den beregnede mængde bakteriekultur med en steril pipette. Spin ned prøve (18000 x g, 4 ° C, 2 min) og supernatanten. Holde pelleten ved-20 ° C indtil klar til brug for analyse (trin 1.11).
  8. Fremkalde protein udtryk af pipettering 1,2 mL af en 1 M IPTG stamopløsning til hver 3 L kultur løsning (slutkoncentration 0,4 mM). Fortsætte inkubere kultur på 14 ° C i 16 timer (natten over).
    Bemærk: Temperaturen vil typisk have nået ~ 20 ° C ved den tid, IPTG er tilføjet, afhængigt af udførelsen af rugemaskinen.
  9. Tage en efter induktion prøve af kultur for SDS-PAGE analyse af overekspression, efter fremgangsmåden i trin 1.7.
  10. Høste cellerne ved centrifugering i 1 L rør (3993 x g, 4 ° C, 10 min). Supernatanten, holde den celle pellet på is og fortsætte direkte til rensning.
  11. Analysere overekspression af SDS-PAGE35,36. Resuspend før og efter induktion prøver i 20 µL kører buffer og 20 µL af 2 x lastning farvestof. Opvarme prøverne til 5 min. ved 95 ° C i en varme blok og indlæse 20 µL på en 15% gel mens stadig er varm. Køre gel i 90 min ved 180 V. pletten gel med Coomassie farvning efter instrukser fra fabrikanten. Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 1C.
    Bemærk: Protokollen kan blive stoppet her, celle pellet kan nedfryses og opbevares ved-80 ° C i flere uger. For optimale resultater anbefales det at bruge den friske bakteriel pellet og undgå frysning. Fryse-tø kan føre til lysering af cellerne og nedbrydning af Httex1. Dette kan reducere udbyttet og kvaliteten af proteinet.

2. celle Lysis og rensning af hans6-SUMO Httex1 Fusion Protein af immobiliserede Metal affinitet kromatografi (IMAC)

  1. Forberede 2 L buffer A i en glasflaske (50 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 500 mM NaCl, 15 mM imidazol). Forberede 1 L buffer B (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol pH 7,4) i en glasflaske. Efter opløsning af salte, pH-værdien med 10 N HCl og filtrere løsningerne i frisk flasker med en flaske top filter (0,65 µm). Forberede en 1000 x phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF, 0,3 M) bestand løsning, alikvot 100 µL og opbevares ved-20 ° C.
    Bemærk: Protokollen er designet til at udfylde alle trin fra lysering af bakteriel pellets til omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) rensning og ingot inden for 8-9 h. For at begrænse sammenlægning og proteolyse, anbefales det at arbejde hurtigt uden pauser og udføre alle trinene ved 4 ° C eller på is.
  2. Tilsættes 100 µL af PMSF stamopløsning og fem tabletter (1 pr. 30 mL af endelige rumfang) af protease hæmmer 100 mL pre kølet buffer A. Tilføj den bakterielle pellet til bufferen og homogeniseres suspensionen ved omrøring med en magnetisk røre bar og pipettering op og ned trådløs th en steril 10 mL pipette (~ 30 min).
  3. Opdele bakterier suspension i delprøver af 40 mL i 50 mL engangs plast rør. Der sonikeres hver delprøve i en vand-is batch for celle lysis (70% amplitude, samlede sonikering tid 5 min, intervaller af 30 s sonikering, 30 s pause).
    Bemærk: Det er vigtigt, at prøven ikke bliver varm under trinnet sonikering. Det anbefales at tilføje nogle vand til iskarret at forbedre varmeafledning under sonikering. Sonikering procedure muligvis tilpasses, hvis der bruges et andet instrument. Andre lysis metoder som en fransk presse eller et microfluidizer bør arbejde så godt og kan være en fordel at undgå opvarmning af prøven og protein sammenlægning. Disse enheder var ikke til rådighed i vores laboratorium og vi opnået gode resultater med vores sonikering protokol.
  4. Tage en prøve af 50 µL af de lysate for sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) analyse. Prøven (18000 x g, 4 ° C, 2 min) der centrifugeres og afpipetteres den vandopløselige fraktion i et nyt reagensglas. Resuspend de uopløselige brøkdel i 50 µL af buffer A med en pipette. Holde prøver på is indtil SDS-PAGE analyse (trin 2.6).
  5. Præcisere de lysate ved centrifugering (39191 x g, 4 ° C, 60 min).
  6. Analysere trinnet celle lysering af SDS-PAGE under trinnet centrifugering. Tilsæt 50 µL af 2 x lastning farvestof til den opløselige og uopløselige fraktion af den lysate henholdsvis. Varme i 5 min. ved 95 ° C og belastning 2 µL på en 15% gel mens stadig er varm. Køre gel i 90 min ved 180 V. pletten gel med Coomassie farvning efter instrukser fra fabrikanten. Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 1C.
  7. Filtrer supernatanten (0,45 µm, sprøjte filtre). Tage en prøve af 20 µL af den filtrerede supernatanten for SDS-PAGE analyse (trin 2.11).
    Bemærk: Typisk et rumfang på 90 til 100 mL af afklarede og filtrerede supernatanten er opnået. Typisk er 3 sprøjte filtre tilstrækkelig. Hvis filtrering er besværlige, forsøge at øge centrifugering hastighed og/eller tid.
  8. Isolere His6-SUMO Httex1 fusion protein fra den afklarede bakterielle lysate af immobiliserede metal affinitet kromatografi (IMAC) på en hurtig performance væskekromatografi (FPLC) systemet ved 4 ° C37.
    1. Fylde de klarede lysate i en superloop og belastning på kolonnen Ni-NTA (strippet, renset og genindlæses ifølge manualen af producenten, en tidligere Tom køre er anbefalet) på 2 mL/min. passere 10 kolonne diskenheder (CV, 200 mL) af buffer A 10 mL/min. til at vaske ud de ubundne proteiner.
    2. Elueres fusion protein med 2,5 CV (50 mL) af 100% af buffer B på 2 mL/min. Brug en brøkdel størrelse 50 mL ved påfyldning og vask og 5 mL til eluering. Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 1D.
  9. Tage en prøve af hver fraktion for SDS-PAGE analyse (20 µL) og pool fraktioner proteinholdige fusion efter toppen af IMAC kromatogram. Tilføje (2S, 3S) - 1,4 - Bis (sulfanyl) butan-2,3-diol (DTT) og L-Cystein (slutkoncentration 100 mM) som et pulver og opløses ved forsigtigt invertering af røret.
    Bemærk: Vores erfaring renheden af fusion protein i de forskellige fraktioner er sammenlignelige. Som en sikkerhedsforanstaltning, bør fraktioner af renset fusion protein derfor samles hurtigt efter IMAC at forhindre sammenlægning af de stærkt koncentreret fraktioner. Derudover anbefales det at fortsætte direkte til kløvningen af SUMO tag og HPLC rensning. Hvis det er nødvendigt, kan protokollen stoppet her. Den fortyndede opløsning af fusion protein var frosset i flydende kvælstof, opbevares ved-80 ° C og renset efter optøning uden en væsentlig reduktion i udbytte. Opbevaring af den fortyndede opløsning af fusion protein ved 4 ° C i 24 timer giver også lignende resultater.
  10. Analysere IMAC af SDS-PAGE. Tilføj 20 µL af lastning farvestof til hver prøve. Indlæse 2 µL af den rå materiale (2,7), den ubundne fraktion, vask fraktion og hver fraktion af eluering peak på en 15% gel. Køre gel i 90 min ved 180 V. pletten gel med Coomassie farvning efter instrukser fra fabrikanten. Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 1D.

3. kløvningen af hans6-SUMO-tag og HPLC rensning

Forsigtig: Trifluoreddikesyre (TFA) er en flygtig væske og kan forårsage alvorlige forbrændinger så håndterer med omhu. Udføre alle håndtering i et stinkskab og bære passende personlige værnemidler (dvs., engangs nitrilhandsker, sikkerhedsbriller og en lab coat).

  1. I en 5 L flaske, tilsættes 5 mL TFA med en plastik sprøjte til 5 L vand (solvent A: H2O, 0,1% (TFA). Tilføje 2,5 mL TFA med en plastik sprøjte til en 2,5 L flaske acetonitril (opløsningsmiddel B: acetonitril, 0,1% TFA).
  2. Forberede HPLC system som foreslået af fabrikanten. Udføre en tom Kør for at sikre en ren kolonne.
  3. Tage en prøve af 100 µL af fusion protein før tilsætning af ULP1 til at overvåge kavalergang reaktion af UPLC (trin 3.5).
  4. 20 mL af fusion protein overføres til en ny 50 mL tube og 0,4 mL af ULP1 stamopløsning tilsættes, inkuberes på is. Holde den resterende fusion protein på is.
    Bemærk: Hans-tagged katalytisk fragmentet 403-621 af Ubiquitin-lignende-specifikke protease 1 (her benævnt "ULP1") blev brugt til at kløve SUMO tag. Fusion protein er mere stabil end den kløvet Httex1. Det anbefales ikke at kløve SUMO tag af hele partiet. I stedet fortsætte med delprøver af en størrelse, der kan være direkte og helt anvendes til HPLC-kolonne.
  5. Hver 10 minutter, tage en prøve af 100 µL af kavalergang reaktion til at overvåge status af ultra-performance væskekromatografi (UPLC). Centrifugeres prøver (18000 rpm, 4 ° C, 2 min) og analysere 2 µL af supernatanten ved UPLC (gradient fra 10% til 90% væske B i A for 0,25 til 3 min, 10% B for 1 min, henvises til vejledningen fra producenten til instrument skik). Sammenlign kromatogrammer for prøven før tilsætning af ULP1 og der udtages. Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 2B.
  6. Når SUMO-kavalergang er færdig (toppen af fusion protein er forsvundet i UPLC kromatogrammet og er fuldt konverteret til den nyligt vises SUMO og Httex1 peak), filtrere prøven med en sprøjte filter (0,22 µm).
    Bemærk: SUMO kavalergang er typisk meget hurtigt (10-20 min. ved 4 ° C) UPLC analyse med en operationstid på 4 min er derfor et værdifuldt redskab til at overvåge reaktionen. Filtrering prøve før HPLC er rensning hovedsagelig en forebyggende foranstaltning at øge levetiden for kolonnen. Prøven bør ikke slå grumset.
  7. Rense den filtrerede prøve af RP-HPLC (gradient 25-35% opløsningsmiddel B i opløsningsmiddel A, over 40 min på 15 mL/min. (0-10 min: 5%, 10-12,5 min: 5-25%; 12,5-52,5 min: 25-35%, 52,5-57,5 min 35-95%; se instruktionerne fra producenten til instrument skik). Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 2C.
    Bemærk: Httex1 og hans6-SUMO separat godt af RP-HPLC. Der kan dog være små mængder af trunkerede Httex1 i begyndelsen og slutningen af toppen. Indsamle små brøker for at opnå den maksimale mængde af ren materiale.
    Forsigtig: Brug det relevante sikkerhedsudstyr (dvs., laboratoriekittel, isolerede handsker og en ansigtsskærm) Hvornår håndtering kryogene væsker.
  8. Analysere HPLC-fraktioner af electro-spray ionisering massespektrometri (ESI-MS, autosampler, injiceres 10 µL, flow 0,6 mL/min., opløsningsmiddel: 20% B ingen kolonne i henviser til instruktionerne fra producenten til instrument skik) og UPLC (gradient fra 10% til 90% opløsningsmiddel B i A for 0,25 til 3 min, 10% B for 1 min, henvises til vejledningen fra producenten til instrument skik). Pool brøkdele af lignende renhed i 50 mL plasticrør, fryse i flydende nitrogen og lyophilize. Vejer og overføre den frysetørrede proteiner til 2 mL plasticrør og opbevares ved-20 ° C.
  9. Karakterisere det oprensede materiale ved UPLC, ESI-MS og SDS-PAGE. Opløs 100 µg af frysetørret Httex1 i 8 µL af pæn TFA i 1,5 mL rør og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur i lukket reagensglas. Omhyggeligt fordampe TFA under et stinkskab med en strøm af nitrogen eller argon. Brug lavt tryk af kvælstof/argon for at undgå tab af prøven.
    1. Opløs proteinet i 100 µL af H2O. analysere 2 µL af UPLC og 5 µL af ESI-MS som i trin 3.8. Mix 20 µL af protein løsning med 20 µL af 2 x lastning farvestof.
    2. Analysere beløb af 1 µg til 10 µg af SDS-PAGE. Køre gel i 90 min ved 180 V. pletten gel med Coomassie farvning efter instrukser fra fabrikanten. Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 2D.

4. opdeling og Resolubilization af Httex1 proteiner

Forsigtig: TFA er en flygtig væske og kan forårsage alvorlige forbrændinger så håndterer med omhu. Udføre alle håndtering i et stinkskab og bære passende personlige værnemidler (dvs. engangs nitrilhandsker, sikkerhedsbriller og en lab coat).

  1. Forberede 10 mL af Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) fra forblandet pulveret i en 50 mL tube. DPBS Opløsningen filtreres gennem et 0,2 µm filter før hver brug.
  2. Opløse 150 µg af frysetørret Httex1 i 12 µL af pæn TFA i 1,5 mL rør og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur i lukket reagensglas. Omhyggeligt fordampe TFA under et stinkskab med en strøm af nitrogen eller argon. Brug lavt tryk af kvælstof/argon for at undgå tab af prøven38.
    Bemærk: generelt bruge 4 µL TFA opløses og disaggregate 50 µg af protein. Denne fremgangsmåde vil skabe en film af protein på indvendigt vægge af prøverøret. For at forhindre umiddelbar sammenlægning af Httex1 i de følgende trin, arbejde med pre afkølede buffere, holde protein altid på is og undgå høje koncentrationer.
  3. Opløse den disaggregerede protein i 1 mL af pre afkølede DPBS og ph indstilles til 7.2-7.4 med 1 M NaOH. Filtreres opløsningen protein gennem en 100 kDa centrifugal filter i 1,5 mL plasticrør (20000. x g, 4 ° C, 20 minutter).
    Bemærk: Den beregnede teoretiske koncentration af Httex1 er højere end den ønskede slutkoncentration at tage højde for eventuelle tab. Filtrering skridt er nødvendige for at fjerne enhver aggregater, der kan have dannet i løbet opløsning af proteinet.
  4. Bestemme den koncentration af Httex1 ved hjælp af en UPLC kalibreringskurve baseret på amino syre analysis (påvisning ved λ214) og sende 2 µg af protein til aminosyre analyse at validere koncentration10. Beregningen af DPBS, der skal tilføjes til at opnå en koncentration af 3 µM Httex1.
  5. Fortynd protein til 3 µM ved at tilføje det beregnede beløb for DPBS til reagensglas. Hold røret på is indtil indledningen af aggregation protocol.
    Bemærk: Httex1 43Q ikke bør opbevares i løsning. Altid udarbejde en frisk protein løsning baseret på ovenstående-protokollen. Httex1 proteiner opbevares bedst som et frysetørret pulver ved-20 ° C.

5. overvågning af den sammenlægning kinetik af Httex1 43Q ved hjælp af UPLC og cirkulære Dichroism (CD) spektroskopi og karakterisering af aggregater af transmissions elektronmikroskopi (TEM)

  1. Forberede uranyl formate løsning for TEM som tidligere rapporteret39.
  2. Indlede en sammenlægning af Httex1 43Q ved at inkubere 3 µM opløsning i DPBS ved 37 ° C (brug 1 mL af opløsning forberedt som beskrevet ovenfor i opdeling protokol).
    Bemærk: Sammenlægning af Httex1 kan udføres ved højere koncentrationer afhængigt af behov og mål for eksperimentet.
  3. Kvantificere mængden af opløseligt protein ved hjælp af UPLC på angivne tidspunkter (på 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 og 120 h). At gøre det, tage en alikvot af 35 µL og fjerne de uopløselige aggregater ved centrifugering (20000 x g, 4 ° C, 20 min). Tilføre UPLC 4 µL af supernatanten. Beregn andelen af opløselige monomer baseret på ændring af toparealet bruger instrument software 40. Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 3A.
  4. Karakterisere ændringer i sekundær struktur ved hjælp af CD spektroskopi 0 og 48 timer. Tage en alikvot af 100 µL og måle ellipticity (1 mm kvarts kuvette, 195 nm til 250 nm, 20 ° C, data peger hver 0,2 nm, hastighed 10 nm/min, digital integration tid 2 s, båndbredde på 1,0 nm). Erhverve 6 spektre af prøve- og gennemsnit og glat ved hjælp af en binomial filter med foldning bredde på 99. Plot spektre som gennemsnitlig rest kindtand ellipticity (θMRE)41. Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 3B.
  5. Karakterisere den strukturelle og morfologiske egenskaber af aggregater af TEM. Sætte 3 µL af opløsningen protein på en Formvar/carbon-belagt 200 mesh-, glød-udledes kobber gitter i 1 min. Skyl gitter to gange med 15 μl vand, én gang med 15 μl af 0,7% (w/v) uranyl formate og pletten for 30 s med 15 μl af 0,7% w/v uranyl formate. Udføre en TEM analyse af nettene. Sammenlign resultaterne med repræsentative resultater i figur 3C.

Representative Results

Httex1 udtrykkes i E. coli med en N-terminale hans6-SUMO tag. De repræsentative resultater af den proteinekspression og -oprensning af fusion protein er sammenfattet i figur 1. Sekvensen af Httex1 består af restkoncentrationer 2-90 af Htt og starter med Ala2, fordi Met1 er fuldt kløvet i vivo42. Nummereringen af aminosyrerne refererer til 23Q varianten, den fuldstændige sekvens af udtrykt fusion protein er vist i figur 1A. Plasmider vil blive deponeret på Addgene i den nærmeste fremtid skal deles med Fællesskabet. En skematisk af plasmidet og udtrykte fusion protein er vist i figur 1B. His6-SUMO Httex1 udtrykker på en medium niveau (figur 1C) og de fleste af fusion protein er til stede i den vandopløselige fraktion efter lysis, både for 23Q og 43Q varianten. Fusion protein trækker højere end forventet, baseret på Molekylær vægt. Dette er delvis på grund af den stærke fold af SUMO, men for det meste på grund af den usædvanlige sekvens sammensætning af Httex1, der indeholder hovedsagelig glutamin og prolin rester. Både vildtype (23Q) og muterede (43Q) fusion protein kan blive beriget til ~ 80% renhed af IMAC (fig. 1D) tilstedeværelsen af co rensende vært protein kan forklares ved forholdsvis lave udtryk niveau af Httex1 og den store prøve volumen anvendes til kolonnen.

Kløvningen af hans6-SUMO tag og rensning af Httex1 er vist i figur 2A. UPLC er et effektivt redskab til at overvåge kløvningen af hans6-SUMO tag (figur 2B). Den oprindelige peak fusion protein der forbruges og to nye og vel adskilte toppe svarer hans6-SUMO tag og Httex1 vises. Kavalergang reaktion er færdig i 10-20 min. Den vestlige duppes (WB) er for langsom til at overvåge kavalergang reaktion effektivt, men det er medtaget i figur til reference og påvise fuldstændigheden af SUMO kavalergang. Begge Httex1 23Q og 43Q kan adskilles godt fra hans6-SUMO tag af RP-HPLC (figur 2C) og blev fremstillet i høj renhed, som det fremgår af UPLC, MS og SDS-PAGE analyse (figur 2D).

For at illustrere at Httex1 proteiner udarbejdet af denne metode bevarer egenskaberne forventede sammenlægning af Httex1, vi vurderet fibrillization kinetik af mutant Httex1 ved 37 ° C af en bundfældning assay, overvåges ændringer i sekundær struktur af CD spektroskopi, og karakteriseret morfologi af aggregater af TEM. En repræsentative datasæt af sammenlægning kinetik af mHttex1 fibril formation som bestemt ved en bundfældning assay er vist ifig. 3A. Tabet af opløselige Httex1 43Q over tid, på grund af fibril formation blev kvantificeres ved UPLC. Vi observerer en fuldstændig udtømning af opløseligt protein efter 48 timers inkubation. Derudover bestemt vi sekundær struktur af proteiner af CD spektroskopi (fig. 3B). Httex1 43Q Skift fra ustrukturerede (λmin 205 nm) til primært β-plade rige kropsbygning (λmin 215 nm) efter 48 timers inkubation. Denne strukturændring er ledsaget af dannelsen af lange fibrillar aggregater som observerbare af TEM på 48 timer (figur 3C).

Figure 1
Figur 1 . Proteinekspression og -oprensning af hans6-SUMO Httex1 fusion protein. 
(A) aminosyresekvens af hans6-SUMO-Httex1-QN fusion konstruktioner (hans6-SUMO i grøn og Httex1-QN i orange); (B) skematisk oversigt over de proteinekspression og -oprensning af fusion protein; (C) SDS-PAGE analyse af udtrykket og opløseligheden af fusion protein efter lysis; (D) kromatogram af IMAC rensning af fusion protein og analyse af fraktioner af SDS-PAGE (rød bar: ubundne fraktion, blå bar: vask brøkdel, sorte bjælke: fraktioner der indeholder eluering peak); Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Spaltning af hans6 SUMO tag og rensning af tag-gratis Httex1-QN proteiner.
(A) skematisk oversigt; (B) analyse af kløvningen af SUMO tag med ULP1 af UPLC (blå: før tilsætning af ULP1; sort: 20 min (23Q), henholdsvis 10 min (43Q) efter tilsætning af ULP1) og WB (MAB5492 1: 2000, sekundære ged anti mus antistof 1:5000); (C) kromatogram af forberedende RP-HPLC rensning af Httex1; D: analyse af de oprensede Httex1 af UPLC, SDS-PAGE og ESI-MS; den forventede molekylvægt er 9943 Da (23Q) og 12506 Da (43Q) henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Sammenlægning af Httex1-43Q: (A) sedimentering analysen baseret på UPLC. (B) CD spektre af sekundær struktur på 0 h og 48 h. (C) TEM micrographs af aggregater på 48 h (skala barer er 200 nm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne protokol, vi har skitseret en effektiv procedure for indsamling milligram mængder af indfødte, umærkede Httex1 der indeholder 23 eller 43 glutamin rester. Dette blev opnået ved at udtrykke Httex1 som en C-terminale fusion til en hans6-SUMO tag, som bruges til at isolere fusion protein fra cellen lysate af IMAC og er kløvet før HPLC rensning af Httex1. Mens SUMO strategien er blevet brugt i produktionen af flere andre proteiner, viser vores metode, at de unikke egenskaber SUMO kunne også bruges til at generere uløseligt uordnede, sammenlægning-liggende, amyloidogenic protein, der tidligere har vist sig at være yderst vanskeligt at håndtere og producere43,44. Vi præsenterer en protokol, der er ligetil, let at bruge og kan sammenlignes med en protokol for generation af en "velopdragne" protein. SUMO fusion solubilizes og stabiliserer Httex1 under udtryk og IMAC rensning trin. Tidlig kløvningen af tag, som observeres med intein strategi10 og sammenlægning ikke længere et problem.

Uløseligt uordnede proteiner er særligt udsatte for nedbrydning. Mens N-terminale nedbrydning i regionen N17 ikke er et problem, der bruger denne protokol, kan udeladelser i PRD Httex1 forekomme. Som de afkortede proteiner er meget lig Httex1 i hydrophobicity, beregning og størrelse, at fjerne dem ved kromatografisk midler er udfordrende, derfor er det bedst at forhindre deres dannelse i første omgang. Holder sig tæt til protokollen, bør altid arbejder på is og ved hjælp af en tilstrækkelig mængde af protease hæmmer hjælpe med at holde niveauet af observerede trunkering meget lav. Anvende en fusion tag fra C-endepunktet for Httex1 kunne fjerne udeladelser i PRD let som den afkortede protein ville miste koden affinitet. Men hvis de indfødte sekvens skal fastholdes denne indstilling ikke kan anvendes som Httex1 ender med prolin og til bedste af vores viden der er ingen C-terminale fusion tags, der er kendt for at inducere traceless og effektiv kavalergang efter prolin.

Den mest kritiske del af protokollen er håndteringen af Httex1 befriet efter spaltning af SUMO tag af ULP1. Protein bør renses straks af RP-HPLC. Heldigvis, dette er en effektiv og hurtig reaktion, der er normalt udført i 10-20 min. ved 4 ° C. Derimod intein strategi kræves flere timer til fuldstændig spaltning af intein, hvilket kræver en afvejning mellem ufuldstændige kavalergang og begyndelsen sammenlægning for at maksimere udbyttet. En hurtig workup er påkrævet for mutant Httex1, som det vil begynde at samle på den relativt høje koncentration i kavalergang reaktion, der henviser til, at 23Q varianten er stabile i længere tid. Under RP-HPLC rensning, en anden fordel ved SUMO bliver tilsyneladende: mens Ssp DnaB intein er hydrofobe og stikker stærkt til kolonnen, SUMO er mere hydrofil og eluerer helt fra C4 omvendt-fase kolonne. Selv om kommercielle ULP1 er ganske dyrt, kan proteinet fremstilles nemt i højt udbytte efter tidligere publicerede protokoller29.

Den afgørende betydning af at anvende en opdeling protokol før ved hjælp af Httex1 kan ikke understreges nok. Frysetørret polyQ proteiner som Httex1 er stabil og kan være gemt lange perioder, men er ikke helt opløseligt i vand og buffere. Tilstedeværelsen af præfabrikerede oligomerer eller fibriller kunne have en betydelig indvirkning på sammenlægning kinetik og Biofysisk egenskaber af protein45. Opdeling protokollen beskrevet her tillader opdeling af proteiner, fjernelse af præfabrikerede aggregater og generering af en opløsning af monomere Httex1 fra et frysetørret prøve. Vi observeret lignende sammenlægning kinetik og fibril morfologi for Httex1 fremstillet med SUMO og intein strategi.

I forhold til tidligere metoder til at producere Httex1, SUMO strategi beskrevet her giver flere fordele og udvider vifte af mulige undersøgelser at undersøge strukturen og funktionelle egenskaber af dette protein i sundhed og sygdom. SUMO-Httex1 fusion protein er let at håndtere, det kan frosne og gemt eller holdes i løsning i 24 timer ved stuetemperatur, mens den gratis mHttex1 ville samle hurtigt. Stabilitet og høj opløselighed af SUMO-Httex1 fusion proteiner giver større fleksibilitet for at manipulere proteinet og/eller indføre enzymatiske og kemiske ændringer i mHttex1, der ellers ikke ville være muligt efter kavalergang. Dette omfatter indførelsen af posttranslationelle modifikationer, fluorophores, spin etiketter, biotin tags m.m. de forskud, der præsenteres her bør 1) lette fremtidige undersøgelser for at belyse struktur-funktion relationer i Httex1; 2) generere nye værktøjer til at undersøge Htt sammenlægning og patologi udbredelse; 3) muliggør udvikling af nye assays til at identificere molekyler, som kan stabilisere mutant Httex1 og forhindre dens sammenlægning; og 4) tilskynde forskere fra andre felter til at bringe til at arbejde på dette protein og deltage i vores søgen efter at finde behandlinger for Huntington's chorea.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har nogen interessekonflikter med indholdet af denne artikel.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret primært ved tilskud fra CHDI-fonden og den schweiziske National Science Foundation. Vi takker Dr. Sophie Vieweg for nyttige diskussioner under udviklingen af dette nye udtryk og andre medlemmer af gruppen Lashuel for at dele deres erfaringer med dette udtryk system og for deres input og værdifuld feedback. Vi takker også Prof. Oliver Hantschel give ULP1 plasmid. Forfatterne takke Dr. John B. Warner og Dr. Senthil K. Thangaraj til kritisk gennemgang af håndskriftet

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) EMS 22450
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids EMS FCF200-Cu-50
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics HellmaAnalytics 110-1-40
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA Witech SVA4730203
Ampicillin AxonLab A0839.0100
Luria Broth (Miller's LB Broth)  Chemie Brunschwig 1551.05
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) AxonLab A1008.0025
E. coli B ER2566 NEB NEB# E4130
Imidazole Sigma 56750-500G
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 Merck Millipore Corporation MAB5492
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) Licor 925-68070
PMSF AxonLab A0999.0005
HisPrep 16/10 column  GE Healthcare 28936551
C4 HPLC column Phenomenex 00G-4168.P0     10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed
Acetonitrile HPLC MachereyNagel C2502
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile Sarstedt AG 83.1826
Spectrophotometer semi-micro cuvette Reactolab S.A. 2534
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml GE Healthcare 18111382
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml Greiner Bio-One 7.160 102
 100 kD Microcon  fast flow filters Merck Millipore Corporation MRCF0R100
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor Sonics
Äkta 900 equipped with a fraction collector  GE Healthcare
Jasco J-815 Circular Dichroism Jasco
Waters UPLC system  Waters C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column  , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL
waters HPLC system Waters 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing
ESI-MS: Finnigan LTQ Thermo Fisher Scientific
lyophylizer instrument FreeZone 2.5 Plus
Tecnai Spirit BioTWIN  FEI electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV
37 °C shaking  incubator Infors HT multitron Standard
Biophotometer plus Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saudou, F., Humbert, S. The Biology of Huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  2. MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. Huntington's disease. Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).
  3. Li, S., Li, X. J. Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease. Molecular Neurodegeneration. 1, 19 (2006).
  4. DiFiglia, M. Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  5. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  6. Sathasivam, K., et al. Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).
  7. Mangiarini, L., et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell. 87 (3), 493-506 (1996).
  8. El-Daher, M. T., et al. Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation. EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).
  9. Lunkes, A., et al. Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).
  10. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  11. Georgalis, Y., et al. Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).
  12. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  13. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  14. Muchowski, P. J., et al. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).
  15. Heiser, V., et al. Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).
  16. Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation. Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).
  17. Tam, S., et al. The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).
  18. Nekooki-Machida, Y., et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).
  19. Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).
  20. Legleiter, J., et al. Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).
  21. Legleiter, J., et al. Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).
  22. Nucifora, L. G., et al. Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).
  23. Dahlgren, P. R., et al. Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation. Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).
  24. Poirier, M. A., et al. Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).
  25. Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy. Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).
  26. Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells. Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).
  27. Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation. Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).
  28. Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils. Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).
  29. Malakhov, M. P., et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).
  30. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  31. Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility. Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).
  32. Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System. Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).
  33. Reif, A., et al. Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6. Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).
  34. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  35. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).
  36. Lawrence, A. M., Besir, H. U. Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  37. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  38. Chen, S. M., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
  39. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  40. O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).
  41. Greenfield, N. J. Analysis of circular dichroism data. Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).
  42. Aiken, C. T., et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).
  43. Satakarni, M., Curtis, R. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).
  44. Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin. Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).
  45. Chen, S., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).

Tags

Biokemi sag 136 HD Huntington's chorea huntingtin neurodegeneration polyglutamin polyQ sammenlægning fibriller SUMO fusionsteknologi protein proteinekspression og -oprensning
Generation af indfødte, ukodede Huntingtin Exon1 monomere og fibriller ved hjælp af en SUMO Fusion strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J.,… More

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J., Lashuel, H. A. Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy. J. Vis. Exp. (136), e57506, doi:10.3791/57506 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter