Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Generasjon av innfødte, ukodede Huntingtin Exon1 Monomer og Fibrils bruker en SUMO Fusion strategi

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular and Chemical Biology of Neurodegeneration, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Her presenterer vi en robust og optimalisert protokoll for produksjon av mg mengder innfødt, koden-ledig monomerer og fibrils av exon1 av Huntingtin protein (Httex1) basert på forbigående fusjon av små ubiquitin relaterte modifikator (SUMO).

Abstract

Huntingtons sykdom (HD) er en arvelig dødelig nevrodegenerative sykdommer forårsaket av en CAG ekspansjon (≥36) i den første ekson av HD genet, gir uttrykk for Huntingtin protein (Htt) eller N-terminal fragmenter av med en utvidet polyglutamine ( polyQ) strekk.

Exon1 av Huntingtin protein (Httex1) er det minste Htt fragmentet som viser mange av funksjonene i HD i mobilnettet og dyr modeller og er en av de mest studerte fragmentene av Htt. Den lille størrelsen på Httex1 gjør det eksperimentelt mer mottakelig for Biofysiske karakterisering ved hjelp av standard og høy oppløsning teknikker i forhold til lengre fragmenter eller full lengde Htt. Men har høy aggregering tilbøyelighet av mutant Httex1 (mHttex1) med økt polyQ innhold (≥42) gjort det vanskelig å utvikle effektive uttrykk og rensing systemer for å produsere disse proteinene i tilstrekkelige mengder og gjøre dem tilgjengelig for forskere fra ulike disipliner uten bruk av fusion proteiner eller andre strategier som forandre innfødt sekvensen av protein. Vi presenterer her en robust og optimalisert metode for produksjon av mg mengder innfødt, koden-ledig Httex1 basert på forbigående fusjon av små ubiquitin relaterte modifikator (SUMO). Enkelhet og effektivitet av strategien vil eliminere behovet for å bruke ikke-native sekvenser av Httex1, dermed gjør dette proteinet mer tilgjengelig for forskere og forbedre reproduserbarhet eksperimenter over forskjellige laboratorier. Vi tror at disse fremskritt vil også lette fremtidige studier Klargjørende struktur-funksjon forholdet mellom Htt samt utvikle nye diagnostiske verktøy og terapi for å behandle eller langsom progresjonen av HD.

Introduction

Htt er et 348 kDa protein, og har vært innblandet i flere fysiologiske funksjoner1. Når Htt inneholder en utvidet polyQ region i mer enn 36 rester i sin N-terminus, fører det til HD2,3. HD patologi er preget av mobilnettet Inneslutninger i striatum og cortex, som fører til nevronale død og atrofi av berørte vev4,5. Flere N-terminal Htt fragmenter som inneholder den polyQ gjentatte tarmkanalen påvist i obduksjon hjernen fra HD pasienter og antas genereres av proteolytisk behandling av huntingtin protein6. Nyere studier tyder på at Httex1 kan også dannes på grunn av avvikende mRNA skjøting. Httex1 inneholder patologisk polyQ mutasjon, og dens overuttrykte i dyr kan recapitulate mange av de viktigste funksjonene i HD7, utheving dermed en mulig sentral rolle i denne fragment i HD patologi og sykdom progresjon6, 8,9.

På grunn av høy aggregering tilbøyelighet av mutant Httex1 (mHttex1) med utvidet polyQ skrift, fleste eksisterende uttrykk systemer er basert på forbigående fusjon av Httex1 proteiner (for eksempel glutathione-S-transferase (GST), thioredoxin (TRX) eller maltose-binding-protein (MBP) og/eller peptider (poly-histidin) som ulikt forbedre sitt uttrykk, stabilitet, rensing eller løselighet10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,,24,,25,,26,,27,,28. Fusion partneren er koblet til Httex1 med en kort sekvens som inneholder en cleavage nettsted for proteaser som trypsin, tobakk etse virus (TEV) protease eller PreScission for cleavage og utgivelsen av Httex1 før oppstart av aggregering eller rensing. Mangler disse metodene omfatter muligheten for ytterligere rester på grunn av ikke-traceless cleavage og etableringen av avkortet på grunn av miscleavage i en rekke Httex1, i tillegg til heterogenitet skyldes ufullstendig cleavage ( se Vieweg et al. for mer dyptgående diskusjon om fordeler og begrensninger av denne tilnærmingen)10. For å løse disse begrensningene, utviklet vi nylig en uttrykk strategi aktiverer generering av kode-free opprinnelige Httex1 for første gang ved å benytte en forbigående N-terminal blanding av Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein Httex110. Mens intein cleavage er traceless og bestemt og gir mg mengde proteiner, det fortsatt lider to ulemper kan redusere avkastningen: nemlig tidlig spalting av intein som kan oppstå under uttrykket, og det faktum at cleavage skjer over flere timer, som kan føre til tap av protein på grunn av aggregering, spesielt for Httex1 med utvidet polyQ gjentas.

Håndtere disse begrensningene og fornye vår strategi for produksjon av innfødte, koden-ledig Httex1, vi utviklet et nytt uttrykk system basert på forbigående fusjon av SUMO, mer nøyaktig den gjær homolog Smt3 til Httex1. Bruk av SUMO systemet for produksjon av rekombinante proteinene ble først publisert i 200429, hvor økt hastighet på uttrykk og løslighet SUMO fusion protein ble demonstrert. SUMO koden kan være kløyvde av ubiquitin som protein-spesifikke protease 1 (ULP1), som ikke krever en anerkjennelse webområdet, men gjenkjenner tertiær strukturen i SUMO og praktisk talt eliminerer muligheten av miscleavage30. Videre ULP1-mediert cleavage er rask og traceless og la ikke ekstra rester. I tidlig spalting av fusion koden, unngås som observert med autocatalytic intein10, helt av kravet om en ekstern protease. Mens SUMO strategien er nå mye brukt for rekombinante proteiner produksjon31,32,33, viser vi i dette papiret at det er spesielt nyttig for generering av en egentlig uordnede, aggregering utsatt, amyloidogenic protein som Httex1. Vi mener at enkelhet, effektivitet og robusthet av vår SUMO-fusion-basert metode vil gjøre innfødt, koden-ledig Httex1 mer tilgjengelig for forskere fra ulike disipliner og eliminere behovet for å bruke ikke-native sekvenser av Httex1 i vitro . Dette er et viktig fremskritt som vil lette fremtidige studier for å belyse struktur-funksjon forholdet mellom Httex1.

Protokollen beskriver rensing av Httex1 fra 12 L bakteriell kultur, men protokollen kan lett tilpasses for mindre eller større skala produksjoner. Protokollen beskriver produksjon av vill-type Httex1 (wtHttex1) med en polyQ gjenta lengde nedenfor (23Q) og mutant Httex1 (mHttex1) med en polyQ gjenta lengde over (43Q) patogene terskelen (36Q).

Protocol

1. uttrykket av rekombinant Httex1 23Q og 43Q

  1. Forbered nødvendig bufferne og løsninger. Forberede 1000 x ampicillin (AMP, 100 mg/mL) lagerløsning, filter (0,2 µm), aliquot og butikken på 20 ° C. Forberede lysogeny kjøttkraft (LB) medium (25 g LB Miller per 1 L H2O), autoclave. Forberede 1 M Isopropyl ß-D-1thiogalactopyranoside (IPTG) lagerløsning, filter (0,2 µm), aliquot og butikken på 20 ° C.
  2. Transformere kjemiske kompetent E. coli B ER 2566 med en pTWIN1 vektor, inneholder menneskelige Httex1 smeltet til en N-terminal His6-SUMO-kode med varme sjokk metoden34.
    Merk: E. coli BL21 DE3 belastning har også blitt brukt. Men ble i dette tilfellet en økt mengde av truncations observert.
  3. Vaksinere 200 mL LB mellomstore med 1 x forsterker i en 1 L konisk kolbe ved å legge til en enkelt koloni fra agar plate med sterilt pipette tips. Inkuber kulturen på 30 ° C og 180 rpm for 20 h (overnatting) i en bakteriell inkubator.
  4. Ta en 1 mL prøve kultur med en bakteriefri pipette. Måle optisk densitet ved 600 nm (OD600) av utvalget med engangs plast søppel og et fotometer (respekt målingen varierer mellom 0,1 og 1, fortynnet med LB-medium hvis nødvendig). Beregne mengden preculture som fører til en start OD600 av 0,05 i en 3 L kultur (med en preculture OD600 = 3 som vil bety 50 mL).
  5. Vaksinere fire kulturer (hver 3 L LB-medium med 1 x forsterker i en 5 L kolbe), ved å legge til beregnede mengden preculture med en bakteriefri pipette. Inkuber kulturer på 37 ° C og 180 rpm i en bakteriell inkubator.
  6. Enhver 30 min, ta en 1 mL prøve kultur med en bakteriefri pipette. Måle OD600 av utvalget med engangs plast søppel og et fotometer. Når OD600 har nådd 0,1 (vanligvis etter 1-2 h), Still inn temperaturen av bakteriell inkubator 14 ° c og fortsette inkubasjon mens nedkjøling. Enhver 30 min, ta en 1 mL prøve kultur med en bakteriefri pipette. Måle OD600 av utvalget med engangs plast søppel og et fotometer.
    Merk: Tiden å kjøle kulturer kan variere med inkubator brukes, så på tide å begynne kjøling kan tilpasses avhengig av inkubator brukes. Endre temperaturgradient bør imidlertid bare har en liten innvirkning på avkastningen som SUMO fusion protein synes å være ganske stabilt.
  7. Når OD600 har nådd 0.3-0,4 (vanligvis etter 1-2 h), ta en pre induksjon prøve kultur for SDS side analyse av overuttrykte. Beregne størrelsen på utvalget som gir en tilsvarende mengde celler og et godt signal på Coomassie farget SDS side: For en 10 godt gel: volum = 0,2 mL/OD600; ta halvparten for en 15 godt gel.
    1. For en bakteriell kultur med et OD600= 0,4, ta 500 µL. Ta den beregnede mengden bakteriell kultur med en bakteriefri pipette. Nedspinning prøven (18000 x g, 4 ° C, 2 min) og kast nedbryting. Hold pellet på 20 ° C til klar til bruk for analyse (trinn 1,11).
  8. Indusere protein uttrykk av pipettering 1,2 mL på 1 M IPTG lager løsning til hver 3 L kultur løsning (siste konsentrasjon 0.4 mM). Fortsette rugende kulturen ved 14 ° C i 16 h (overnatting).
    Merk: Temperaturen vil vanligvis har nådd ~ 20 ° C når IPTG legges, avhengig av av inkubator.
  9. Ta en post induksjon prøve kultur for SDS side analyse av overuttrykte, etter fremgangsmåten i trinn 1.7.
  10. Høste celler med sentrifugering i 1 L rør (3993 x g, 4 ° C, 10 min). Forkaste nedbryting, holde celle pellet på is og gå direkte til rensing.
  11. Analysere overuttrykte ved SDS-side35,36. Resuspend før og etter induksjon prøvene i 20 µL kjøre buffer og 20 µL av 2 x lasting fargestoff. Varme prøvene i 5 min på 95 ° C i en varme blokk og laste 20 µL på en 15% gel mens de fortsatt varme. Kjør gel for 90 min på 180 V. flekken gel med Coomassie farge i henhold til instruksjonene fra produsenten. Sammenligne representant resultater i figur 1C.
    Merk: Protokollen kan stoppes her, celle-pellets kan være frosset og lagret på-80 ° C i flere uker. For optimale resultater anbefales det å bruke fersk bakteriell pellets og unngå frysing. Fryse-Tin kan føre til lysis av celler og nedbrytning av Httex1. Dette kan redusere avkastningen og kvaliteten på protein.

2. celle Lysis og rensing av hans6-SUMO Httex1 Fusion Protein immobilisert av metall affinitet kromatografi (IMAC)

  1. Forberede 2 L bufferen A i ett glassflaske (50 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 500 mM NaCl, 15 mM imidazole). Forberede 1 L buffer B (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole pH 7.4) i ett glassflaske. Etter oppløsende salter, justere pH med 10 N HCl og filtrere løsningene i frisk flasker med en flaske topp filter (0,65 µm). Forberede en 1000 x phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF, 0,3 M) lagerløsning, aliquot 100 µL og butikk på 20 ° C.
    Merk: Protokollen er utformet slik at fullfører alle trinnene fra lysis av bakteriell pellets reverseres-fase høy ytelse flytende kromatografi (RP-HPLC) rensing og lyophilization innen 8-9 timer. For å begrense aggregering og proteolyse, anbefales det å arbeide raskt uten pause og utføre alle skritt 4 ° C eller is.
  2. Legg 100 µL PMSF lagerløsning og fem tabletter (1 per 30 mL av siste volum) av protease hemmer til 100 mL pre kjølt buffer A. Legg det bakterielle pellet til bufferen og homogenize suspensjon omrøring med magnetic røre bar og pipettering opp og ned wi th en steril 10 mL pipette (~ 30 min).
  3. Del bakterier suspensjon i dele 40 mL i 50 mL engangs plast rør. Sonicate hver aliquot i en vann-is bunke for cellen lysis (70% amplitude, total sonication tid 5 min, intervaller på 30 s sonication, 30 s pause).
    Merk: Det er viktig at prøven ikke varme opp under det sonication trinnet. Det anbefales å legge litt vann til isbadet å forbedre varmespredning under sonication. Sonication prosedyren må kanskje tilpasses hvis et annet instrument brukes. Andre lysis metoder som en fransk trykk eller en microfluidizer skal fungere også og kan være fordelaktig å unngå oppvarming av prøven og protein aggregering. Disse enhetene var ikke tilgjengelig i vårt laboratorium og vi fikk gode resultater med våre sonication-protokollen.
  4. Ta en prøve av 50 µL av lysate for natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) analyse. Sentrifuge prøven (18000 x g, 4 ° C, 2 min) og Pipetter løselig brøken i en ny reagensrør. Resuspend uløselig brøken i 50 µL av buffer A med en pipette. Holde prøvene på is inntil SDS-side analyse (trinn 2.6).
  5. Avklare den lysate med sentrifugering (39191 x g, 4 ° C, 60 minutter).
  6. Under det sentrifugering trinnet, analysere den celle lysis trinnvise SDS-side. Legge til 50 µL av 2 x lasting fargestoff til løselig og uløselig brøkdel av den lysate henholdsvis. Varme i 5 min på 95 ° C og laste 2 µL på en 15% gel mens de fortsatt varme. Kjør gel for 90 min på 180 V. flekken gel med Coomassie farge i henhold til instruksjonene fra produsenten. Sammenligne representant resultater i figur 1C.
  7. Filtrere nedbryting (0,45 µm, sprøyte filtre). Ta en prøve av 20 µL av filtrerte nedbryting for SDS side analyse (trinn 2.11).
    Merk: Vanligvis et volum på 90 til 100 mL klarlagt og filtrert nedbryting er oppnådd. 3 sprøyte filtre er vanligvis tilstrekkelig. Hvis for filtrering er tungvint, kan du prøve å øke sentrifugering hastighet og/eller klokkeslettet.
  8. Isolere His6-SUMO Httex1 fusion protein fra avklart bakteriell lysate ved immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC) på en rask ytelse flytende kromatografi (FPLC) system på 4 ° C37.
    1. Fyll den avklart lysate i en superloop og Last på Ni-NTA kolonnen (strippet, renset og på nytt i henhold til veiledningen av produsenten, en tidligere tom kjøre anbefales) med 2 mL/min. passerer 10 kolonnen volum (CV, 200 mL) bufferen A på 10 mL/min å vaske ut ubundet proteiner.
    2. Elute fusion protein med 2.5 CV (50 mL) på 100% av buffer B ved 2 mL/min. bruker en brøkdel størrelse 50 mL for lasting og vask og 5 mL for elueringsrør. Sammenligne representant resultater i figur 1D.
  9. Ta en prøve av hver fraksjon for SDS side analyse (20 µL) og basseng fraksjoner som inneholder fusion protein etter toppen av IMAC-chromatogram. Legg (2S, 3S) - ble 1,4 - Bis (sulfanyl) butan-2,3-diol (DTT) og L-cystein (siste konsentrasjon 100 mM) som pulver og oppløses av forsiktig invertere røret.
    Merk: I vår erfaring renheten av fusion proteinet i forskjellige fraksjoner er sammenlignbare. Som forsiktighetsregel, skal fraksjoner av renset fusion proteinet samordnes raskt etter IMAC å hindre samling av svært konsentrert fraksjoner. I tillegg er det anbefalt å gå direkte til spalting av SUMO tag og HPLC rensing. Om nødvendig kan protokollen stoppes her. Utvannet løsningen av fusion protein var frosset i flytende nitrogen, lagret på-80 ° C og renset etter tining uten en betydelig reduksjon i avkastning. Lagring av utvannet løsningen av fusion protein ved 4 ° C i 24 h gir også lignende resultater.
  10. Analysere IMAC SDS-side. Legge til 20 µL av lasting fargestoff til hvert utvalg. Legg 2 µL av rå materialet (2.7), ubundet brøkdel, vask brøken og hver fraksjon av elueringsrør toppen på en 15% gel. Kjør gel for 90 min på 180 V. flekken gel med Coomassie farge i henhold til instruksjonene fra produsenten. Sammenligne representant resultater i figur 1D.

3. spalting av hans6-SUMO-koden og HPLC rensing

Forsiktig: Trifluoroacetic syre (TFA) er en flyktig væske og kan forårsake alvorlige forbrenninger så håndteres med forsiktighet. Utføre alle håndtering i avtrekksvifte og ha tilstrekkelig personlig verneutstyr (dvs., disponibel nitrilhansker, vernebriller og en labfrakk).

  1. I en 5 L flasken, legge til 5 mL TFA med en plastsprøyte 5 L vann (løsemiddel A: H2O, 0,1% (TFA). Legge til 2,5 mL TFA med en plastsprøyte en 2.5 L flaske acetonitrile (løsemiddel B: acetonitrile, 0,1% TFA).
  2. Forberede HPLC systemet som foreslått av produsenten. Utføre en tom kjøre for å sikre en ren kolonne.
  3. Ta en prøve av 100 µL av fusion protein før en ULP1 overvåke cleavage reaksjonen av UPLC (trinn 3,5).
  4. Overføre 20 mL fusion protein til en ny 50 mL tube og legge 0,4 mL ULP1 lagerløsning, ruge på is. Holde gjenværende fusion protein på is.
    Merk: Hans-merket katalytisk fragmentet 403-621 av Ubiquitin-lignende-spesifikk protease 1 (her referert til som "ULP1") ble brukt deler SUMO koden. Fusion protein er mer stabil enn den cleaved Httex1. Det anbefales ikke å holde seg SUMO koden for satsvis. I stedet fortsette med dele en størrelse som kan direkte og helt brukes til kolonnen HPLC.
  5. 10 minutter, ta en prøve av 100 µL av cleavage reaksjonen å overvåke fremdriften av ultra ytelse flytende kromatografi (UPLC). Sentrifuge prøvene (18000 rpm, 4 ° C, 2 min) og analysere 2 µL av nedbryting av UPLC (gradering fra 10% til 90% løsemiddel B i A for 0,25 til 3 minutter, 10% B for 1 min, se instruksjonene fra produsenten for instrumentet bruk). Sammenligne chromatograms innhentet for prøven før tillegg av ULP1 og prøver tatt. Sammenligne resultatene med representant resultater i figur 2B.
  6. Når SUMO-cleavage er fullført (toppen av fusion protein har forsvunnet i UPLC chromatogram og fullt konverteres til nylig vises SUMO og Httex1 toppen), filtrere prøven med en sprøyte filter (0.22 µm).
    Merk: SUMO cleavage er vanligvis veldig fort (10-20 min på 4 ° C) derfor UPLC analyse med en operasjonstid på 4 min er et verdifullt verktøy for å overvåke reaksjonen. Filtrering prøven før HPLC er rensing hovedsakelig et forebyggende tiltak for å øke levetiden for kolonnen. Prøven bør ikke slå grumset.
  7. Rense filtrerte prøven ved RP-HPLC (gradient 25-35% løsemiddel B i løsemiddel A, over 40 min på 15 mL/min. (0-10 min: 5%, 10-12,5 min: 5 til 25%, 12,5-52.5 min: 25 til 35%, 52.5-57,5 min 35 til 95%, se instruksjonene fra produsenten for instrumentet bruk). Sammenligne representant resultater i figur 2C.
    Merk: Httex1 og hans6-SUMO egen godt av RP-HPLC. Men kan det være små mengder avkortet Httex1 i begynnelsen og slutten av fjellet. Samle små fraksjoner for å få maksimal mengde ren materiale.
    Advarsel: Bruk det riktig sikkerhetsutstyret (dvs., laboratoriefrakk, isolert hansker og ansiktsskjerm) når håndtering kryogene væsker.
  8. Analysere HPLC-fraksjoner av elektro-spray ionisering massespektrometri (ESI-MS, autosampler, injisere 10 µL, gjennomstrømning 0,6 mL/min, løsemiddel: 20% B i A, ingen kolonne, se instruksjonene fra produsenten for instrumentet bruk) og UPLC (gradient fra 10% til 90% løsningsmiddel B i A for 0,25 til 3 minutter, 10% B for 1 min, se instruksjonene fra produsenten for instrumentet bruk). Basseng fraksjoner av lignende renhet i 50 mL plast rør, fryse i flytende nitrogen og lyophilize. Veie og overføre lyofilisert protein til 2 mL plast rør og lagre på 20 ° C.
  9. Karakterisere renset materialet av UPLC, ESI-MS og SDS-side. Oppløse 100 µg av lyofilisert Httex1 i 8 µL av pen TFA i en 1,5 mL tube og ruge for 20 min i romtemperatur i lukket reagensglasset. Nøye fordampe TFA under avtrekksvifte med en strøm av nitrogen eller argon. Bruke lavtrykk av nitrogen/argon for å unngå tap av prøven.
    1. Oppløse proteinet i 100 µL av H2O. analysere 2 µL av UPLC og 5 µL av ESI-MS i trinn 3.8. Mix 20 µL av protein løsning med 20 µL av 2 x lasting fargestoff.
    2. Analysere mengder 1 µg til 10 µg SDS-side. Kjør gel for 90 min på 180 V. flekken gel med Coomassie farge i henhold til instruksjonene fra produsenten. Sammenligne representant resultater i figur 2D.

4. disaggregation og Resolubilization Httex1 proteiner

Forsiktig: TFA er en flyktig væske og kan forårsake alvorlige forbrenninger så håndteres med forsiktighet. Utføre alle håndtering i avtrekksvifte og ha tilstrekkelig personlig verneutstyr (dvs. fjerning nitrilhansker, vernebriller og en labfrakk).

  1. Forberede 10 mL Dulbeccos fosfat bufret saltoppløsning (DPBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4pH 7.4) fra ferdigblandet pulver i en 50 mL tube. Filtrere DPBS løsningen gjennom en 0,2 µm før bruk.
  2. Oppløse 150 µg av lyofilisert Httex1 i 12 µL av pen TFA i en 1,5 mL tube og ruge for 20 min i romtemperatur i lukket reagensglasset. Nøye fordampe TFA under avtrekksvifte med en strøm av nitrogen eller argon. Bruke lavtrykk av nitrogen/argon for å unngå tap av prøven38.
    Merk: vanligvis bruke 4 µL TFA å oppløse og disaggregate 50 µg protein. Denne fremgangsmåten vil lage en film av protein på innsiden veggene i reagensglasset. Umiddelbar samling av Httex1 i følgende trinn, arbeide med pre-avkjølt buffere, holde protein alltid på is og unngå høye konsentrasjoner.
  3. Oppløse disaggregated protein i 1 mL av pre-avkjølt DPBS og justere pH 7.2-7,4 med 1 M NaOH. Filtrere protein løsningen gjennom et 100 kDa sentrifugal filter i 1,5 mL plast rør (20000 x g, 4 ° C, 20 minutter).
    Merk: Beregnet teoretisk konsentrasjonen av Httex1 er høyere enn ønsket endelige konsentrasjonen rede for mulige tap. Det filtrering trinnet er nødvendig å fjerne noen aggregater som kan ha dannet under oppløsningen av protein.
  4. Bestemme konsentrasjonen av Httex1 med en UPLC kalibreringskurven basert på aminosyre analyse (gjenkjenning på λ214) og sende 2 µg av proteinet aminosyre analyse å validere konsentrasjon10. Beregne mengden DPBS som skal legges til få en konsentrasjon av 3 µM Httex1.
  5. Fortynne protein til 3 µM ved å legge til beregnede mengden DPBS reagensglasset. Holde røret på is inntil initiering av aggregering protokollen.
    Merk: Httex1 43Q ikke bør oppbevares i løsningen. Alltid forberede en fersk protein løsning basert på protokollen ovenfor. Httex1 proteiner er best lagret som en lyofiliserte pulveret på 20 ° C.

5. overvåking av den aggregering Kinetics av Httex1 43Q med UPLC og sirkulære Dichroism (CD) spektroskopi og karakterisering av aggregater av overføring elektronmikroskop (TEM)

  1. Forberede uranyl formiat løsning TEM som tidligere rapportert39.
  2. Starte aggregering av Httex1 43Q av rugende en 3 µM løsning i DPBS på 37 ° C (bruk 1 mL løsning utarbeidet som beskrevet ovenfor i disaggregation protokollen).
    Merk: Aggregering av Httex1 kan utføres på høyere konsentrasjoner avhengig av behov og mål av eksperimentet.
  3. Kvantifisere mengden løselig protein bruker UPLC på angitt tidspunkt (på 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 og 120 h). For å gjøre det, ta en aliquot på 35 µL og fjerne uløselig aggregater med sentrifugering (20000 x g, 4 ° C, 20 min). Injisere 4 µL nedbryting av i UPLC. Beregne andelen av løselig monomer basert på endring av peak området ved hjelp av instrumentet programvare 40. Sammenligne representant resultater i Figur 3A.
  4. Beskrive endringene i sekundære strukturen med CD spektroskopi på 0 og 48 timer. Ta en aliquot av 100 µL og måle ellipticity (1 mm kvarts cuvette, 195 nm 250 nm, 20 ° C, data poeng hver 0,2 nm hastighet 10 nm/min digitale integrering tid 2 s, båndbredde 1,0 nm). Kjøpe 6 spektra av samplingsfrekvens og gjennomsnitt og glatt med filtere binomiske convolution bredden på 99. Tegne inn til spectra som de mener rester molar ellipticity (θMRE)41. Sammenligne representant resultater i Figur 3B.
  5. Karakterisere strukturelle og morfologiske egenskaper av aggregater av TEM. Sette 3 µL av protein løsningen på en Formvar/karbon-belagt 200-mesh, glød-utladet kobber rutenett i 1 vask rutenettet to ganger med 15 μL vann, en gang med 15 μL 0,7% (w/v) uranyl formatter og flekk for 30 s med 15 μL 0,7% w/v uranyl formiat. Utføre en TEM analyse av rutenettet. Sammenligne representant resultater i Figur 3C.

Representative Results

Httex1 uttrykkes i E. coli med en N-terminal hans6-SUMO tag. Representant resultatet av uttrykket og rensing av fusion protein oppsummeres i figur 1. Sekvensen av Httex1 består av rester 2-90 Htt og starter med Ala2, fordi Met1 er fullt kløyvde i vivo42. Nummereringen av aminosyrer refererer til 23Q varianten, det fullstendige orden av uttrykt fusion protein er vist i figur 1A. Plasmider vil settes på Addgene i fremtiden skal deles med samfunnet. En skjematisk av plasmider og uttrykte fusion protein er vist i figur 1B. His6-SUMO Httex1 uttrykker på et middels nivå (figur 1C) og de fleste av fusion proteinet som finnes, i løselig fraksjonen etter lyse, både i 23Q og 43Q varianten. Fusion protein overfører høyere enn forventet, basert på Molekylvekten. Dette er delvis på grunn av sterk fold i SUMO, men hovedsakelig på grunn av uvanlig sekvens sammensetningen av Httex1, som inneholder hovedsakelig glutamin og proline rester. Både wildtype (23Q) og mutant (43Q) fusion protein kan bli beriket til ~ 80% renhet av IMAC (figur 1D) tilstedeværelsen av co rensende vert protein kan forklares av relativt lavt uttrykk nivået på Httex1 og store prøven volum på kolonnen.

I spalting av hans6-SUMO tag og rensing av Httex1 vises i figur 2A. UPLC er et effektivt verktøy til å overvåke i spalting av hans6-SUMO koden (figur 2B). Den opprinnelige toppen av fusion protein brukes og to nye og godt atskilt toppene tilsvarende hans6-SUMO koden og Httex1 vises. Kløv reaksjonen er ferdig i 10-20 minutter. Western Blot (WB) er også langsom å overvåke cleavage reaksjonen effektivt, men det har blitt inkludert i figuren for referanse og for å demonstrere fullstendigheten av SUMO cleavage. Både Httex1 23Q og 43Q kan skilles godt fra hans6-SUMO merke av RP-HPLC (figur 2C) og ble oppnådd i høy renhetsgrad som vist av UPLC, MS og SDS side analyse (figur 2D).

For å illustrere at Httex1 proteiner utarbeidet av denne metoden beholde egenskapene forventet samling av Httex1, vi vurdert fibrillization kinetics av mutant Httex1 på 37 ° C av en sedimentering analysen, overvåket endringene i sekundære strukturen av CD spektroskopi, og preget morfologi av aggregater av TEM. En representant sett aggregering kinetics mHttex1 fibril formasjonen som en sedimentering analysen er vist iFigur 3A. Tap av løselige Httex1 43Q over tid, på grunn av fibril formasjon ble kvantifisert ved UPLC. Vi observerer en komplett uttømming av løselig protein etter 48 timers inkubasjon. I tillegg bestemt vi den sekundære strukturen av CD spektroskopi (Figur 3B). Httex1 43Q Skift fra ustrukturert (λmin 205 nm) til hovedsakelig β arks rik konformasjon (λmin 215 nm) etter 48 timers inkubasjon. Strukturelle endringen er ledsaget av dannelsen av lange fibrillar aggregater som observerbare av TEM på 48 timer (Figur 3C).

Figure 1
Figur 1 . Uttrykk og rensing av hans6-SUMO Httex1 fusion protein. 
(A) aminosyresekvens av hans6-SUMO-Httex1-QN fusion konstruksjoner (hans6-SUMO i grønt og Httex1-QN i oransje); (B) skjematisk oversikt over uttrykk og rensing av fusion protein; (C) SDS side analyse av uttrykket og Løseligheten av fusion protein etter lysis; (D) Chromatogram IMAC rensing av fusion protein og analyse av fraksjoner av SDS-side (rød linje: ubundet, blå brøkstrek: vask brøk, svarte bar: brøker som inneholder elueringsrør toppen); Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Spalting av hans6 SUMO tag og rensing av tag-fri Httex1-QN proteiner.
(A) skjematisk oversikt; (B) analyse av spalting av SUMO koden med ULP1 av UPLC (blå: før tillegg av ULP1, svart: 20 min (23Q), henholdsvis 10 min (43Q) etter ULP1) og WB (MAB5492 1:2000, sekundær geit anti musen antistoff 1:5000); (C) Chromatogram av skytevåpen RP-HPLC rensing av Httex1; D: analyse av det renset Httex1 av UPLC, SDS side og ESI-MS; den forventede Molekylvekten er 9943 Da (23Q) og 12506 Da (43Q). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Samling av Httex1-43Q: (A) sedimentering analysen basert på UPLC. (B) CD spektra av sekundær strukturen på 0t og 48 h. (C) TEM micrographs av aggregater på 48 h (skala barer er 200 nm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I denne protokollen, har vi skissert en effektiv fremgangsmåte for å få mg mengder av innfødt, umerkede Httex1 som inneholder 23 eller 43 glutamin rester. Dette ble oppnådd ved å uttrykke Httex1 som en C-terminalen fusjon til en hans6-SUMO-kode, som brukes til å isolere fusion protein fra cellen lysate IMAC og er kløyvde før HPLC rensing av Httex1. Mens SUMO strategien har blitt brukt i produksjonen av flere andre proteiner, viser vår metode at de unike egenskapene SUMO kan også brukes til å generere egentlig disordered, aggregering utsatt, amyloidogenic protein som har tidligere vist seg å være ekstremt vanskelig å håndtere og produsere43,44. Vi presenterer en protokoll som er enkelt, brukervennlig og sammenlignes med en protokoll for generering av et "veloppdragen" protein. SUMO fusion solubilizes og stabiliserer Httex1 uttrykk og IMAC rensing trinn. Tidlig spalting av koden, som observert med intein strategi10 og samling var ikke lenger et problem.

Egentlig uordnede proteiner er spesielt sårbare for degradering. N-terminal fornedrelse i regionen N17 er ikke et problem som bruker denne protokollen, kan det oppstå truncations i PRD Httex1. Som avkortet proteiner er svært lik Httex1, hydrophobicity og størrelse, fjerne dem av brukt kromatografiske betyr er utfordrende, så det er best å unngå deres dannelse i første omgang. Stikker tett til protokollen, burde alltid jobber på isen og bruker en tilstrekkelig mengde protease hemmer hjelpe holde nivået av observerte trunkering svært lav. Bruke en fusion-kode på C-terminus av Httex1 kan fjerne truncations i PRD lett som avkortet protein ville miste affinitet koden også. Hvis den opprinnelige rekkefølgen må være dette alternativet ikke kan brukes som Httex1 slutter med proline og best av vår kunnskap er det imidlertid ingen C-terminalen fusion koder som kan indusere traceless og effektiv cleavage etter proline.

Den mest kritiske delen av protokollen er håndtering av Httex1 frigjort etter spalting av SUMO koden av ULP1. Protein bør renses umiddelbart RP-HPLC. Heldigvis er en effektiv og rask reaksjon som er vanligvis gjennomført i 10-20 minutter til 4 ° C. Derimot intein strategien kreves flere timer for komplett spalting av intein, noe som krever en avveining mellom ufullstendig cleavage og begynnelsen samling for å maksimere avkastningen. En rask workup kreves for mutant Httex1, som det vil begynne å samle på den relativt høye konsentrasjonen i spalting reaksjonen, mens 23Q varianten er stabile i lengre tid. Under RP-HPLC rensing, en annen fordel med SUMO blir klart: mens Ssp DnaB intein er hydrofobe og stikker sterkt til kolonnen, SUMO er mer hydrofile og elutes helt fra kolonnen C4 reverseres-fase. Selv om kommersielle ULP1 er ganske dyrt, kan protein lett produseres i høy avkastning etter publisert tidligere protokoller29.

Den kritiske viktigheten av å bruke en disaggregation protokoll før Httex1 kan ikke understrekes nok. Lyofilisert polyQ proteiner som Httex1 er stabilt og kan være lagret lange perioder, men er ikke fullstendig oppløselig i vann og buffere. Preformed oligomers eller fibrils kunne ha en betydelig innvirkning på aggregering kinetics og Biofysiske egenskaper protein45. Disaggregation protokollen beskrevet her kan disaggregation av protein, fjerning av preformed aggregater og generasjon i en løsning av monomerisk Httex1 fra et lyofilisert utvalg. Vi observerte lignende aggregering kinetics og fibril morfologi for Httex1 med SUMO og intein strategi.

Sammenlignet med tidligere metoder for å produsere Httex1, SUMO strategi beskrevet her tilbyr flere fordeler og utvider utvalget av mulige studier for å undersøke strukturen og funksjonelle egenskaper av dette proteinet i helse og sykdom. SUMO-Httex1 fusion protein er lett å håndtere, det kan være frosset og lagret eller holdt i løsning for 24 h ved omgivelsestemperatur, mens den gratis mHttex1 samler raskt. Stabilitet og høy Løseligheten av SUMO-Httex1 fusion proteiner gir større fleksibilitet til å manipulere protein og/eller presentere enzymatisk og kjemiske endringer i mHttex1 som ellers ikke ville være mulig etter cleavage. Dette omfatter innføring av post-translasjonell modifikasjoner, fluorophores, spin etiketter, biotin tags, etc. fremskritt presenteres her bør 1) lette fremtidige studier for å belyse struktur-funksjon relasjoner av Httex1; 2) generere nye verktøy for å undersøke Htt aggregering og patologi spre; 3) Aktiver utviklingen av nye analyser til å identifisere molekyler som stabilisere mutant Httex1 og hindre dens samling; og 4) oppmuntre forskere fra andre felt å bringe til arbeid på dette proteinet og bli vår søken for å finne kurer for Huntingtons sykdom.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen interessekonflikter med innholdet i denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra CHDI foundation og sveitsiske National Science Foundation. Vi takker Dr. Sophie Vieweg for nyttig diskusjoner under utviklingen av denne nye uttrykk-systemet og andre medlemmer av gruppen Lashuel for å dele sine erfaringer med denne uttrykket systemet og deres input og verdifulle tilbakemeldinger. Vi takker også Prof Oliver Hantschel for å gi ULP1 plasmider. Forfatterne takker Dr. John B. Warner og Dr. Senthil K. Thangaraj for kritisk gjennomgang av manuskriptet

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) EMS 22450
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids EMS FCF200-Cu-50
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics HellmaAnalytics 110-1-40
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA Witech SVA4730203
Ampicillin AxonLab A0839.0100
Luria Broth (Miller's LB Broth)  Chemie Brunschwig 1551.05
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) AxonLab A1008.0025
E. coli B ER2566 NEB NEB# E4130
Imidazole Sigma 56750-500G
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 Merck Millipore Corporation MAB5492
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) Licor 925-68070
PMSF AxonLab A0999.0005
HisPrep 16/10 column  GE Healthcare 28936551
C4 HPLC column Phenomenex 00G-4168.P0     10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed
Acetonitrile HPLC MachereyNagel C2502
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile Sarstedt AG 83.1826
Spectrophotometer semi-micro cuvette Reactolab S.A. 2534
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml GE Healthcare 18111382
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml Greiner Bio-One 7.160 102
 100 kD Microcon  fast flow filters Merck Millipore Corporation MRCF0R100
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor Sonics
Äkta 900 equipped with a fraction collector  GE Healthcare
Jasco J-815 Circular Dichroism Jasco
Waters UPLC system  Waters C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column  , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL
waters HPLC system Waters 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing
ESI-MS: Finnigan LTQ Thermo Fisher Scientific
lyophylizer instrument FreeZone 2.5 Plus
Tecnai Spirit BioTWIN  FEI electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV
37 °C shaking  incubator Infors HT multitron Standard
Biophotometer plus Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saudou, F., Humbert, S. The Biology of Huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  2. MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. Huntington's disease. Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).
  3. Li, S., Li, X. J. Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease. Molecular Neurodegeneration. 1, 19 (2006).
  4. DiFiglia, M. Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  5. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  6. Sathasivam, K., et al. Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).
  7. Mangiarini, L., et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell. 87 (3), 493-506 (1996).
  8. El-Daher, M. T., et al. Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation. EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).
  9. Lunkes, A., et al. Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).
  10. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  11. Georgalis, Y., et al. Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).
  12. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  13. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  14. Muchowski, P. J., et al. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).
  15. Heiser, V., et al. Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).
  16. Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation. Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).
  17. Tam, S., et al. The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).
  18. Nekooki-Machida, Y., et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).
  19. Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).
  20. Legleiter, J., et al. Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).
  21. Legleiter, J., et al. Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).
  22. Nucifora, L. G., et al. Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).
  23. Dahlgren, P. R., et al. Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation. Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).
  24. Poirier, M. A., et al. Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).
  25. Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy. Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).
  26. Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells. Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).
  27. Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation. Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).
  28. Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils. Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).
  29. Malakhov, M. P., et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).
  30. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  31. Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility. Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).
  32. Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System. Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).
  33. Reif, A., et al. Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6. Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).
  34. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  35. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).
  36. Lawrence, A. M., Besir, H. U. Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  37. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  38. Chen, S. M., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
  39. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  40. O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).
  41. Greenfield, N. J. Analysis of circular dichroism data. Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).
  42. Aiken, C. T., et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).
  43. Satakarni, M., Curtis, R. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).
  44. Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin. Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).
  45. Chen, S., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).

Tags

Biokjemi problemet 136 HD Huntingtons sykdom huntingtin neurodegeneration polyglutamine polyQ aggregering fibrils SUMO fusion teknologi protein uttrykk og rensing
Generasjon av innfødte, ukodede Huntingtin Exon1 Monomer og Fibrils bruker en SUMO Fusion strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J.,… More

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J., Lashuel, H. A. Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy. J. Vis. Exp. (136), e57506, doi:10.3791/57506 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter