Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Generation av infödda, otaggade Huntingtin Exon1 Monomer och fibriller med en SUMO Fusion strategi

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular and Chemical Biology of Neurodegeneration, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Här presenterar vi ett robust och optimerade protokoll för produktion av milligram mängder infödda, tagg-fria monomerer och fibriller av den exon1 av proteinet Huntingtin (Httex1) baserat på övergående fusion av små ubiquitin relaterade modifierare (SUMO).

Abstract

Huntingtons sjukdom (HD) är en ärftlig dödlig neurodegenerativ sjukdom orsakas av en CAG expansion (≥36) i den första exon av HS-genen, vilket resulterar i uttrycket av Huntingtin proteinet (Htt) eller N-terminala fragment därav med en utökad polyglutamine ( polyQ) stretch.

Exon1 av proteinet Huntingtin (Httex1) är den minsta Htt fragment som recapitulates många av funktionerna i HD i mobilnät och djur modeller och är en av de mest studerade fragment av Htt. Den lilla storleken på Httex1 gör det experimentellt mer mottagliga för biofysiska karakterisering med hjälp av standard- och högupplösta tekniker jämfört med längre fragment eller fullängds Htt. Dock har hög aggregering benägenhet mutant Httex1 (mHttex1) med ökad polyQ innehåll (≥42) gjort det svårt att utveckla effektiva uttryck och reningssystem att producera dessa proteiner i tillräckliga mängder och göra dem tillgängliga för forskare från olika discipliner utan användning av fusionsproteinerna eller andra strategier som förändrar den infödda sekvensen av protein. Vi presenterar här en robust och optimerad metod för produktion av milligram mängder native, tagg-fri Httex1 baserat på övergående fusion av små ubiquitin relaterade modifierare (SUMO). Enkelheten och effektiviteten av strategin kommer att eliminera behovet av att använda icke-infödda sekvenser av Httex1, vilket gör detta protein mer tillgängliga för forskare och förbättra reproducerbarheten av experiment över olika laboratorier. Vi anser att dessa framsteg kommer också att underlätta framtida studier syftar till att belysa relationen struktur och funktion av Htt samt utveckla nya diagnostiska verktyg och terapier för att behandla eller bromsa utvecklingen av HD.

Introduction

HTT är ett 348 kDa-protein och har varit inblandad i flera fysiologiska funktioner1. När Htt innehåller en utökad polyQ region i mer än 36 rester i dess N-terminalen, orsakar det HD2,3. HD patologi kännetecknas av cellulära inneslutningar i striatum och cortex, vilket leder till neuronala dödsfall och atrofi av den drabbade vävnader4,5. Flera N-terminala Htt-fragment som innehåller den polyQ upprepa tarmkanalen har upptäckts i postmortala hjärnor från HS-patienter och tros vara genereras av proteolytiska bearbetning av huntingtin protein6. Nygjorda studier föreslår att Httex1 också kan bildas på grund av avvikande mRNA splicing. Httex1 innehåller patologiska polyQ mutationen och dess överuttryck i djur kan sammanfatta många av de viktigaste funktionerna i HD7, därmed belysa en möjlig centrala roll i detta fragment i HD patologi och sjukdom progression det6, 8,9.

På grund av den höga aggregering benägenheten av muterade Httex1 (mHttex1) med utökad polyQ tarmkanalen, flesta befintliga uttryck system är baserade på övergående fusion av Httex1 till proteiner (såsom glutation-S-transferas (GST), thioredoxin (TRX) eller maltos-bindande-protein (MBP) och/eller peptider (poly-histidin) som differentially förbättra dess uttryck, stabilitet, rening eller löslighet10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Fusion partnern är kopplad till Httex1 med en kort sekvens som innehåller en klyvning webbplats för proteaser såsom trypsin, tabacco etch virus (TEV) proteashämmare eller PreScission att tillåta för klyvning och frisättning av Httex1 före inledandet av aggregering eller rening. Brister i dessa metoder inkluderar möjligheten att lämna ytterligare rester på grund av icke-traceless klyvning och skapandet av trunkerade fragment på grund av miscleavage inom sekvensen av Httex1, förutom heterogenitet på grund av ofullständig klyvning) Se Vieweg et al. för mer djupgående diskussion om fördelarna och begränsningarna med denna metod)10. För att hantera dessa begränsningar, utvecklat vi nyligen ett uttryck strategi möjliggöra tagg-fri infödda Httex1 generations för första gången genom att utnyttja en övergående N-terminala fusion av det Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein till Httex110. Medan intein klyvning är traceless och specifika och avkastning mg mängd proteiner, det fortfarande lider två nackdelar som skulle kunna minska avkastningen: nämligen, för tidig klyvning av den intein som kan uppstå under uttrycket, och det faktum att klyvning sker över flera timmar, vilket kan leda till förlust av protein på grund av aggregering, särskilt för Httex1 med utökade polyQ upprepningar.

Att åtgärda dessa begränsningar och att förfina vår strategi för produktion av infödda, tagg-fri Httex1, som vi utvecklat ett nytt uttryck system baserat på övergående fusion av SUMO, mer exakt den jäst homolog Smt3 till Httex1. Tillämpningen av SUMO systemet för produktion av rekombinanta proteiner publicerades först i 200429, där en ökad frekvens av uttryck och löslighet SUMO fusionsprotein visades. SUMO etiketten kan vara klyvs av ubiquitin som protein-specifika proteas 1 (ULP1), som inte kräver en erkännande webbplats, men erkänner SUMO tertiär struktur och praktiskt taget eliminerar möjligheten att miscleavage30. Dessutom ULP1-medierad klyvning är snabb och traceless och lämnar inte ytterligare rester. För tidig klyvning av fusion taggen, undviks som observerats med de autokatalytisk intein10, helt av kravet på en extern proteashämmare. Medan den SUMO strategin används numera flitigt för rekombinant protein produktion31,32,33, visar vi i detta dokument att det är särskilt användbart för generering av ett intimt oordnade, sammanläggning-benägen, amyloidogenic protein såsom Httex1. Vi tror att enkelhet, effektivitet och robustheten hos vår SUMO-fusion-baserade metod kommer att göra native, tagg-fri Httex1 mer tillgänglig för forskare från olika discipliner och eliminera behovet av att använda icke-infödda sekvenser av Httex1 in vitro- . Detta är ett viktigt framsteg som kommer att underlätta framtida studier för att belysa relationen struktur och funktion av Httex1.

Protokollet beskrivs rening av Httex1 från 12 L av bakterieodling, men protokollet kan enkelt anpassas för mindre eller större skala produktioner. Protokollet beskrivs produktionen av vildtyp Httex1 (wtHttex1) med polyQ repetitionslängd nedan (23Q) och mutant Httex1 (mHttex1) med en polyQ upprepa längd ovan (43Q) patogena tröskeln (36Q).

Protocol

1. redovisning av rekombinant Httex1 23Q och 43Q

  1. Förbereda den nödvändiga buffrar och lösningar. Förbereda 1000 x stamlösning av ampicillin (AMP, 100 mg/mL), filter (0,2 µm), alikvotens och förvaras vid-20 ° C. Förbereda lysogeny buljong (LB) medium (25 g LB Miller per 1 L H2O), autoklav. Bered 1 M Isopropyl ß-D-1thiogalactopyranoside (IPTG) stamlösning, filter (0,2 µm), delprov och butik vid-20 ° C.
  2. Omvandla kemiska behöriga E. coli B ER 2566 med en pTWIN1 vektor, som innehåller mänskliga Httex1 smält till en N-terminal His6-SUMO-tagg med den värme chock metod34.
    Obs: E. coli BL21 DE3 stammen har också använts. Dock observerades i detta fall en ökad mängd truncations.
  3. Inokulera 200 mL LB-medium med 1 x AMP i en 1 L kolv genom att lägga till en enda koloni från agarplattan med en steril pipettspetsen. Inkubera kulturen vid 30 ° C och 180 rpm för 20 h (natten) i en bakteriell inkubator.
  4. Ta en 1 mL prov av kulturen med en steril pipett. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) av provet med en disponibel plast kyvetten och en fotometer (respekt det mätområde mellan 0,1 och 1, utspädd med LB-medium om det behövs). Beräkna mängden preculture som kommer att resultera i en start OD600 0,05 i en 3 L kultur (med en preculture OD600 = 3 skulle innebära 50 mL).
  5. Inokulera fyra kulturer (varje 3 L för LB-medium med 1 x AMP i en 5 L kolv), genom att lägga till det beräknade beloppet för preculture med en steril pipett. Inkubera kulturer vid 37 ° C och 180 rpm i en bakteriell inkubator.
  6. Varje 30 min, ta en 1 mL prov av kulturen med en steril pipett. Mäta den OD600 av provet med en disponibel plast kyvetten och en fotometer. När OD600 har nått 0,1 (vanligtvis efter 1-2 h), Ställ in temperaturen av bakteriell inkubator till 14 ° C och fortsätta ruvning medan nedkylning. Varje 30 min, ta en 1 mL prov av kulturen med en steril pipett. Mäta den OD600 av provet med en disponibel plast kyvetten och en fotometer.
    Obs: Tiden svalna kulturerna kan variera med inkubatorn används, så dags att börja kyla kan behöva anpassas beroende på vilken typ av inkubator används. Ändra temperaturlutning bör dock endast ha en liten inverkan på avkastningen proteinet SUMO fusion verkar vara ganska stabil.
  7. När OD600 nått 0,3-0,4 (vanligtvis efter 1-2 h), ta ett före induktion av SDS-PAGE analys av överuttryck kulturen. Beräkna den urvalsstorlek som ger en jämförbar mängd celler och en bra signal på Coomassie färgas SDS-PAGE: för ett 10 väl gel: volym = 0,2 mL/OD600; ta hälften för en 15 väl gel.
    1. För en bakterieodling med en OD600= 0.4, ta 500 µL. Ta den beräknade volymen bakterieodling med en steril pipett. Snurra ner provet (18000 x g, 4 ° C, 2 min) och Kassera supernatanten. Hålla pelleten vid-20 ° C tills de ska använda för analys (steg 1.11).
  8. Inducera proteinuttryck genom pipettering 1,2 mL av en 1 M IPTG stamlösning till varje 3 L kultur lösning (slutlig koncentration 0,4 mM). Fortsätt ruvning kulturen på 14 ° C i 16 timmar (över natten).
    Obs: Temperaturen kommer vanligtvis har nått ~ 20 ° C när IPTG läggs, beroende på utförandet av inkubatorn.
  9. Ta ett efter induktion av SDS-PAGE analys av den överuttryck, enligt anvisningarna i steg 1,7 kulturen.
  10. Skörda cellerna genom centrifugering i 1 L rör (3993 x g, 4 ° C, 10 min). Tag bort supernatanten, hålla cellpelleten på is och fortsätta direkt till rening.
  11. Analysera överuttryck av SDS-PAGE35,36. Återsuspendera före och efter induktion proverna i 20 µL av kör buffert och 20 µL av 2 x laddar färgämne. Värm proverna för 5 min vid 95 ° C i en värme block och lasta 20 µL på en 15% gel medan den fortfarande är varm. Kör gelen för 90 min på 180 V. fläcken gelen med Coomassie färga enligt anvisningarna från tillverkaren. Jämföra resultat med representativa resultat i figur 1C.
    Obs: Protokollet kan stoppas här, cellpelleten kan frysas och förvaras vid-80 ° C i flera veckor. För optimalt resultat, är det rekommenderat att använda färska bakteriell pelleten och slippa frysa. Frysning-tining kan leda till Lysering av cellerna och nedbrytning av Httex1. Detta kan minska avkastningen och kvaliteten på proteinet.

2. cell Lysis och rening av hans6-SUMO Httex1 fusionsprotein av orörlig metall affinitetskromatografi (IMAC)

  1. Förbered 2 L av buffert A i en glasflaska (50 mM Tris (hydroxymetyl)-aminomethan (Tris), 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol). Laga 1 L buffert B (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol pH 7,4) i en glasflaska. Efter upplösning salter, justera pH med 10 N HCl och filtrera lösningarna till färska flaskor med en flaska övre filter (0,65 µm). Förbereda en 1000 x phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF, 0,3 M) stamlösning, alikvotens 100 µL och förvaras vid-20 ° C.
    Obs: Protokollet är utformad så att slutföra alla steg från Lys av bakteriell pellets till omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC) rening och frystorka den inom 8-9 h. För att begränsa aggregering och proteolys, rekommenderas det att arbeta snabbt utan att pausa och utföra alla steg vid 4 ° C eller på is.
  2. Tillsätt 100 µL av PMSF stamlösning och fem surfplattor (1 per 30 mL slutlig volym) av proteashämmare till 100 mL före kylda buffert A. Lägg till bakteriell pelleten till bufferten och homogenisera suspensionen genom omrörning med magnetiska rör bar och pipettering upp och ner wi Th en steril 10 mL pipett (~ 30 min).
  3. Dela bakteriesuspensionen i alikvoter av 40 mL i 50 mL disponibel plast rör. Sonikera varje alikvot i en vatten/is batch för cellen lysis (70% amplitud, totalt ultraljudsbehandling tid 5 min, intervaller av 30 s ultraljudsbehandling, 30 s paus).
    Obs: Det är viktigt att provet inte värms under ultraljudsbehandling steg. Det rekommenderas att tillsätta lite vatten till isbadet att förbättra värmeavledning under ultraljudsbehandling. Förfarandet för ultraljudsbehandling kan behöva anpassas om ett annat instrument används. Andra lysis metoder som en fransk Press eller en microfluidizer bör fungera lika bra och kan vara fördelaktigt att undvika uppvärmning av prov och protein aggregering. Dessa enheter var inte tillgängliga i vårt laboratorium och vi fick bra resultat med våra ultraljudsbehandling protokoll.
  4. Ta ett prov på 50 µL av den lysate för sodium dodecyl sulfate Polyakrylamidgelen elektrofores (SDS-PAGE) analys. Centrifugera provet (18000 x g, 4 ° C, 2 min) och Pipettera den lösliga fraktionen i en nya provrör. Återsuspendera olösliga fraktionen i 50 µL buffert A med en pipett. Hålla proverna på is tills SDS-PAGE analys (steg 2,6).
  5. Klargöra den lysate genom centrifugering (39191 x g, 4 ° C, 60 min).
  6. Under centrifugering steg, analysera det cell lysis steget av SDS-PAGE. Tillsätt 50 μl av 2 x laddar dye till lösliga och olösliga fraktionen av den lysate respektive. Värme i 5 min vid 95 ° C och load 2 µL på en 15% gel medan den fortfarande är varm. Kör gelen för 90 min på 180 V. fläcken gelen med Coomassie färga enligt anvisningarna från tillverkaren. Jämföra resultat med representativa resultat i figur 1C.
  7. Filtrera supernatanten (0,45 µm, spruta filter). Ta ett prov på 20 µL av filtrerade supernatanten för SDS-PAGE analys (steg 2.11).
    Obs: Vanligtvis en volym på 90-100 mL förtydligat och filtrerade supernatanten erhålls. 3 spruta filter är oftast tillräcklig. Om filtrering är besvärliga, försöka öka den centrifugeringsvarvtal och/eller tid.
  8. Isolera His6-SUMO Httex1 fusion proteinet från den klargj橬一j bakteriella lysate av immobiliserade metall affinitetskromatografi (IMAC) på ett snabb prestanda för vätskekromatografi (FPLC) vid 4 ° C37.
    1. Fyll den klargj橬一j lysate till en superloop och belastning på kolumnen Ni-NTA (strippad, rengöras och reloaded enligt handboken av tillverkaren, en tidigare tom köra rekommenderas) på 2 mL/min. passera 10 kolumn volymer (CV, 200 mL) av buffert A med 10 mL/min till tvätta ut de obundna proteinerna.
    2. Eluera proteinet fusion med 2.5 CV (50 mL) 100% av buffert B på 2 mL/min. Använd en bråkdel storlek 50 mL för lastning och tvätt och 5 mL för eluering. Jämföra resultat med representativa resultat i figur 1D.
  9. Ta ett prov av varje fraktion för SDS-PAGE analys (20 µL) och pool fraktioner som innehåller proteinet fusion enligt toppen av IMAC kromatogrammet. Lägga till (2S, 3S) - 1,4 - Bis (sulfanyl) butan-2,3-diol (DTT) och L-cystein (slutlig koncentration 100 mM vardera) som ett pulver och lös upp genom att försiktigt vända tuben.
    Obs: Vår erfarenhet renheten av fusionsprotein i olika fraktioner är jämförbara. Som en försiktighetsåtgärd bör fraktionerna av den renade fusionsprotein samlas snabbt efter IMAC att förhindra aggregering av högkoncentrerad fraktioner. Dessutom rekommenderas att fortsätta direkt till klyvning av SUMO tagg och HPLC rening. Vid behov kan protokollet stoppas här. Den utspädda lösningen av proteinet fusion var fryst i flytande kväve, lagras vid-80 ° C och renas efter upptining utan en betydande minskning av avkastning. Lagring av den utspädda lösningen av proteinet fusion vid 4 ° C under 24 h också ger liknande resultat.
  10. Analysera IMAC med SDS-PAGE. Tillsätt 20 µL av lastning dye till varje prov. Ladda 2 µL av det rå materiellt (2,7), den obundna fraktionen, tvätta fraktionen och respektive fraktion av eluering toppen på en 15% gel. Kör gelen för 90 min på 180 V. fläcken gelen med Coomassie färga enligt anvisningarna från tillverkaren. Jämföra resultat med representativa resultat i figur 1D.

3. klyvning av hans6-SUMO-tagg och HPLC rening

Varning: Trifluorättiksyra (TFA) är en flyktig vätska och kan orsaka svåra brännskador så hanteras varsamt. Utföra all hantering i ett dragskåp och bära lämplig personlig skyddsutrustning (dvs, disponibel nitrilhandskar, skyddsglasögon och en labbrock).

  1. I en 5 L flaska, tillsätt 5 mL TFA med en Plastspruta till 5 L vatten (lösningsmedel A: H2O, 0,1% (TFA). Tillsätt 2,5 mL TFA med en Plastspruta en 2.5 L flaskan acetonitril (lösningsmedel B: acetonitril, 0,1% TFA).
  2. Förbered det HPLC systemet som föreslås av tillverkaren. Utföra en tom körning för att säkerställa en ren kolumn.
  3. Ta ett prov av 100 µL av fusionsprotein före tillsats av ULP1 att övervaka klyvning reaktionen av UPLC (steg 3.5).
  4. Överför 20 mL av proteinet fusion till en ny 50 mL tub och tillsätt 0,4 mL stamlösning av ULP1, inkubera på is. Hålla den återstående fusionsprotein på is.
    Obs: Hans-taggade katalytisk fragmentet 403-621 av Ubiquitin-liknande-specifika proteas 1 (här kallad ”ULP1”) användes för att klyva taggen SUMO. Fusionsprotein är mer stabil än den kluvna Httex1. Det rekommenderas inte att klyva SUMO taggen i hela partiet. Fortsätt istället med portioner av en storlek som kan tillämpas direkt och fullständigt till i HPLC-kolonnen.
  5. Varje 10 minuter, ta ett prov av 100 µL av klyvning reaktionen att övervaka framstegen med ultra-vätskekromatografi (UPLC). Centrifugera proverna (18000 rpm, 4 ° C, 2 min) och analysera 2 µL av supernatanten med UPLC (gradient från 10% till 90% lösningsmedel B i A för 0,25 till 3 min, 10% B för 1 min, se instruktioner från tillverkaren för instrumentet användning). Jämför de kromatogram erhålls för provet före tillsats av ULP1 och de prover som tagits. Jämföra resultaten med representativa resultat i figur 2B.
  6. När SUMO-klyvning är klar (toppen av proteinet fusion har försvunnit i UPLC kromatogrammet och omvandlas helt till nyligen visasende SUMO och Httex1 peak), filtrera provet med en spruta filter (0,22 µm).
    Obs: SUMO klyvning är normalt mycket snabb (10-20 minuter vid 4 ° C) UPLC analys med en körning av 4 min är därför ett värdefullt verktyg för att övervaka reaktionen. Rening filtrering provet innan HPLC och är främst en förebyggande åtgärd för att öka livslängden på kolumnen. Provet bör inte stänga grumligt.
  7. Rena filtrerade provet genom RP-HPLC (lutningen av 25-35% lösningsmedel B i lösningsmedel A, över 40 min på 15 mL/min. (0-10 min: 5%, 10-12,5 min: 5 till 25%, 12,5-52,5 min: 25 till 35%; 52,5-57,5 min 35 till 95%; hänvisar till instruktioner från tillverkaren för instrumentet användning). Jämföra resultat med representativa resultat i figur 2C.
    Obs: Httex1 och hans6-SUMO separat väl av RP-HPLC. Det kan dock finnas små mängder trunkerade Httex1 i början och slutet av toppen. Samla in små fraktioner för att få den maximala mängden rent materiellt.
    Försiktighet: Använd lämplig säkerhetsutrustning (dvs, labbrock, isolerade handskar och ansiktsskydd) vid hantering av kryogena vätskor.
  8. Analysera HPLC-fraktioner av electro-spray jonisering masspektrometri (ESI-MS, autosampler, injicera 10 µL, flöde 0,6 mL/min, lösningsmedel: 20% B i någon kolumn, hänvisar till instruktioner från tillverkaren för instrumentet användning) och UPLC (gradient från 10% till 90% lösningsmedel B i A för 0,25 till 3 min, 10% B för 1 min, se instruktioner från tillverkaren för instrumentet användning). Pool fraktioner av motsvarande renhetsgrad i 50 mL plaströr, frysa i flytande kväve och lyophilize. Väga och överföra frystorkade proteinet i 2 mL plaströr och förvaras vid-20 ° C.
  9. Prägla det rena materialet av UPLC, ESI-MS och SDS-PAGE. Lös 100 µg av frystorkade Httex1 i 8 µL snyggt transfettsyror i en 1,5 mL tub och inkubera i 20 min i rumstemperatur i slutna provröret. Försiktigt avdunsta i TFA under ett dragskåp med en ström av kväve eller argon. Använd lågt tryck av kväve/argon för att undvika förlust av provet.
    1. Lös upp proteinet i 100 µL av H2O. analysera 2 µL av UPLC och 5 µL av ESI-MS som i steg 3,8. Blanda 20 µL protein lösning med 20 µL av 2 x laddar färgämne.
    2. Analysera mängder 1 µg 10 µg av SDS-PAGE. Kör gelen för 90 min på 180 V. fläcken gelen med Coomassie färga enligt anvisningarna från tillverkaren. Jämföra resultat med representativa resultat i figur 2D.

4. uppdelning och Resolubilization av Httex1 proteiner

Varning: TFA är en flyktig vätska och kan orsaka svåra brännskador så hanteras varsamt. Utföra all hantering i ett dragskåp och bära lämplig personlig skyddsutrustning (dvs disponibla nitrilhandskar, skyddsglasögon och en labbrock).

  1. Förbereda 10 mL Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) från färdigblandad pulvret i en 50 mL tub. Filtrera DPBS lösningen genom ett 0,2 µm filter före varje användning.
  2. Lös 150 µg av frystorkade Httex1 i 12 µL snyggt transfettsyror i en 1,5 mL tub och inkubera i 20 min i rumstemperatur i slutna provröret. Försiktigt avdunsta i TFA under ett dragskåp med en ström av kväve eller argon. Använd lågt tryck av kväve/argon för att undvika förlust av prov38.
    Obs: I allmänhet använda 4 µL TFA att upplösa och dela upp 50 µg av protein. Detta förfarande kommer att skapa en film av protein på insidan väggarna i provröret. För att förhindra omedelbar aggregering av Httex1 i följande steg, arbeta med nedkylda buffertar, hålla proteinet alltid på is och undvika höga koncentrationer.
  3. Lös det disaggregerade proteinet i 1 mL av nedkylda DPBS och justera pH-värdet till 7,2-7,4 med 1 M NaOH. Filtrera lösningen protein genom en 100 kDa centrifugal filter till 1,5 mL plaströr (20000 x g, 4 ° C, 20 minuter).
    Obs: Beräknade teoretiska koncentrationen av Httex1 är högre än den önska slutliga koncentrationen till svars för eventuell förlust. Det filtrering steget är nödvändigt att ta bort alla aggregat som kan ha bildats under upplösningen av proteinet.
  4. Bestämma koncentrationen av Httex1 med en UPLC kalibreringskurvan utifrån aminosyra analys (upptäckt vid λ214) och skicka 2 µg av protein aminosyra analys att validera den koncentration10. Beräkna mängden DPBS som behöver läggas till en koncentration på 3 µM Httex1.
  5. Späd proteinet till 3 µM genom att det beräknade beloppet för DPBS till provröret. Håll röret på is fram till inledningen av protokollet aggregering.
    Obs: Httex1 43Q inte bör förvaras i lösning. Alltid Bered en färsk protein baserat på protokollet ovan. Httex1 proteiner lagras bäst som ett frystorkat pulver vid-20 ° C.

5. övervakning av det Aggregation Kinetics av Httex1 43Q med UPLC och cirkulär Dichroism (CD) spektroskopi och karakterisering av aggregaten av Transmission Electron Microscopy (TEM)

  1. Förbereda uranyl formate lösning för TEM som tidigare rapporterats39.
  2. Initiera sammanläggning av Httex1 43Q av ruvar en 3 µM lösning i DPBS vid 37 ° C (Använd 1 mL av lösning som beretts enligt ovan i protokollet områdesindelningen).
    Obs: Aggregering av Httex1 kan utföras vid högre koncentrationer beroende på behov och mål av experimentet.
  3. Kvantifiera mängden lösligt protein använder UPLC vid angivna tidpunkter (vid 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 och 120 h). För att göra det, ta en alikvot av 35 µL och ta bort de olösliga aggregat genom centrifugering (20000 x g, 4 ° C, 20 min). Injicera 4 µL av supernatanten i UPLC. Beräkna andelen löslig monomer baserat på ändringen av den topparea som använder instrumentet programvara 40. Jämföra resultat med representativa resultat i figur 3A.
  4. Prägla förändringarna i sekundära struktur med hjälp av CD-spektroskopi på 0 och 48 h. Ta en alikvot av 100 µL och mäta ellipticity (1 mm kvarts kyvetten, 195 nm till 250 nm, 20 ° C, data pekar varje 0,2 nm, hastighet 10 nm/min, digital integration tid 2 s, bandbredd av 1,0 nm). Förvärva 6 spektra av prov och genomsnittliga och släta med en binomial filter med faltning bredd 99. Rita spektra som den genomsnittliga rester molar ellipticity (θMRE)41. Jämföra resultat med representativa resultat i figur 3B.
  5. Karakterisera de strukturella och morfologiska egenskaperna av aggregaten av TEM. Satte 3 µL av den protein-lösningen på ett Formvar/carbon-belagda 200-mesh, glöd-släpps koppar rutnät för 1 min. Tvätta nätet två gånger med 15 μL vatten, en gång med 15 μL av 0,7% (w/v) uranyl formate och fläcken för 30 s med 15 μL av 0,7% w/v uranyl formate. Utföra en TEM analys av nät. Jämföra resultat med representativa resultat i figur 3C.

Representative Results

Httex1 uttrycks i E. coli med en N-terminal hans6-SUMO tagg. De representativa resultat av uttryck och rening av proteinet fusion sammanfattas i figur 1. Sekvensen av Httex1 består av rester 2-90 Htt och börjar med Ala2, eftersom Met1 är fullt klyvs i vivo42. Numreringen av de amino syrorna hänvisar till den 23Q varianten, komplett sekvensen av proteinet uttrycks fusion visas i figur 1A. Plasmidsna kommer att deponeras på Addgene inom en snar framtid ska delas med gemenskapen. En schematisk bild av Plasmiden och proteinet uttrycks fusion visas i figur 1B. His6-SUMO Httex1 uttrycker på en medelhög nivå (figur 1C) och de flesta av fusionsprotein förekommer i lösliga fraktionen efter Lys, både för 23Q och den 43Q varianten. Fusionsprotein migrerar högre än väntat, baserat på molekylvikten. Detta är delvis på grund av det starka vecket av SUMO men främst på grund av ovanliga sekvens sammansättningen av Httex1, som huvudsakligen innehåller glutamin och prolin. Både vildtyp (23Q) och mutant (43Q) fusionsprotein kan berikas till ~ 80% renhet av IMAC (figur 1D) förekomsten av samtidig rening värddator protein kan förklaras av den jämförelsevis låga uttryck Httex1 och det stora provet volym tillämpas på kolumnen.

Klyvning av hans6-SUMO tagg och rening av Httex1 visas i figur 2A. UPLC är ett effektivt verktyg för att övervaka klyvning av hans6-SUMO tag (figur 2B). Den ursprungliga toppen av fusionsprotein förbrukas och två nya och väl separerade topparna motsvarande hans6-SUMO tagg och Httex1 visas. Klyvning reaktionen är klar i 10-20 min. Western Blot (WB) är för långsamt för att övervaka klyvning reaktionen effektivt, men det har inkluderats i figuren för referens och demonstrera fullständighet SUMO klyvning. Både Httex1 23Q och 43Q kan separeras väl från hans6-SUMO tagga genom RP-HPLC (figur 2C) och erhölls i hög renhet som framgår av UPLC, MS och SDS-PAGE analys (figur 2D).

För att illustrera att de Httex1 proteiner som utarbetats av denna metod behålla beräknade aggregering egenskaperna för Httex1, vi bedömde fibrillization kinetik av muterade Httex1 vid 37 ° C med en sedimentering assay, övervakas förändringarna i sekundärt strukturera av CD spektroskopi, och kännetecknas av aggregaten av TEM morfologi. En representativ uppsättning data av aggregation kineticsen av mHttex1 fibrill formation som bestäms av en sedimentering analysen visas ifigur 3A. Förlusten av lösliga Httex1 43Q över tid, på grund av fibrillcellulosa bildandet kvantifierades genom UPLC. Vi observerar en komplett uttömning av lösligt protein efter 48 timmars inkubation. Dessutom kan utifrån vi det sekundära strukturerar av proteinet CD spektroskopi (figur 3B). Httex1 43Q skiftar från ostrukturerade (λmin 205 nm) till huvudsakligen β-arks rika konformation (λmin 215 nm) efter 48 timmars inkubation. Denna strukturella förändring åtföljs av bildandet av långa fibrillar aggregat som observerbara av TEM på 48 timmar (figur 3C).

Figure 1
Figur 1 . Uttryck och rening av hans6-SUMO Httex1 fusionsprotein. 
(A) den amino syra ordnar av hans6-SUMO-Httex1-QN fusion konstruktioner (hans6-SUMO i grönt och Httex1-QN i orange); (B) Schematisk översikt över uttryck och rening av proteinet fusion; (C) SDS-PAGE analys av uttrycket och lösligheten av proteinet fusion efter Lys; (D) kromatogrammet för IMAC rening av proteinet fusion och analys av fraktionerna av SDS-PAGE (röd stapel: obundna fraktionen, blue bar: tvätta bråkdel, svart bar: fraktioner som innehåller eluering peak); Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Klyvning av hans6 SUMO tagg och rening av tagg-fri Httex1-QN proteiner.
(A) Schematisk översikt; (B) analys av klyvning av taggen SUMO med ULP1 av UPLC (blå: före tillsats av ULP1; svart: 20 min (23Q), respektive 10 min (43Q) efter tillsats av ULP1) och WB (MAB5492 1: 2000, sekundära get anti mus-antikropp 1: 5000); (C) kromatogrammet för preparativ RP-HPLC rening av Httex1; D: analys av den renade Httex1 av UPLC, SDS-PAGE och ESI-MS; den beräknade molekylvikten är 9943 Da (23Q) respektive 12506 Da (43Q). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Aggregering av Httex1-43Q: (A) sedimentering analys utifrån UPLC. (B) CD spektra av det sekundära strukturerar vid 0 h och 48 h. (C) TEM micrographs av aggregaten på 48 h (skala barer är 200 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I detta protokoll, har vi sammanställt ett effektivt förfarande för anskaffning milligram kvantiteter av native, omärkta Httex1 som innehåller 23 eller 43 glutamin rester. Detta uppnåddes genom att uttrycka Httex1 som en C-terminal fusion till en hans6-SUMO tagg, som används för att isolera fusion proteinet från cell lysate av IMAC och är tätt innan HPLC rening av Httex1. Medan den SUMO strategin har använts i produktionen av flera andra proteiner, visar vår metod att de unika egenskaperna som SUMO kunde också användas för att generera egensäkra andningsstörningar, aggregation-benägen, amyloidogenic protein som tidigare har visat sig vara extremt svårt att hantera och producera43,44. Vi presenterar ett protokoll som är enkel, lätt att använda och jämförbar med ett protokoll för generering av ett ”skötsam” protein. SUMO fusion solubilizes och stabiliserar Httex1 under uttryck och den IMAC reningssteg. För tidig klyvning av taggen, som observerats med de intein strategi10 och aggregation inte längre var ett problem.

Egensäkra oordnade proteiner är särskilt utsatta för nedbrytning. Medan N-terminala nedbrytning i regionen N17 inte är en fråga som använder detta protokoll, kan truncations i den PRD av Httex1 uppstå. De trunkerade proteinerna är mycket lik Httex1 i vattenavvisande egenskaper, kostnad och storlek, ta bort dem av kromatografiska metoder är utmanande, därför är det bäst att förhindra deras bildning i första hand. Hålla sig nära till protokollet, bör alltid arbetar på is och med en tillräcklig mängd av proteashämmare hjälpa hålla nivån på observerade trunkering mycket låg. Tillämpa en fusion tagg på C-terminus av Httex1 kunde ta bort truncations på PRD enkelt som stympade proteinet skulle förlora affinitet etiketten samt. Det finns dock inga C-terminal fusion taggar som är kända att inducera traceless och effektiv klyvning efter proline om infödda sekvensen behöver underhållas här alternativet inte kan användas som Httex1 slutar med proline och till bäst av vår kunskap.

Den mest kritiska delen i protokollet är hanteringen av den Httex1 befriades efter klyvning av taggen SUMO av ULP1. Proteinet bör renas omedelbart genom RP-HPLC. Lyckligtvis är detta en effektiv och snabb reaktion som är vanligtvis avslutad i 10-20 min vid 4 ° C. Den intein strategin krävs däremot flera timmar för fullständig klyvning av den intein, vilket kräver en avvägning mellan ofullständig klyvning och början aggregering för att maximera avkastningen. En snabb workup krävs för mutant Httex1, som det kommer att börja att aggregera på den jämförelsevis höga koncentrationen som finns i klyvning reaktionen, medan den 23Q varianten är stabil under en längre tid. Under RP-HPLC rening, en annan fördel med SUMO blir uppenbar: medan den Ssp DnaB intein är hydrofoba och sticker starkt till kolumnen, SUMO är mer hydrofil och eluerar helt från kolumnen C4 omvänd fas. Även om kommersiella ULP1 är ganska dyrt, kan proteinet produceras enkelt i hög avkastning efter tidigare publicerade protokoll29.

Den avgörande betydelsen av att tillämpa en disaggregering protokollet innan du använder Httex1 kan inte nog betonas. Frystorkade polyQ proteiner såsom Httex1 är stabila och kan vara lagrade långa perioder, men är inte helt löslig i vatten och buffertar. Förekomsten av förformade oligomerer eller fibriller kan ha en betydande inverkan på aggregation kinetics och biofysiska egenskaper av den protein-45. Områdesindelningen protokollet beskrivs här tillåter en uppdelning av proteinet, borttagning av förformade aggregat och generering av en lösning av monomer Httex1 från ett frystorkat prov. Vi observerade liknande aggregation kinetics och fibrill morfologi för Httex1 erhållande med SUMO och intein strategi.

Jämfört med tidigare metoder för att producera Httex1, SUMO strategin beskrivs här erbjuder flera fördelar och utökar utbudet av möjliga studier för att undersöka strukturen och funktionella egenskaper av detta protein i hälsa och sjukdom. SUMO-Httex1 fusion proteinet är lätt att hantera, det kan vara fryst och lagras eller förvaras i lösning för 24 h vid omgivande temperatur, medan den gratis mHttex1 skulle sammanställa snabbt. Stabilitet och hög löslighet SUMO-Httex1 fusionsproteinerna ger större flexibilitet för att manipulera proteinet eller införa enzymatisk och kemiska ändringar i mHttex1 som annars inte skulle vara möjligt efter klyvning. Detta inkluderar införandet av post-translationella modifieringar, fluorophores, spin etiketter, biotin taggar, etc. bör de förskott som presenteras här 1) underlätta framtida studier för att klarlägga struktur-funktionssamband av Httex1; (2) generera nya verktyg för att undersöka Htt aggregering och patologi spridning. (3) möjliggöra utvecklingen av nya analyser att identifiera molekyler som stabilisera mutant Httex1 och förhindra dess aggregation; och 4) uppmuntra forskare från andra fält att arbeta på detta protein och gå med i vår strävan att hitta botemedel mot Huntingtons sjukdom.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga intressekonflikter med innehållet i denna artikel.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades främst genom bidrag från stiftelsen CHDI och schweiziska National Science Foundation. Vi tackar Dr Sophie Vieweg för användbar diskussioner under utvecklingen av detta nya uttryck-system och andra medlemmar i gruppen Lashuel för att dela sina erfarenheter med detta uttryck system och deras input och värdefull feedback. Vi tackar också Prof. Oliver Hantschel för att tillhandahålla ULP1 Plasmiden. Författarna tackar Dr. John B. Warner och Dr Senthil K. Thangaraj för kritisk granskning av manuskript

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) EMS 22450
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids EMS FCF200-Cu-50
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics HellmaAnalytics 110-1-40
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA Witech SVA4730203
Ampicillin AxonLab A0839.0100
Luria Broth (Miller's LB Broth)  Chemie Brunschwig 1551.05
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) AxonLab A1008.0025
E. coli B ER2566 NEB NEB# E4130
Imidazole Sigma 56750-500G
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 Merck Millipore Corporation MAB5492
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) Licor 925-68070
PMSF AxonLab A0999.0005
HisPrep 16/10 column  GE Healthcare 28936551
C4 HPLC column Phenomenex 00G-4168.P0     10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed
Acetonitrile HPLC MachereyNagel C2502
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile Sarstedt AG 83.1826
Spectrophotometer semi-micro cuvette Reactolab S.A. 2534
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml GE Healthcare 18111382
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml Greiner Bio-One 7.160 102
 100 kD Microcon  fast flow filters Merck Millipore Corporation MRCF0R100
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor Sonics
Äkta 900 equipped with a fraction collector  GE Healthcare
Jasco J-815 Circular Dichroism Jasco
Waters UPLC system  Waters C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column  , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL
waters HPLC system Waters 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing
ESI-MS: Finnigan LTQ Thermo Fisher Scientific
lyophylizer instrument FreeZone 2.5 Plus
Tecnai Spirit BioTWIN  FEI electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV
37 °C shaking  incubator Infors HT multitron Standard
Biophotometer plus Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saudou, F., Humbert, S. The Biology of Huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  2. MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. Huntington's disease. Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).
  3. Li, S., Li, X. J. Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease. Molecular Neurodegeneration. 1, 19 (2006).
  4. DiFiglia, M. Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  5. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  6. Sathasivam, K., et al. Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).
  7. Mangiarini, L., et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell. 87 (3), 493-506 (1996).
  8. El-Daher, M. T., et al. Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation. EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).
  9. Lunkes, A., et al. Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).
  10. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  11. Georgalis, Y., et al. Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).
  12. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  13. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  14. Muchowski, P. J., et al. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).
  15. Heiser, V., et al. Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).
  16. Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation. Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).
  17. Tam, S., et al. The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).
  18. Nekooki-Machida, Y., et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).
  19. Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).
  20. Legleiter, J., et al. Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).
  21. Legleiter, J., et al. Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).
  22. Nucifora, L. G., et al. Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).
  23. Dahlgren, P. R., et al. Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation. Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).
  24. Poirier, M. A., et al. Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).
  25. Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy. Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).
  26. Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells. Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).
  27. Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation. Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).
  28. Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils. Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).
  29. Malakhov, M. P., et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).
  30. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  31. Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility. Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).
  32. Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System. Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).
  33. Reif, A., et al. Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6. Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).
  34. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  35. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).
  36. Lawrence, A. M., Besir, H. U. Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  37. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  38. Chen, S. M., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
  39. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  40. O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).
  41. Greenfield, N. J. Analysis of circular dichroism data. Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).
  42. Aiken, C. T., et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).
  43. Satakarni, M., Curtis, R. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).
  44. Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin. Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).
  45. Chen, S., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).

Tags

Biokemi fråga 136 HD Huntingtons sjukdom huntingtin neurodegeneration polyglutamine polyQ aggregering fibriller SUMO fusionsteknik proteinuttryck och rening
Generation av infödda, otaggade Huntingtin Exon1 Monomer och fibriller med en SUMO Fusion strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J.,… More

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J., Lashuel, H. A. Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy. J. Vis. Exp. (136), e57506, doi:10.3791/57506 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter