Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular and Chemical Biology of Neurodegeneration, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Burada, yerli, etiket içermeyen monomerleri miktarlarda miligram ve liflerinde küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı exon1 Huntingtin protein (Httex1) üretimi için sağlam ve en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Huntington hastalığı (HD) bir devralınan ölümcül nörodejeneratif hastalık bir CAG genişletme (≥36) tarafından neden içinde HD gen exon ilk Huntingtin protein (Htt) ifadesinde kaynaklanan ya da N-terminal bunların parçaları bir genişletilmiş polyglutamine () ile polyQ) streç.

Huntingtin protein (Httex1) exon1 HD özellikleri cep içinde birçok beyannamedir en küçük Htt parçası ve hayvan modelleri ve Htt en çok çalışılmış parçaları biridir. Httex1 küçük boyutu deneysel olarak daha mükellef ile karşılaştırıldığında daha uzun parçaları veya tam uzunlukta Htt standart ve yüksek çözünürlüklü teknikleri kullanarak biyofiziksel karakterizasyonu için yapar. Ancak, yüksek toplama eğilimi mutant Httex1 (mHttex1) artan polyQ içeriği (≥42) ile verimli ifade ve bu proteinler yeterli miktarlarda üretmek ve onları erişilebilir yapmak için arıtma sistemleri geliştirmek zor yaptı Füzyon protein veya protein yerli dizi alter diğer stratejileri kullanmanıza gerek kalmadan farklı disiplinlerden bilim adamları. Burada sağlam ve en iyi duruma getirilmiş bir yöntem mevcut miligram miktarda yerli üretimi için etiket ücretsiz-küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı Httex1. Sadelik ve verimliliği strateji Httex1, böylece bu proteinin araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirmek ve deneyler tekrarlanabilirlik farklı laboratuvarlar arasında artırma non-yerli dizileri kullanma gereksinimini ortadan kaldırır. Bizce bu gelişmeler de Htt yanı sıra gelişmekte olan yeni tanı araçları ve tedaviler tedavi etmek ya da HD ilerlemesini yavaşlatmak yapı-fonksiyon ilişkisi elucidating yönelik gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır.

Introduction

HTT 348 kDa protein ve birçok fizyolojik fonksiyonları1' karıştığı olmuştur. HTT fazla 36 kalıntılarında onun N-terminus bir genişletilmiş polyQ bölgesini içerdiğinde, HD2,3neden olur. HD patoloji striatum ve nöronal ölüm ve atrofi etkilenen doku4,5yol açar korteks hücresel kapanımlar karakterizedir. PolyQ tekrar yolu içeren birkaç N-terminal Htt parçaları otopsi beyin HD hastalardan tespit ve huntingtin protein6proteolitik işlem tarafından oluşturulacak sanıyordum. Son yıllarda yapılan çalışmalarda Httex1 de anormal mRNA'ın porno versiyonunu nedeniyle bir araya ki öneririz. Httex1 patolojik polyQ mutasyon içerir ve onun overexpression hayvanlarda HD7böylece olası bir rol HD patoloji ve hastalık ilerleme '6Bu parçası vurgulayarak, anahtar özellikleri birçok özetlemek, 8,9.

Yüksek toplama eğilimi mutant Httex1 nedeniyle (mHttex1) genişletilmiş polyQ yolu ile Httex1 geçici füzyon proteinler için varolan ifade sistemleri çoğunluğu dayanmaktadır (glutatyon-S-transferaz (GST), thioredoxin (TRX) gibi veya maltoz bağlayıcı protein (MBP) ve/veya onun ifade, istikrar, arıtma ve/veya çözünürlük10,11,12,13,14 differentially artıran peptidler (poli-histidin) ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Füzyon ortak Httex1 için kısa bir sıra tripsin gibi proteaz için bir bölünme site içeren ile bağlantılı, tütün etch virüs (TEV) proteaz veya bölünme ve Httex1 sürümünden önce toplama başlatılması için izin vermek için PreScission veya Arıtma. Bu yöntemlerin eksikliklerini traceless bölünme nedeniyle ek artıkları ve miscleavage heterojenlik nedeniyle eksik bölünme () yanı sıra Httex1, dizisi içinde nedeniyle kesilmiş parçaları oluşturulması bırakma olasılığını içerir Vieweg ve ark. avantajları ve sınırlamalar bu yaklaşımın daha kapsamlı açıklama için bakınız)10. Biz bu sınırlamaları gidermek için son zamanlarda Synechocystis sp. geçici bir N-terminal füzyonu kullanarak etiket içermeyen yerli Httex1 üretimi ilk kez etkinleştirme bir ifade stratejisi geliştirdi (Ssp) DnaB intein Httex110. İntein göğüs arası traceless ve belirli ve mg protein miktarı verir iken, hala verimi azaltabilir iki dezavantajı uğrar: Ifade ve üzerinde bir bölünme oluşur aslında gerçekleşebileceğini intein Yani, erken bölünme birkaç saat, toplama, genişletilmiş polyQ tekrarlar ile Httex1 için özellikle nedeniyle protein kaybına neden olabilir.

Bu sınırlamaları gidermek ve yerli üretim için bizim strateji geliştirmek için etiket içermeyen Httex1, SUMO, daha tam olarak Maya homolog Smt3 Httex1 için geçici füzyon dayalı yeni bir ifade sistemi geliştirdik. SUMO sistemi rekombinant proteinlerin üretimi için ilk nerede bir artış oranı ifade ve çözünürlük SUMO füzyon protein gösterilmiştir 200429, yayınlandı. SUMO etiketi Ubikuitin protein özgü proteaz 1 (ULP1), hangi does değil istemek bir tanıma site ama SUMO Tersiyer yapısını tanır ve pratik miscleavage30olasılığını ortadan kaldırır gibi i ciddi. Ayrıca, ULP1-aracılı bölünme hızlı ve traceless ve ek artıkları bırakmaz. Füzyon etiketi, erken bölünme ile otokatalitik intein10, gözlemlediği gibi tamamen dış bir proteaz gereksinimi tarafından önlenmiş olur. SUMO strateji Rekombinant protein üretim31,32,33için günümüzde yaygın olarak kullanılırken, biz özünde düzensiz bir nesil için özellikle yararlı olur bu yazıda göstermek, toplama eğilimli, amyloidogenic protein Httex1 gibi. Biz sadelik, verimlilik ve sağlamlığı bizim SUMO-fusion tabanlı yöntemi yerli, etiket içermeyen Httex1 farklı disiplinlerden araştırmacılar için daha erişilebilir kılan ve Httex1 vitro non-yerli dizileri kullanma gereksinimini ortadan kaldırmak inanıyoruz . Httex1 yapı-fonksiyon ilişkinin aydınlatmak için gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracak önemli bir ilerleme bu.

Protokol Httex1 bakteri kültürü 12 l arıtma açıklar, ancak protokol kolayca daha küçük veya daha büyük ölçekli üretimler için adapte. Bir polyQ tekrar uzunluğu (23Q) aşağıda ve mutant Httex1 ile üretim vahşi türü Httex1 (wtHttex1) protokolünü açıklar (mHttex1) bir polyQ ile patojenik eşik (36Q) uzunluğu (43Q) yukarıda tekrarlayın.

Protocol

1. ifade rekombinant Httex1 23Q ve 43Q

  1. Gerekli arabellek ve çözümleri hazırlayın. 1000 x ampisilin (AMP, 100 mg/mL) hisse senedi çözüm, filtre (0.2 µm), aliquot ve mağaza-20 ° C'de hazırlamak Lysogeny suyu (LB) orta hazırlamak (25 g LB Miller başına 1 L H2O), basınçlı kap. 1 M izopropil β-D-1thiogalactopyranoside (IPTG) stok çözüm, filtre (0.2 µm), aliquot ve mağaza hazırlamak-20 ° C'de
  2. Kimyasal yetkili E. coli B insan Httex1 bir N-terminal His6-SUMO etiketi ile ısı şok yöntemi34için erimiş içeren ER 2566 pTWIN1 vektör ile dönüşümü.
    Not: E. coli BL21 DE3 zorlanma da kullanılmıştır. Ancak, bu durumda truncations artan miktarda gözlendi.
  3. LB-orta 200 mL 1 aşılamak amfi agar plaka steril pipet ucu ile bir koloni ekleyerek bir 1 L konik şişesi için x. 30 ° C ve 180 rpm 20 h (gece) bakteriyel bir kuluçka için kültür kuluçkaya.
  4. Steril bir pipet ile kültürünün 1 mL örnek al. 600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) örnek bir tek kullanımlık plastik küvet ve foto ölçüler (ölçüm aralığı arasında 0,1 ve 1 LB-orta ile seyreltik gerekirse saygı). Bir başlangıç OD600 0,05 3 L kültür neden olur preculture, miktarı (OD600 preculture ile = 50 mL anlamına gelir 3).
  5. Dört kültürü aşılamak (LB-orta her 3 L 1 AMP bir 5 L şişesi içinde x), preculture steril bir pipet ile hesaplanan miktarı ekleyerek. 37 ° C ve bakteriyel bir kuluçka 180 rpm kültürler kuluçkaya.
  6. Her 30 dakikada bir 1 mL örnek steril bir pipet ile kültürün al. Tek kullanımlık plastik küvet ve bir fotometre ile örnek OD600 ölçmek. OD600 0,1 (genellikle 1-2 h sonra) ulaştı, bakteriyel kuluçka makinesi sıcaklığı 14 ° C'ye koymak ve soğutma sırasında kuluçka devam. Her 30 dakikada bir 1 mL örnek steril bir pipet ile kültürün al. Tek kullanımlık plastik küvet ve bir fotometre ile örnek OD600 ölçmek.
    Not: soğutma başlama zamanı kullanılan kuluçka türüne bağlı olarak adapte böylece kültürler soğumasını zaman kullanılan, kuluçka makinesi ile değişebilir. SUMO füzyon protein oldukça kararlı görünüyor gibi ancak, sıcaklık değişimi değişen sadece verimi üzerinde küçük bir etkisi bulunmamaktadır.
  7. OD600 (genellikle 1-2 h sonra) 0,3-0,4 ulaşmıştır, kültür overexpression SDS-sayfa analizi için ön indüksiyon örneğini alın. Hücreleri karşılaştırılabilir bir miktarda verir örnek boyutu hesapla ve Coomassie iyi bir sinyal SDS-sayfa lekeli: için bir 10 iyi jel: birim 0.2 mL = / OD600; 15 iyi jel için yarısını.
    1. Bir OD600ile bakteri kültürü için = 0,4, al 500 µL. Bakteri kültürü steril bir pipet ile hesaplanan birim alır. Spin aşağı örnek (18000 x g, 4 ° C, 2 dk) ve süpernatant atın. Pelet-20 ° C kadar analiz (adım 1.11) için kullanıma hazır tutun.
  8. Pipetting 1.2 mL 1 M IPTG stok çözeltisi her 3 L kültür çözüm tarafından protein ifade teşvik (son konsantrasyonu 0.4 mM). 16 h (gece) için 14 ° C'de kültür kuluçka devam edin.
    Not: Sıcaklık genellikle ~ 20 ° C IPTG kuluçka makinesi performans bağlı olarak eklenir zaman ulaşmış.
  9. 1.7. adımda açıklanan yordamı takip overexpression, SDS-sayfa analizi için kültür sonrası indüksiyon örneğini alın.
  10. Santrifüjü 1 L tüpler (3993 x g, 4 ° C, 10 dk) tarafından hücreleri hasat. Süpernatant atmak, hücre Pelet buz üzerinde tutun ve doğrudan arıtma için devam edin.
  11. Overexpression SDS-sayfa35,36tarafından analiz. Tampon ve 2 boya yükleme x 20 µL çalışan 20 µL öncesi ve sonrası indüksiyon örnekleri resuspend. Örnekleri 95 ° c ısı blok 5 min için ısı ve 20 µL % 15 jel hala sıcak iken üzerine yükleyin. 90 dk için jel Coomassie ile V. leke Jel Boya üreticisinin yönergelerine göre 180 çalıştırın. Şekil 1C' deki temsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.
    Not: Burada protokol durdurulur, hücre Pelet donmuş ve birkaç hafta için-80 ° C'de depolanan. En iyi sonuçlar için bu taze bakteriyel Pelet kullanın ve donma önlemek için tavsiye edilir. Donma-çözülme hücre lizis ve Httex1 bozulma neden. Bu verim ve protein kalitesini düşürebilir.

2. hücre lizis ve arıtma onun6-SUMO Httex1 füzyon Protein ile immobilize Metal benzeşme Kromatografi (IMAC)

  1. 2 L cam şişe içinde A tamponunun hazırlamak (50 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 500 mM NaCl, 15 mM imidazole). 1 litre arabellek B (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole pH 7,4) bir cam şişe hazırlayın. Tuz eriterek sonra 10 N HCl ile pH ayarlama ve çözümler taze şişe şişe ilk filtre (0.65 µm) ile filtre. 1000 x phenylmethylsulfonyl florür (PMSF, 0,3 M) hazırlamak stok çözüm, 100 µL ve mağaza-20 ° C'de aliquot
    Not: Protokol ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) arıtma ve 8-9 h içinde lyophilization lizis bakteriyel Pellet üzerinden tüm adımları tamamlamanızı etkinleştirmek için tasarlanmıştır. Toplama ve proteolizis sınırlamak için hızla duraklatma olmadan çalışmak ve tüm adımları 4 ° C'de veya buz üzerinde gerçekleştirmeniz önerilir.
  2. PMSF hisse senedi çözüm ve proteaz inhibitörü beş tablet (1 son hacim 30 mL başına) 100 µL önceden soğutulmuş arabelleği A. Ekle arabellek bakteriyel Pelet 100 mL ekleyin ve süspansiyon karıştırma bir manyetik heyecan çizgiyle ve yukarı ve aşağı wi pipetting homojenize TH 10 mL steril pipet (~ 30 dk).
  3. Aliquots 50 mL tek kullanımlık plastik tüpler 40 ml bakteri süspansiyon bölün. Her aliquot bir su/buz toplu iş hücre lizis (% 70 genlik, toplam sonication zaman 5 dk, 30 s sonication, 30 s Duraklat aralıklarla) için solüsyon içeren temizleyicide.
    Not: Örnek sonication adımı sırasında ısınmaya değil ki önemlidir. Bu ısı dağılımı sonication sırasında geliştirmek için buz banyosu biraz su eklemek için tavsiye edilir. Sonication yordam farklı bir gereç kullanılırsa adapte gerekebilir. Fransız basın veya bir microfluidizer gibi diğer lizis yöntemleri de çalışması gerektiğini ve Isıtma örnek ve protein toplayıcı önlemek yararlı olabilir. Bu cihazlar bizim laboratuvar olarak mevcut değildi ve biz bizim sonication protokolü ile iyi sonuçlar elde.
  4. Lysate Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) analizi için 50 µL örneğini alın. Örnek (18000 x g, 4 ° C, 2 dk) santrifüj kapasitesi ve yeni bir test tüpü içinde çözünür kesir pipette. Çözünmez kesir 50 µL arabelleği A bir pipet ile resuspend. Buz üzerinde örnekleri SDS-sayfa Analizi (adım 2.6) kadar tutun.
  5. Santrifüjü (39191 x g, 4 ° C, 60 dk) tarafından lysate açıklığa kavuşturmak.
  6. Santrifüjü adımı sırasında hücre lizis adım SDS-sayfa tarafından analiz. 2 boya lysate çözünür ve çözünmez kesir için sırasıyla yükleme x 50 µL ekleyin. 95 ° C'de 5 min için ısı ve 2 µL % 15 jel hala sıcak iken üzerine yükleyin. 90 dk için jel Coomassie ile V. leke Jel Boya üreticisinin yönergelerine göre 180 çalıştırın. Şekil 1C' deki temsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.
  7. Süpernatant (0,45 µm, şırınga filtreleri) filtre. Filtre uygulanmış süpernatant SDS-sayfa Analizi (adım 2.11) için 20 µL örneğini alın.
    Not: Genellikle, 90-100 mL açıklık ve filtre uygulanmış süpernatant hacmi elde edilir. Genellikle 3 şırınga filtre yeterlidir. Filtrasyon hantal ise Santrifüjü hız ve/veya saat artırmayı deneyin.
  8. 4 ° C37bir hızlı performans sıvı kromatografi (FPLC) sistemde immobilize metal benzeşme Kromatografi (IMAC) tarafından açıklanan bakteriyel lysate His6-SUMO Httex1 füzyon protein izole.
    1. Açıklanan doldurmak lysate bir superloop ve yük Ni-NTA sütuna (elimden alındı, temizlenmiş ve üretici rehberine göre reloaded, önceki boş çalıştırmak bir tavsiye edilir) 2 mL/dak geçmek 10 sütun miktarlar (CV, 200 mL) arabelleği A yıkamak için 10 mL/dk ilişkisiz proteinler.
    2. Füzyon proteini ile 2.5 elute CV (50 mL) %100 arabelleği B 2 mL/dak., elüsyon için yükleme ve yıkama 50 mL ve 5 mL kesir boyutunu kullanın. Şekil 1D' deki temsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.
  9. SDS-sayfa Analizi (20 µL) için her kesir örneğini alın ve IMAC kromatografik zirvesine göre füzyon protein içeren kesirleri Havuzu. (2S 3S) Ekle - 1,4 - Bis (sulfanyl) bütan-2,3-diol (DTT) ve L-sistein (son toplama 100 mM) bir toz ve yavaşça tüp ters çevirme tarafından çözülür.
    Not: Deneyimlerimize göre farklı kesirler füzyon protein saflığı karşılaştırılabilir. Bir önlem olarak, kesirler arıtılmış füzyon protein hızlı bir şekilde yüksek konsantrasyonlu kesirleri toplama önlemek için IMAC sonra havuza. Buna ek olarak, doğrudan bir SUMO etiketi ve HPLC arıtma bölünme için devam etmek için tavsiye edilir. Gerekirse, protokol burada durdurulabilir. Füzyon proteinin seyreltilmiş çözüm sıvı azot içinde donmuş-80 ° C'de depolanan ve verim önemli bir azalma olmadan çözdürme sonra saf. Depolama için 24 h 4 ° C'de füzyon proteinin seyreltilmiş çözeltinin da benzer sonuçlar verir.
  10. SDS-sayfa tarafından IMAC analiz. Boya her örnek için yükleme 20 µL ekleyin. Ham malzeme (2.7), ilişkisiz kesir, yıkama kesir ve % 15 jel elüsyon peak her kısmını 2 µL yükleyin. 90 dk için jel Coomassie ile V. leke Jel Boya üreticisinin yönergelerine göre 180 çalıştırın. Şekil 1D' deki temsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.

3. bölünme onun6-SUMO-etiket ve HPLC arıtma

Dikkat: Trifluoroacetic asit (TFA) uçucu sıvı ve neden ciddi yanıklar çok özenle işleyebilir. Bir duman başlıklı tüm işleme gerçekleştirmek ve yeterli kişisel koruyucu donanımları (yani, tek kullanımlık nitril eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü).

  1. Bir 5 L şişede TFA 5 mL plastik bir şırınga ile su (çözelti c: H2O, % 0,1 (TFA). 5 L için ekleyin. TFA 2.5 mL plastik bir şırınga ile Asetonitril 2.5 L şişe için ekleyin (solvent B: Asetonitril, % 0,1 TFA).
  2. HPLC sistemi üretici tarafından önerilen olarak hazırlayın. Temiz bir sütun emin olmak için boş bir çalışma gerçekleştirin.
  3. Füzyon protein ULP1 UPLC (adım 3.5) ile göğüs arası tepki izlemek için ek Önce 100 µL örneğini alın.
  4. Füzyon proteinin 20 mL aktarmak için yeni bir 50 mL Tüp, buz üzerinde kuluçkaya ve 0.4 mL ULP1 stok çözeltisi ekleyin. Kalan füzyon protein buz üzerinde tutun.
    Not: (burada "ULP1" da adlandırılır) O'nun öğesini katalitik parçasında 403-621 Ubikuitin gibi özel proteaz 1 SUMO etiketi ayırmak için kullanıldı. Füzyon proteini cleaved Httex1 daha kararlıdır. Bu tüm toplu SUMO etiketi ayırmak değil önerilir. Bunun yerine, doğrudan ve tamamen HPLC sütun için uygulanabilir bir boyutta aliquots devam edin.
  5. Her 10 dakikada 100 µL ultra performanslı sıvı kromatografi (UPLC) tarafından ilerlemeyi izlemek için bölünme tepki örneğini alın. Örnekleri (18000 devir/dakika, 4 ° C, 2 dk) santrifüj kapasitesi ve 2 µL süpernatant UPLC tarafından analiz (0,25-3 dk % 90 çözücü B a için degrade % 10 üzerinden %10 B 1 dk, bakın üreticisinin araç kullanımı için yönergeler için). Örnek ULP1 eklenmesi önce ve alınan örnekler için elde edilen chromatograms karşılaştırın. Şekil 2Btemsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.
  6. SUMO-bölünme tamamlandıktan sonra (füzyon protein zirvesine UPLC kromatografik ortadan kalkmış ve tamamen yeni görünen SUMO ve Httex1 zirveye dönüştürülür), bir şırınga filtre (0,22 µm) ile örnek.
    Not: SUMO bölünme genellikle çok hızlı (10-20 dk 4 ° C'de) bu nedenle UPLC Analizi 4 dk bir çalışma süresi ile reaksiyon izlemek için değerli bir araçtır. HPLC önce örnek filtreleme arıtma sütun ömrünü artırmak için esas olarak bir önlem olduğunu. Örnek bulanık kapatmamalısınız.
  7. RP-HPLC tarafından filtre uygulanmış örnek arındırmak (% 25-35 çözücü B solvent a, 40 dk 15 mL/dak., degrade (0-10 dk: % 5; 10-12,5 min: 5 %25; 12,5-52.5 min: 25-%35; 52.5-57.5 dk 35-%95; enstrüman kullanımı için üreticinin yönergelerine başvurun). Şekil 2C' deki temsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.
    Not: Httex1 ve onun6-SUMO RP-HPLC ile de ayrı. Ancak, başında ve sonunda tepe içinde kesilmiş Httex1 az miktarda olabilir. Saf malzeme miktarını elde etmek için küçük kesirleri toplamak.
    Uyarı: uygun güvenlik ekipmanları (yani, laboratuvar önlüğü, izoleli eldiven ve bir yüz kalkanı) kullandığınızda kriyojenik sıvılar taşıma.
  8. HPLC kesirler elektro-sprey iyonlaşma kütle spektrometresi tarafından analiz (ESI-MS, Otomatik örnekleyici, 10 µL enjekte, 0.6 mL/dk, solvent akışı: %20 B a, hiçbir sütun başvurun üreticisinin araç kullanımı için yönergeler için) ve UPLC (degrade üzerinden % 10-% 90 0.25-3 dk, 1 dk, %10 B a B solvent deyimleri üreticisinin araç kullanımı için yönergeler). Kesirler 50 mL Plastik tüpler benzer saflık havuz, sıvı nitrojen içinde dondurma ve lyophilize. Tartmak ve lyophilized protein 2 mL Plastik tüpler içine aktarın ve -20 ° C'de depolayın
  9. Arıtılmış malzeme UPLC, ESI-MS ve SDS-sayfa tarafından karakterize. Httex1 liyofilize 1,5 mL tüp içinde düzgün TFA 8 µL içinde 100 µg dağıtılması ve kapalı test tüpü içinde oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Dikkatle azot veya argon akışı ile bir duman örtünün altında TFA buharlaşır. Örnek kayıplarını önlemek için azot/argon düşük basınç uygulayın.
    1. H2o 2 analiz µL UPLC tarafından 100 µL ve ESI-MS tarafından 5 µL olduğu gibi adım 3.8 protein geçiyoruz. 2 boya yükleme x 20 µL ile mix 20 µL protein çözüm.
    2. SDS-sayfa tarafından 10 µg için 1 µg miktarda analiz. 90 dk için jel Coomassie ile V. leke Jel Boya üreticisinin yönergelerine göre 180 çalıştırın. Şekil 2Dtemsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.

4. yükünün ve Resolubilization Httex1 proteinlerin

Dikkat: TFA uçucu sıvı ve neden ciddi yanıklar çok özenle işleyebilir. Bir duman başlıklı tüm işleme gerçekleştirmek ve yeterli kişisel koruyucu donanımları (yani tek kullanımlık nitril eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü).

  1. Dulbecco'nın tamponlanmış fosfat salin (DPBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) 50 mL tüp içinde premix toz üzerinden 10 mL hazırlayın. Her kullanımdan önce 0.2 µm filtresi ile DPBS çözüm filtre.
  2. Httex1 liyofilize 1,5 mL tüp içinde düzgün TFA 12 µL içinde 150 µg dağıtılması ve kapalı test tüpü içinde oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Dikkatle azot veya argon akışı ile bir duman örtünün altında TFA buharlaşır. Örnek38kayıplarını önlemek için azot/argon düşük basınç uygulayın.
    Not: genel olarak, dağıtılması ve protein 50 µg disaggregate 4 µL TFA kullanın. Bu yordamı bir film protein içeriden yaratacak tüp duvarlarını. Httex1 hemen toplama aşağıdaki adımlarda önlemek için önceden soğutulmuş arabellekleri ile çalışmak, protein her zaman buz üzerinde tutmak ve yüksek konsantrasyonda kaçının.
  3. Önceden soğutulmuş DPBS 1 mL dağınık protein dağıtılması ve pH 7.2-7,4 1 M NaOH ile için ayarlayın. Protein çözüm 100 kDa santrifüj filtreden 1,5 mL Plastik tüpler (20000 x g, 4 ° C, 20 dakika) içine filtre.
    Not: Httex1 hesaplanan teorik konsantrasyonu mümkün kaybı için hesap için istenen son konsantrasyon yüksektir. Filtrasyon, protein dağılması sırasında oluşmuş herhangi bir toplamları kaldırmak için gerekli bir adımdır.
  4. Amino asit Analizi (λ214, algılama) temel alan bir UPLC kalibrasyon eğrisi kullanarak Httex1 konsantrasyonu belirlemek ve 2 µg protein konsantrasyonu10doğrulamak için amino asit analizi için gönderin. 3 µM bir konsantrasyon elde etmek için eklenmesi gerekir DPBS miktarını hesaplamak Httex1.
  5. Protein 3 µM için test tüpü DPBS hesaplanan miktarı ekleyerek sulandırmak. Tüp buz üzerinde toplama Protokolü başlatma kadar tutun.
    Not: 43Q değil depolanması gereken çözüm Httex1. Her zaman yukarıdaki protokolüne dayanan bir taze protein çözüm hazır olun. Httex1 proteinlerin en iyi-20 ° C'de lyophilized bir toz olarak depolanır

5. izleme toplama kinetik, UPLC ve dairesel Dichroism (CD) spektroskopisi ve toplamları transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından karakterizasyonu kullanarak Httex1 43Q,

  1. Uranyl Format çözüm daha önce raporlanmış39TEM için hazır olun.
  2. Httex1 toplama başlatmak DPBS 3 µM çözeltilerine 37 ° C'de (kullanım yükünün protokolünde yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan çözeltinin 1 mL) kuluçka tarafından 43Q.
    Not: İhtiyaç ve amaçları deneme bağlı olarak daha yüksek konsantrasyonlarda Httex1 toplama gerçekleştirilebilir.
  3. Belirtilen süre noktalarda (0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 ve 120 s) adlı UPLC kullanarak çözünür protein miktarı ölçmek. Bunu yapmak için 35 µL bir aliquot ve çözünmez toplamları Santrifüjü (20000 x g, 4 ° C, 20 dk) tarafından sökün. Süpernatant ile 4 µL UPLC enjekte. Çözünür monomer enstrüman yazılım 40kullanıp tepe alanını değişiminde temel oranı hesaplar. Şekil 3Atemsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.
  4. İkincil yapı 48 h 0 CD spektroskopisi kullanılarak değişimler karakterize. 100 µL bir aliquot al ve ellipticity ölçmek (1 mm kuvars küvet, 195 nm 250 nm, 20 ° C, veri noktaları her 0.2 nm, hız 10 nm/dak, dijital entegrasyon zaman 2 s, bant genişliği 1.0 nm). Örnek ve ortalama 6 spectra elde etmek ve 99 evrişim genişliği ile binom filtre kullanarak pürüzsüz. Spectra kötü kalıntı molar ellipticity (θMRE)41arsa. Şekil 3Btemsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.
  5. TEM göre toplamları yapısal ve morfolojik özellikleri karakterize. Protein çözüm 3 µL üzerine bir Formvar/karbon-kaplı 200 mesh, kızdırma taburcu bakır ızgara 1 dk. yıkama 15 μL su, % 0,7 (w/v) uranyl format ve leke 30 15 μL ile bir kez iki kez kılavuzla koymak % 0,7 w/v uranyl Format 15 μL bir iyimsersin. Izgaraları TEM çözümlemesi gerçekleştirin. Şekil 3Ctemsilcisi sonuçları ile karşılaştırılması.

Representative Results

Httex1 E. coli bir N-terminal ile ifade onun6-SUMO etiket. İfade ve arıtma füzyon proteinin temsilcisi sonuçları Şekil 1' de özetlenmiştir. Çünkü Met1 tam i ciddi vivo içinde42Htt ve Ala2 ile başlar 2-90 kalıntılarının Httex1 dizisi oluşur. Tam sırası ifade füzyon proteinin Şekil 1içindeAgösterilir, amino asitler numaralandırma 23Q değişkenine anlamına gelir. Plazmid, yakın bir gelecekte toplumla paylaşılması gereken Addgene yatırılacaktır. Plazmid ve ifade füzyon protein bir şematik resim 1'Bgösterilir. His6-SUMO Httex1 bir orta seviye (Şekil 1C) ifade eder ve en füzyon proteinin çözünür kesir mevcut lizis, 23Q ve 43Q değişken için hem de sonra. Füzyon proteini beklenen, daha yüksek molekül ağırlıklı dayalı geçirir. Bu kısmen nedeniyle SUMO güçlü kat ama çoğunlukla Httex1, esas olarak glutamin ve prolin kalıntılar içeren alışılmadık sıra bileşimi nedeniyle değildir. Wildtype (23Q) ve (43Q) mutant füzyon protein zenginleştirilmiş ~ %80 saflık için ana protein Co arındırıcı varlığını Httex1 ve büyük örnek nispeten düşük ifade düzeyi tarafından açıkladı IMAC (Şekil 1D) tarafından sütuna uygulanan birim.

Onun göğüs arası6-SUMO etiket ve Httex1 arınma Şekil 2içindeAgösterilir. UPLC bölünme onun izlemek için verimli bir araçtır6-SUMO etiket (Şekil 2B). Füzyon proteini özgün zirvesine tüketilen ve onun karşılık gelen iki yeni ve iyi ayrı doruklarına6-SUMO etiket ve Httex1 görünür. Bölünme reaksiyon 10-20 dk içinde sona erdi. Western Blot (WB) bölünme tepki verimli bir şekilde izlemesini çok yavaştır, ancak başvuru ve SUMO bölünme completeness göstermek için şekilde dahil. Her iki Httex1 23Q ve 43Q de onun ayrılabilir6-SUMO tag RP-HPLC (Şekil 2C) ve yüksek saflık UPLC, MS ve SDS-sayfa Analizi (Şekil 2D) tarafından gösterildiği gibi elde edilmiştir.

Bu yöntem tarafından hazırlanan Httex1 protein Httex1 beklenen toplama özelliklerini korumak, mutant Httex1 37 ° C'de fibrillization kinetik sedimantasyon tahlil tarafından değerlendirildi göstermek için CD tarafından ikincil yapı değişiklikleri izlenen Spektroskopi ve TEM göre toplamları morfolojisi ile karakterizedir. Şekil 3' teAtoplama kinetik sedimantasyon tahlil tarafından belirlenen mHttex1 fibril oluşumu temsil eden veri kümesi gösterilir. Fibril oluşumu nedeniyle zamanla 43Q UPLC tarafından sayısal çözünür Httex1 kaybı. Biz tam bir çözünür protein tükenmesi, kuluçka 48 saat sonra görmekteyiz. Ayrıca, ikincil yapı protein CD spektroskopisi (Şekil 3B) tarafından belirlenir. Httex1 43Q vardiya üzerinden yapılandırılmamış (λmin 205 nm) esas olarak β-yapraklık zengin uyum (λmin 215 nm), kuluçka 48 saat sonra için. Bu yapısal değişim TEM göre olarak gözlemlenebilir uzun fibriler toplamları oluşumu, 48 saat (Şekil 3C) eşlik ediyor.

Figure 1
Resim 1 . İfade ve arıtma onun6-SUMO Httex1 füzyon proteini. 
(A) onun amino asit dizisi6-SUMO-Httex1-QN füzyon yapıları (onun6-SUMO yeşil ve turuncu Httex1-QN ); (B) şematik genel ifade ve arıtma füzyon proteinin; (C) ifade ve çözünürlük lizis sonra; füzyon proteinin SDS-sayfa Analizi (D) kromatografik füzyon proteinin IMAC arıtma ve kesirler SDS-sayfa tarafından analiz (kırmızı çubuk: ilişkisiz kesir, mavi bar: yıkama kesir, siyah bar: elüsyon tepe içeren kesirler); Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Bölünme onun6 SUMO etiket ve etiket içermeyen Httex1-QN proteinlerin saflaştırılması.
(A)şematik genel bakış; (B) analizi ULP1 UPLC tarafından SUMO etiketiyle dekolte (mavi: ULP1; toplamadan önce siyah: 20 min (23Q), sırasıyla 10 min (43Q) ULP1 yanı sıra sonra) ve WB (MAB5492 1:2000, ikincil keçi anti fare antikor 1: 5000); (C) kromatografik Httex1 partiye hazırlık RP-HPLC arınma; D: UPLC tarafından arıtılmış Httex1 Analizi SDS-sayfa ve ESI-MS; beklenen molekül ağırlığı 9943 Da (23Q) ve 12506 Da (43Q) sırasıyla var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Toplama Httex1-43Q: (a)sedimantasyon tahlil UPLC üzerinde dayalı. (B) 0 h ve 48 h. (C) TEM Filmler, 48 h toplamları ikincil yapılara sahip CD spectra (ölçek çubukları çoğu 200 nm). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Alma miligram miktarda yerli, etiketlenmemiş için Httex1 bu protokol için biz verimli bir yordam belirttiğimiz 23 ya da 43 glutamin kalıntılar içeren. Bu bir onun bir C-terminal fusion olarak Httex1 ifade ederek başarıldı6-IMAC tarafından lysate hücreden füzyon proteini izole etmek için kullanılır ve Httex1 HPLC arıtma önce i ciddi SUMO etiketi. SUMO strateji birkaç diğer proteinler üretiminde kullanılan iken, bizim Yöntem SUMO özünde oluşturmak için de kullanılabilir benzersiz özellikleri, toplama eğilimli, daha önce olduğu kanıtlanmıştır amyloidogenic protein düzensiz olduğunu gösterir 43,44üretmek ve işlemek son derece zor. Biz bir "su kuyusu-davranmak" protein üretimi için basit, kullanımı kolay ve bir iletişim kuralına benzer bir iletişim kuralı mevcut. SUMO fusion solubilizes ve Httex1 ifade ve IMAC arıtma adım sırasında stabilize. İntein strateji10 ve toplama ile gözlemlediği gibi etiketin erken bölünme olduğunu artık bir sorun.

Özünde düzensiz protein yıkımı için özellikle güvenlik açığından etkilenir. N-terminal bozulması N17 bölgesinde bu iletişim kuralını kullanan bir mesele değil, truncations Httex1 PRD içinde gelişebilir. Kesilmiş proteinler hydrophobicity, ücret ve boyut olarak Httex1 için çok benzer gibidir, kromatografik yöntemle çıkardıktan meydan okuyor, böylece ilk etapta onların oluşumunu önlemek en iyisidir. Yakından protokole yapışma, her zaman buz üzerinde çalışma ve proteaz inhibitörü yeterli miktarda kullanarak gözlenen kesme düzeyi çok düşük tutmak yardımcı olacaktır. Kesilmiş protein benzeşme etiketi de kaybetmek gibi bir füzyon etiketi C-terminus Httex1 in itibariyle uygulamak truncations PRD kolayca kaldırabilirsiniz. Ancak, yerli dizi prolin ve bizim bilgimize Httex1 sona ererken bu seçeneği uygulanamaz muhafaza edilmesi gerekiyorsa traceless ve verimli bölünme prolin sonra ikna etmek için bilinen hiçbir C-terminal füzyon Etiketler vardır.

En önemli protokol SUMO etiketi bölünme sonra ULP1 tarafından kurtarılmış Httex1 işlenmesi parçasıdır. Protein hemen RP-HPLC tarafından saf. Neyse ki, bu genellikle 10-20 dk 4 ° C'de tamamlanır bir verimli ve hızlı tepki Buna ek olarak, intein strateji birkaç saat böylece verimi en üst düzeye çıkarmak için eksik bölünme ve başlangıç toplama arasında bir denge gerektiren intein, tam bölünme için gerekli. O-ecek başlamak gibi hızlı bir iş Httex1, mutant için gereklidir 23Q değişken daha uzun süre stabil ise nispeten yüksek konsantrasyon bölünme reaksiyon mevcut toplanacak. RP-HPLC arıtma sırasında SUMO bir diğer avantajı ortaya çıkıyor: Ssp DnaB intein hidrofobik ve sopalarla güçlü sütuna iken, SUMO daha Hidrofilik ve tamamen C4 ters faz sütundan elutes. Ticari ULP1 oldukça pahalıya mal olsa da, protein yüksek verim daha önce yayımlanmış protokolleri29takip kolayca üretilmektedir.

Httex1 kullanmadan önce yükünün iletişim kuralı uygulayarak kritik öneme sahip olamaz yeterli vurguladı. PolyQ liyofilize proteinler Httex1 gibi stabildir ve saklı uzun süre olabilir ama su ve arabellekleri tamamen çözünür değildir. Varlığı ön şekillendirilmesi reaksiyonlar ya liflerinde toplama kinetik ve protein45biyofiziksel özellikleri üzerinde önemli bir etkisi olabilir. Burada açıklanan yükünün iletişim kuralı yükünün protein, ön şekillendirilmesi toplamları kaldırılması ve lyophilized bir örnek üzerinden monomeric Httex1 lik üretimi sağlar. SUMO ve intein strateji ile elde Httex1 için benzer toplama kinetik ve fibril görünümdeki görülmektedir.

Httex1 üretimi için önceki yöntemleri ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan SUMO strateji birçok avantaj sunar ve yapısı araştırmak için olası çalışmalar aralığını ve sağlık ve hastalık bu proteinin fonksiyonel özellikleri genişletir. SUMO-Httex1 füzyon proteini kolay, bu donmuş ve depolanan veya ücretsiz mHttex1 hızlı bir şekilde toplamak çözüm için 24 saat içinde ortam sıcaklığında tuttum. İstikrar ve SUMO-Httex1 füzyon proteinlerin yüksek çözünürlük protein işlemek ve/veya aksi takdirde sonra bölünme mümkün olmazdı mHttex1 içine enzimatik ve kimyasal değişiklikler tanıtmak için büyük esneklik sağlar. Bu giriş içerir translasyonel modifikasyonlar, fluorophores, spin etiketleri, biotin Etiketler, vb burada sunulan gelişmeler 1 olmalıdır) Httex1; ilişkilerin yapı-fonksiyon aydınlatmak için gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak 2) Htt toplama ve patoloji yayılan araştırmak için yeni araçlar oluşturur; 3) mutant Httex1 stabilize etmek ve onun toplama önlemek moleküller tanımlamak için yeni deneyleri geliştirme sağlamak; ve 4) bilim adamları diğer alanlardan bu protein üzerinde çalışmak ve Huntington hastalığı için tedaviler bulmak için bizim macera katılmak getirmek için teşvik ediyoruz.

Disclosures

Yazarlar bu makalenin içeriği ile hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Acknowledgments

Bu eser öncelikle hibe CHDI Vakfı ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından finanse edildi. Biz Dr Sophie Vieweg yararlı tartışmalar için bu yeni ifade sisteminin geliştirilmesi ve Lashuel grubunun diğer üyeleriyle sırasında bu ifade sistemi ile deneyimlerini paylaşmak ve giriş ve değerli geribildirim için teşekkür ederiz. Biz de Prof. Oliver Hantschel ULP1 plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar Dr John B. Warner ve Dr Senthil K. Thangaraj el yazması kritik İnceleme için teşekkür ederiz

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) EMS 22450
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids EMS FCF200-Cu-50
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics HellmaAnalytics 110-1-40
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA Witech SVA4730203
Ampicillin AxonLab A0839.0100
Luria Broth (Miller's LB Broth)  Chemie Brunschwig 1551.05
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) AxonLab A1008.0025
E. coli B ER2566 NEB NEB# E4130
Imidazole Sigma 56750-500G
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 Merck Millipore Corporation MAB5492
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) Licor 925-68070
PMSF AxonLab A0999.0005
HisPrep 16/10 column  GE Healthcare 28936551
C4 HPLC column Phenomenex 00G-4168.P0     10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed
Acetonitrile HPLC MachereyNagel C2502
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile Sarstedt AG 83.1826
Spectrophotometer semi-micro cuvette Reactolab S.A. 2534
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml GE Healthcare 18111382
Trifluoroacetic acid Sigma 302031
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml Greiner Bio-One 7.160 102
 100 kD Microcon  fast flow filters Merck Millipore Corporation MRCF0R100
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor Sonics
Äkta 900 equipped with a fraction collector  GE Healthcare
Jasco J-815 Circular Dichroism Jasco
Waters UPLC system  Waters C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column  , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL
waters HPLC system Waters 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing
ESI-MS: Finnigan LTQ Thermo Fisher Scientific
lyophylizer instrument FreeZone 2.5 Plus
Tecnai Spirit BioTWIN  FEI electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV
37 °C shaking  incubator Infors HT multitron Standard
Biophotometer plus Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saudou, F., Humbert, S. The Biology of Huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  2. MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. Huntington's disease. Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).
  3. Li, S., Li, X. J. Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease. Molecular Neurodegeneration. 1, 19 (2006).
  4. DiFiglia, M. Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  5. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  6. Sathasivam, K., et al. Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).
  7. Mangiarini, L., et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell. 87 (3), 493-506 (1996).
  8. El-Daher, M. T., et al. Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation. EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).
  9. Lunkes, A., et al. Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).
  10. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  11. Georgalis, Y., et al. Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).
  12. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  13. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  14. Muchowski, P. J., et al. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).
  15. Heiser, V., et al. Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).
  16. Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation. Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).
  17. Tam, S., et al. The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).
  18. Nekooki-Machida, Y., et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).
  19. Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).
  20. Legleiter, J., et al. Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).
  21. Legleiter, J., et al. Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).
  22. Nucifora, L. G., et al. Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).
  23. Dahlgren, P. R., et al. Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation. Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).
  24. Poirier, M. A., et al. Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).
  25. Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy. Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).
  26. Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells. Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).
  27. Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation. Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).
  28. Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils. Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).
  29. Malakhov, M. P., et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).
  30. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  31. Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility. Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).
  32. Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System. Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).
  33. Reif, A., et al. Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6. Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).
  34. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  35. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).
  36. Lawrence, A. M., Besir, H. U. Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  37. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  38. Chen, S. M., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
  39. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  40. O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).
  41. Greenfield, N. J. Analysis of circular dichroism data. Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).
  42. Aiken, C. T., et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).
  43. Satakarni, M., Curtis, R. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).
  44. Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin. Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).
  45. Chen, S., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).

Tags

Biyokimya sayı: 136 HD Huntington hastalığı huntingtin ateş polyglutamine polyQ toplama liflerinde SUMO fusion teknolojisi protein ifade ve arıtma
Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J.,… More

Reif, A., Chiki, A., Ricci, J., Lashuel, H. A. Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy. J. Vis. Exp. (136), e57506, doi:10.3791/57506 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter