Summary
Vi præsenterer en metode, der kan give yderligere indsigt i de tidlige begivenheder underliggende neurodegeneration og baseret på den etablerede ex-vivo hjerne teknik, kombinerer fordelene i vivo og in vitro- eksperimenter. Desuden, det repræsenterer en enestående mulighed for direkte sammenligning af behandlede og ubehandlede gruppe samme anatomiske plan.
Abstract
På trods af talrige undersøgelser, der forsøger at udvikle pålidelige dyremodeller som afspejler primære processer underliggende neurodegeneration, kan meget få er blevet bredt accepteret. Her foreslår vi en ny procedure tilpasset fra den velkendte ex vivo hjernen skive teknik, som giver en tættere i vivo-ligesom scenario end in vitro- præparater, for at undersøge de tidlige begivenheder udløser celle degeneration, som observeret i Alzheimers sygdom (AD). Denne variant består af simple og let at reproducere trin, hvorved bevarelsen af de anatomiske cytoarchitecture af regionen valgte hjernen og dens lokale funktionalitet i en fysiologisk milieu. Forskellige anatomiske områder kan fås fra den samme hjerne, giver mulighed for at udføre flere forsøg med de pågældende behandlinger på et websted-, dosis- og tidsafhængig måde. Potentielle begrænsninger, som kan påvirke resultaterne relateret til denne metode er relateret til bevarelse af væv, dvs, vedligeholdelse af sin anatomiske integritet under udskæring og inkubering trappe og snittykkelse, som kan påvirke den biokemiske og immunhistokemisk analyse. Denne fremgangsmåde kan anvendes til forskellige formål, såsom at udforske molekylære mekanismer involveret i fysiologiske eller patologiske betingelser, stof screening eller dosis-respons assays. Endelig, denne protokol kan også reducere antallet af dyr, der er ansat i adfærdsmæssige undersøgelser. Programmet rapporteret her har været for nylig beskrevet og testet for første gang på ex vivo rotte hjernen skiver indeholdende den basale forhjernen (BF), som er en af de cerebrale regioner primært påvirket i Annoncen. Specifikt, er det blevet påvist, at administrationen af et giftigt peptid afledt af C-terminus af acetylcholinesterase (AChE) kunne bede en annonce-lignende profil, langs antero-posterior akse af BF, udløser en differentieret udtryk for proteiner ændres i Annoncen, som den alpha7 nicotinsyre receptoren (α7-nAChR), fosforyleret Tau (p-Tau) og amyloid beta (Aβ).
Introduction
Annonce er en kronisk patologi karakteriseret ved gradvis neurodegenerative værdiforringelse påvirker forskellige hjernen områder, såsom entorhinal cortex (EF), BF, hippocampus (HC) og olfaktoriske pære (OB)1,2,3, 4,5. De sene stadier af annonce udvikling føre til en progressiv kognitiv tilbagegang, gør denne sygdom den mest almindelige form for demens, ca tegner sig for 70% af alle tilfælde6. Trods omfattende forsøg på at forstå de indledende faser forårsager annonce, er der ikke i øjeblikket en defineret eksperimentelle indikation belyse dem. Desuden de mest populære teori - den "amyloid hypotese" - er i stigende grad spørgsmålstegn ved da det ikke giver en komplet profil i forklare AD pathobiology, og heller ikke et farmaceutisk mål, der har vist sig effektiv7,8 ,9.
En alternativ teori, som får stigende opmærksomhed tyder på, at de oprindelige mekanismer opstår under neurodegeneration er relateret til en neuronal klynge primært modtagelige i AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. denne heterogene cellulære hub omfattede i BF, midthjernen og hjernestammen, projekter til flere regioner, som EF, HC og OB15,16. Trods sin mangfoldighed i neuronal morfologi og neurotransmitter syntese deler denne kerne af cellerne et fælles træk i at udtrykke smerte, som også kan have en ikke-enzymatisk funktion17,18. Denne ikke-klassisk rolle som en roman, signalering molekyle medierer calcium (Ca2 +) flow til neuroner, som kan gennemgå trofiske eller toksiske hændelser i forbindelse med Ca2 + dosis, tilgængelighed og neuronal alder17,18 , 19.
Under neurodegeneration, kan den observerede cellulære tab knyttes derfor til denne ikke-enzymatisk funktion17,18,20, der tilskrives en 30mer peptid (T30) kløvet fra AChE C-terminus 20. i overensstemmelse med tidligere resultater, foretaget på cellekultur og optiske billeddannelse18,21 præparater, vi viste, gennem en ny tilgang baseret på ex vivo rotte hjernen skiver indeholdende BF strukturer, der T30 induceret en annonce-lignende profil22. Specifikt, tilbyder denne nye metode en mere fysiologisk scenario end cellekultur, da det har bevaret mange af egenskaber ved en intakt væv, lige fra anatomiske til kredsløb bevarelse, omend til et tidsvindue på timer. Vi anvendte denne protokol for at udforske de begivenheder, der finder sted i de tidlige faser af neurodegeneration, overvågning af den akutte reaktion efter T30 ansøgning.
Trods den store krop af litteratur om brug af hjernen skiver at undersøge molekylære veje underforstået i neuronal skade eller neurogenese23,24, denne protokol giver for første gang en mere umiddelbar og følsomme oplæste sammenlignet til fælles brug af organotypic skiver. Men, som er tilfældet for organotypic hjernen sektioner, denne akut skive procedure kan også vedtages til flere formål, såsom evaluering af neuroprotektive eller neurotoksiske molekyler, opdagelsen af primære molekylære forandringer i en bestemt proces, immunhistokemisk analyse og farmakologiske assays til centralnervesystemet relateret patologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle animalske undersøgelser er blevet udført under godkendte protokoller.
Bemærk: I dette afsnit, rækkefølgen af de vigtigste faser udføres under forsøgsmetoden og foreslog gang interval er fastsat (figur 1). Desuden er en trinvis beskrivelse af protokollen suppleret med en illustrativ panel, viser kritisk handlinger lige fra hjernen fjernelse til væv homogenisering efter inkubationstid (figur 2). Detaljer vedrørende materialer og instruktioner til at bygge apparatet og den efterfølgende fase for WB analyse er tidligere beskrevet22.
1. kirurgiske værktøjer, Vibratome indstillinger og behandling forberedelse
Bemærk: Udføre følgende trin før du starter forsøgsmetoden:
- Udarbejde to forskellige kunstige cerebrospinal væsker (aCSFs), en bruges til hjernen udskæring og den anden til inkubation skridt som tidligere beskrevet29. Kort, arbejder koncentrationer (i mmol) af de to aCSFs er på "udskæring" aCSF: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1,2 KH2PO4og 10 glucose; 6.7 HEPES salt og 3,3 HEPES syre; pH: 7.1. Samtidigt med at nemlig den "optagelse" aCSF: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4og 10 glucose; pH: 7.1.
- Opløsninger blandes godt og derefter lagt på is og oxygenat de udskæring aCSF for at have det koldt mens at fjerne hjernen og den efterfølgende skæring. Holde ved stuetemperatur (RT) og levering ilt til optagelse aCSF.
- Placer instrumenterne under dissektion hood for afhugning af hovedet og hjernen fjernelse, dvs, guillotine, kirurgisk dissektion kit (saks, pincet, vinger), og spatel.
- Konfigurer parametrene vibratome ved at vælge skive tykkelse (300 µm i denne forberedelse) og frekvens på 7 og hastighed på 6. Indsæt vibratome sal i sin passende plads og omgiver det med is.
- Åbne carbogen (95% O2, 5% CO2) ventil for at oxygenat de "udskæring" (aCSF) under hjernen skæring. Vælg den mindste flow omkring 2 mL/min.
- Tage to 15 mL rør til at forberede betingelser at teste. Tilføj i en tube 10 mL af "optagelse" aCSF alene (kontrolgruppen) og de andre, 10 mL af den "optagelse" aCSF beriget med T30 ved en koncentration på 2 µM (behandlede gruppe). Vortex både rør og holde dem på køl indtil deres brug i forberedelsesfasen setup (afsnit 3).
2. anæstesi, hjernen udvinding og udskæring
Bemærk: I denne undersøgelse, 9 vildtype P14 mandlige Wistar rotter blev brugt. Hjernen ekstraktion og efterfølgende udskæring udgør en vigtig del af protokollen, da de hurtigt skal udføres (inden for 10 min) for at forebygge eller i det mindste bremse væv degeneration processer.
- Tilføj 1,5 mL 100% w/w for isofluran på en bomuld lag ind i induktion kammeret, placere dyret inde, og luk låget. Vent, indtil dyret er dybt bedøvede, bekræftelse af fravær af den pedal refleks, og derefter halshugge dyret ved hjælp af guillotinen.
- Holde hovedet af dyr inden for en pot indeholdende iskold udskæring aCSF under hjernen fjernelse trin (figur 2A -C).
- Incise huden over kraniet med en kirurgiske kniv, og derefter skære kraniet ved hjælp af saks efter midterlinje fra den bageste del og fortsætte anteriorly indtil nå knoglen ovenfor OBs (figur 2A).
- Trække sideværts de to sider af kraniet ved hjælp af et par pincet for at få adgang til hjernen (figur 2B). Indsæt en spatel ventrally til hjernen, forsigtigt øse den ud, og holde det hydrerede i iskold "udskæring" aCSF i ca 5 min (figur 2 c).
- Afhænde hjernen på filtrerpapir og skære lillehjernen ved hjælp af en vinge (figur 2D). Lim hjerne vertikalt på vibratome disken og indsætte det inde i skæring kammer, fylde den med iskold "udskæring" aCSF, og giver ilt (figur 2E).
- Justere skæring interval, og Fortsæt med hjernen skæring (figur 2F). Indsamle de afsnit, der indeholder regionen af interesse, såsom den mediale septum (MS), diagonal band Broca (DBB), og substantia innominata (SI), som tidligere beskrevet22. Fra top til bund indeholder tre skiver rostralt (R), mellemliggende, (I) og caudale (C) del af BF (fig. 2 g).
- Opdele langs midterlinjen hver sektion med en lille saks, at opnå to spejlende hemislices (figur 2 H), anvendes individuelt som kontrol og behandlede tilstand på samme anatomiske plan.
- Holde hemisections i vibratome afdeling for 5-10 min og derefter overføre dem med et glas afpipetteres i en gennemledning potten indeholder optagelse aCSF. Holde på RT for ca. 30 min. at inddrive.
- Fylde, i mellemtiden, tre hætteglas med 3 mL optagelse aCSF alene (tidligere udarbejdet i trin 1,6 for kontrolgruppen) og tre hætteglas med 3 mL af aCSF beriget med T30 (tidligere udarbejdet i trin 1,6) for den behandlede gruppe.
3. setup forberedelse
- Overførsel af hemisections til deres tilsvarende hætteglas (figur 2I) for at få tre på hinanden følgende hemislices (herunder den rostralt, mellemliggende og caudale BF region) for kontrolgruppen (grøn ramme, figur 2J) og deres matchende modparter i den behandlede gruppe (rød ramme, figur 2J).
- Overføre hjernevæv med to forskellige pensler, én til kontrol hemislices og en anden for de behandlede modstykker, for at forhindre enhver form for kontaminering mellem betingelser.
- Forsegle hver hætteglasset med tilhørende låg, præsenterer den iltning nål (21G) (figur 2J). Tilsluttes carbogen kilde (figur 2 K) den vigtigste rør af apparatet. Levere ilt til hemislices i hele inkubationstiden med en minimal strømningshastighed på 2 mL/min. for at undgå enhver bevægelse af hjernevæv og mulige mekaniske skader under eksperimentet. Start 5 h inkubation. Udfør trin 3.1-3.3 i 5 min.
Bemærk: Check hyppigt (hver 15-20 min) om ilt tilføres i alle hætteglas og at dens flow ikke flytter væv fra bunden.
4. prøven homogenisering
- Stoppe ilt flow efter inkubation og fjerne alle låg fra hætteglassene. Overføre hemislices, ved hjælp af de korrekte pensler i 1,5 mL rør indeholdende 250 µL af lysisbuffer, opretholde rør på is (figur 2 L). For at gøre lysis buffer, bland PBS 1 x med fosfatase og protease-hæmmere cocktails både fortyndet til 1: 100, og homogeniseres væv med forskellige pestles at forhindre forurening blandt prøverne. Komplet disse aktioner inden for 10-15 min.
- Centrifugeres hjernen lysate på 1.000 x g i 5 min. ved 4 ° C. Overføre supernatanten til nye rør og holde prøverne ved-80 ° C.
5. aflæsning af proteinkoncentration og Western Blot analyse
- Protein koncentrationen af hver prøve og efterfølgende forberede Western blot analyse som tidligere beskrevet22delprøver.
- Udføre statistisk analyse for at vurdere effekten af behandling på protein udtryk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen præsenteres her angiver, at administrationen af et giftigt peptid, T30, modulerer på et websted-afhængige måde udtryk for α7-nAChR, p-Tau og Aβ i BF-holdige sektioner (figur 3A). Nicotinsyre receptoren viser en betydelig stigning i den rostralt-behandlede hemislice i forhold til modstykket kontrol (Skive 1, p = 0.0310) (figur 3B), mens den mellemliggende skive ikke afslører ændringer mellem to betingelser ( skive 2, p = 0,1195) (figur 3B). I den posteriore del en betydelig reduktion er til stede i den T30-eksponerede del over sin kontrol side (Skive 3, p = 0.0476) (figur 3B). Efter T30 ansøgning, p-Tau niveauer er steget betydeligt i den forreste region mod kontrolelementet matchende side (Skive 1, p = 0.0158) (figur 3 c). På den anden side de andre to BF-holdige afsnit viser ikke nogen væsentlig forskel mellem betingelserne (skive 2, p = 0.1014; skive 3, p = 0.6405) (figur 3 c). Efter T30 eksponering, Aβ er væsentligt forbedret i den rostralt og mellemliggende hemisections sammenlignet med deres ubehandlede kontralaterale portioner (Skive 1, p = 0.0136; skær 2, p = 0.0109) (figur 3D). I de caudale skive, der er ingen ændring mellem de to behandlinger (Skive 3, p = 0.1231) (figur 3D). Den primære antistof mod p-Tau genkender epitop indeholdende fosforyleres Ser202 rester. Den primære antistof mod Aβ registrerer flere isoformer, lige fra Aβ37 til Aβ42. Data blev analyseret som tidligere beskrevet22 ved hjælp af to tailed parret t-test og repræsenteret som SEM. N = (hemislices pr. gruppe rotter) er (27, 9).
Figur 1: sekvens og den vejledende tidsplan for de vigtigste trin udføres under forsøgsmetoden. Tidsintervallet til at fuldføre det første og tredje trin kan variere i forhold til operatørens erfaringsniveau. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sekventielle trin illustrerer protokol progressionen. (En-D) Udvinding af hjernen fra kraniet og adskillelse af lillehjernen fra resten af hjernen. (E) udlæg i hjernen på vibratome disken og overførsel til dissektion kammer, som er omgivet af is og fyldt med kold aCSF konstant iltet under den udskæring. (F) koronale hjernen skæring. (G) indsamling udsnittene, der indeholder rostralt (R), mellemliggende, (jeg) og caudale (C) strukturer i den basale forhjernen. (H) adskillelse af sektionerne i to matchende hemislices. (jeg) hver hemisection er placeret i dens tilsvarende hætteglas. (J) hætteglas placeret i støtte, inde i boksen apparater og lukket separat. (K) inkubation periode efter tilslutning af system til ilt kilde (sort cirkel). (L) homogenisering af prøverne efter behandlingen. Dette tal er ændret fra22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: T30 medieret lokationsspecifikke udtryk for α7-nAChR, p-Tau og Aβ langs BF rostro-caudale akse. (A) repræsentation af hjernen koronale skiver herunder basale forhjernen kerner (hvide stiplede linjer), opdelt i to komplementære dele og udsat for forskellige vilkår. (B) efter T30 eksponering, nicotinsyre receptoren viser en betydelig stigning i den forreste underrubrik (T30 1) og en markant reduktion i den bageste et (T30 3) i forhold til de tilsvarende kontrol sider (ctrl 1 og ctrl 3). Den mellemliggende skive viser ikke nogen ændring mellem de to betingelser (ctrl 2, T30 2). (C) p-Tau udtryk er betydeligt højere i den behandlede rostralt del (T30 1) over sin kontrol matchende modpart (ctrl 1), mens de andre to skiver ikke afsløre nogen forskel i de to grupper (skive 2 og skive 3). (D) Aβ viser en betydelig stigning i de forreste og mellemliggende behandlede underafsnit (T30 1 og T30 2) sammenlignet med deres tilsvarende ubehandlet sider (ctrl 1 og ctrl 2). I de caudale sektioner er der ingen variation mellem de to grupper. Fejllinjer angive SEM. * p < 0.05.n = (hemislices pr. gruppe rotter) er (27, 9). Skalalinjen er 1 mm. Dette tal er blevet ændret fra22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vigtigste aspekt af denne protokol, baseret på den veletablerede ex vivo hjerne teknik, gør det muligt for at teste synkront to spektakulære hemislices, fremstillet af den samme anatomiske fly, overvåge deres svar efter anvendelsen af en bestemt betingelse (styre eller behandlet); Dette giver derfor en eksperimentel paradigme så stramt kontrolleret som muligt. Mulighed for at vurdere i en tid-, dosis- og områdespecifikke måde forskellige neurochemicals relateret til neuronal værdiforringelse, som set under neurodegenerative begivenheder22, udgør et væsentligt element. Denne metode forbinder fordelene ved en i vivo fysiologiske miljø med dem af in vitro- præparater, såsom nøjagtighed i at opnå det pågældende område, og at skabe den ideelle ekstracellulære kontekst. Denne protokol udgør en tilpasning af den fælles hjernen udskæring procedure bruges til ex vivo elektrofysiologiske optagelser25,26,27 og optiske billeddannelse28, 29,30, eller in vitro- organotypic skiver, der simulerer en tættere i vivo situation ved at aktivere bevarelsen af både strukturelle og synaptic organisation23,24 ,31,32.
Desuden, denne procedure kunne bidrage til at mindske antallet af dyr, der anvendes i adfærdsmæssige undersøgelser, da det delvist replikater en i vivo-som betingelse, som kan vedtages for at bekræfte i vitro data, såsom cellekultur og immunhistokemisk analyse, og derefter forventer, i vivo eksperimenter.
Den foreslåede metode præsenterer også nogle begrænsninger, såsom snittykkelse og integritet, som da ikke relevante, kan ændre det endelige resultat. I inkubationstiden er også en grundlæggende bestanddel af denne teknik, da det kan påvirke sammenligning mellem kontrolgruppen og den behandlede. Derudover en række proceduremæssige eller tekniske problemer kan opstå under alle trin i protokollen, som: (1) mekaniske skader mens udvinding eller skæring i hjernen, som kan undgås ved præcis og skånsom håndtering af væv; (2) flydende af hemislices under inkubation på grund af en overdreven ilt flow, som kan mekanisk skade vævet, hvis det rører iltning nålen nedsænket i aCSF, hvilket påvirker dens integritet. Dette kan forhindres ved at justere til den laveste sats boblende; og (3) manglende eller ubestandig ilt flow, som kan relateres til den tomme dunk, en skade eller afbrydelse i rør system, et stik i den iltning nål, eller hvornår det er ikke korrekt er nedsænket i aCSF. Da den konstant iltning og dens flow under hele proceduren repræsenterer en af de mest kritiske aspekter af denne protokol, er det vigtigt at ofte overvåge alle disse parametre for at opretholde en homogen tilstand mellem de undersøgte grupper.
Andre kritiske trin i protokollen er repræsenteret ved de tid windows skal udføre hver handling, som når efterfulgt vil bevare så meget som muligt integritet og funktionalitet af væv. Derudover for at vurdere disse parametre, kan immunhistokemisk analyse udføres for at påvise specifikke markører relateret til neuronal levedygtighed og elektrofysiologiske optagelser som tidligere beskrevet23,29.
Ud over de resultater, der er beskrevet her, kunne denne metode være designet ad hoc for specifikke undersøgelser. For eksempel, det kan anvendes til: (1) skærm og sammenligne aktiviteten af forskellige stoffer i flere hjernen områder, inkubere dem med den valgte løsning, såsom aCSF eller Neurobasal medium; (2) Udfør undersøgelser på hypoxi, da ilt flow kan styres selektivt i hver hemisection; (3) undersøge hjernen væv egenskaber fra transgene dyremodeller for forskellige sygdomme; (4) samtidig undersøge virkningerne af i vivo ensidige hjernen injektioner på samme anatomiske, og sammenligne dem med kontrol halvkugle; og (5) udforske andre organer eller væv egenskaber, derfor potentielt lette og reducere længden af stof screening forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer konkurrerende finansielle interesser. Susan A. Greenfield er grundlægger og formand for Neuro-Bio Limited, et privatejet selskab og besidder aktier i selskabet. Emanuele Brai og Antonella Cogoni er medarbejdere i Neuro-Bio Ltd.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Neuro-Bio Ltd. Vi vil gerne takke Dr. Giovanni Ferrati og Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) for deres kommentarer og råd om håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical? Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show? Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
