Summary
선물이 추가 neurodegeneration 기본 초기 이벤트에 대 한 통찰력을 제공할 수 설립된 전 비보 두뇌 기술에 기반 한 메서드가 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험의 장점이 결합. 또한, 같은 해 부 비행기에서 치료 및 치료 그룹의 직접 비교를 위한 독특한 기회를 나타냅니다.
Abstract
기본 neurodegeneration을 처리 하는 기본을 반영 하는 신뢰할 수 있는 동물 모델 개발을 시도 하는 수많은 연구에도 불구 하 고 거의 널리 허용 되었습니다. 여기, 우리는 유명한 비보 전 뇌 조각 기술는 가까이 vivo에서제공에서 적응 하는 새로운 절차 제안- 생체 외에서 준비로 세포 변성을 트리거링 초기 이벤트 조사에 대 한 보다 시나리오 처럼 Alzheimer의 질병 (광고)에서 관찰 됩니다. 선택 된 두뇌 지구 및 생리 적인 환경에서의 로컬 기능 해 부 cytoarchitecture의 보존을 가능 하 게 간단 하 고 쉽게 재현 가능한 단계,이 변이 의하여 이루어져 있다. 다른 해 부 지역 사이트-, 복용량-및 시간에 따른 방식으로 문제의 치료와 여러 실험을 수행할 수 있는 기회를 제공 하는 동일한 뇌에서 얻을 수 있습니다. 이 방법론에 관련 된 결과 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 제한 조직, 즉, 자국과 인큐베이션 단계와 섹션 두께 동안 해부학의 무결성의 유지 관리의 보존에 관련 된 어떤 생화학 및 immunohistochemical 분석을 좌우할 수 있다. 이 방법은 생리 적 또는 병 적인 조건, 마약 검사, 또는 복용량 응답 분석 실험에 참여 하는 분자 메커니즘을 탐구 하는 등 다른 용도로 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜 또한 동물 행동 연구에서의 수를 줄일 수 있습니다. 여기에서 보고 된 응용 프로그램은 최근 설명 되었고 슬라이스에 비보 전 쥐 뇌 기저 개 (BF)는 광고에 주로 영향을 대뇌 영역 중 하나를 포함 하는 처음으로 테스트. 특히, 그것은 입증 되었습니다 acetylcholinesterase (통증)의 C-말단에서 파생 된 독성 펩 티 드의 트리거링, BF의 antero 후부 축 차동 식의 광고와 같은 프로 파일을 프롬프트 수 있습니다. 단백질 alpha7 nicotinic 수용 체 (nAChR α7), 등의 광고에서 변경 phosphorylated (p-타우), 타우 및 아 밀 로이드 베타 (Aβ).
Introduction
광고는 점진적 신경 장애 entorhinal 외피 (EC), BF, 해 마 (HC), 및 후 각 전구 등의 서로 다른 뇌 영역에 영향을 미치는 만성 병 리 특징 (OB)1,2,3, 4,5. 광고 개발의 후반 단계에서 만드는이 질병 약 모든 경우6의 70%를 차지, 치 매의 가장 일반적인 형태는 진보적인 인식 쇠퇴에 리드. 광고에 발생 하는 초기 단계를 이해 하 광범위 한 시도도 불구 하 고 되지 않습니다 현재 그들 elucidating 정의 실험 표시. 또한, 가장 인기 있는 이론-"녹말 체 가설은"-점점 문제 시 된다 광고 pathobiology도 효과적인7,8 입증 제약 대상 설명에 완전 한 단면도 제공 하지 않기 때문 ,9.
증가 주목 받고 있는 대체 이론 neurodegeneration 중 발생 하는 초기 메커니즘 광고3,,1011 에 주로 감염 신경 클러스터에 관련 된 제안 , 12 , 13 , 14. EC, HC, 및 산부인과15,16등 여러 영역에 BF, midbrain, 및 brainstem, 프로젝트 내에서 포함 하 고이 다른 유형의 세포 허브. 신경 형태학 및 신경 전달 물질 합성에 그것의 다양성에도 불구 하 고 셀의이 핵심 표현 하는 통증 또한 비 효소 기능17,18을 가질 수 있는 일반적인 기능을 공유 합니다. 신호 분자 중재 Ca2 + 복용량, 가용성, 그리고 신경 나이17,18 에 관하여 영양 또는 독성 이벤트를 받을 수 있는 신경 세포로 칼슘 (캘리포니아2 +) 흐름 소설이 아닌 클래식 역할 , 19.
Neurodegeneration, 동안 관찰된 셀룰러 손실 수 있습니다 따라서 연결 될이 비 효소 기능17,,1820는 이다 30mer 펩타이드 (T30) 통증 C-말단은 에서 죽 습에 기인 20. 세포 배양 및 광학 이미징18,21 에 이전 결과 따라 우리 시연, ex vivo 쥐 뇌 조각 T30 유도 하는 BF 구조를 포함에 따라 새로운 접근 방식을 통해 광고 같은 프로필22. 특히,이 새로운 방법론까지 해부학에서 회로 보존, 이기는 하지만 시간의 시간 창 그대로 직물의 특성의 많은 유지 이후 세포 배양 보다 더 생리 적인 시나리오를 제공 합니다. 우리는 T30 응용 프로그램에 심각한 응답을 모니터링 neurodegeneration의 초기 단계에서 일어나는 이벤트를 탐험이 프로토콜을 적용 했다.
뇌를 사용 하 여 문학의 큰 신체에도 불구 하 고 분자 경로 조사 하는 조각 신경 손상에 대 한 묵시적인 또는 신생23,24이 프로토콜 보다 즉각적인 처음으로 제공 하 고 밖으로 읽기에 민감한 비교 organotypic 조각의 일반적인 사용 하. 그러나, 사건으로 organotypic에 대 한 뇌 섹션,이 심각한 슬라이스 절차 또한 채택 될 수 특정 프로세스에서 발생 하는 주요 분자 변화의 발견 신경 또는 신경 분자의 평가 등 여러 가지 목적 immunohistochemical 분석, 및 중앙 신경 조직에 대 한 약리학 적인 분석 실험 병 리 관련.
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Protocol
모든 동물 연구 승인된 프로토콜에서 수행 되었습니다.
참고:이 섹션에서는 실험 절차 동안 수행의 주요 단계 순서와 제안된 시간 간격 (그림 1)를 제공 됩니다. 또한, 프로토콜에 대 한 단계별 설명 (그림 2) 잠복기 후 조직 균질 뇌 제거에서까지 중요 한 작업을 보여주는 설명 패널에 의해 보충 된다. 재료 및 기구 및 WB 분석에 대 한 후속 단계 지침에 관한 내용은 앞에서 설명한22있습니다.
1. 수술 도구, Vibratome 설정 및 치료 준비
참고: 실험 절차를 시작 하기 전에 다음 단계를 실행:
- 두 다른 인공 뇌 척추 액체 (aCSFs), 뇌 조각화에 대 한 사용을 준비 하 고 인큐베이션 단계에 대 한 다른 이전29설명. 짧게, 두 aCSFs의 (mmol)에서 작업 농도 "슬라이스" 실제는: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2포4및 10 포도 당; 6.7 HEPES 소금과 3.3 HEPES 산; pH: 7.1. "녹음" 실제 대: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2포4및 10 포도 당; pH: 7.1.
- 솔루션을 잘 섞어 다음 얼음에 넣어 하 고 두뇌와 후속 단면을 제거 하는 동안 감기를 가지기 위해 조각화 실제 산소. 녹음 실제를 실 온 (RT)와 공급 산소에서 유지.
- 잘린 및 뇌 제거, 즉, 단두대, 수술 해 부 키트 (가 위, 집게, 블레이드), 및 주걱 절 개 후드 악기를 놓습니다.
- 슬라이스 두께 (이 준비에서 300 µ m)와 7에 주파수와 6 속도 선택 하 여 vibratome 매개 변수를 설정 합니다. Vibratome 챔버의 적절 한 공간에 삽입 하 고 그것을 포위 하는 얼음.
- "조각화" (실제) 뇌 단면 중 산소 carbogen (95% O2, 5% CO2) 밸브를 엽니다. 최소 유량 2 mL/min의 주위를 선택 합니다.
- 테스트 조건을 준비 하 두 15 mL 튜브를 가져가 라. "녹음" 실제의 10 mL T30 2 µ M (대우 그룹)의 농도에 농축 한 튜브는 "기록" 실제 혼자 (제어 그룹) 10 mL와 다른,를 추가 합니다. 와 동 모두 튜브와 설치 준비 단계 (제 3)에서 사용까지 얼음에 그들을 유지.
2입니다. 마 취, 뇌 추출 및 슬라이스
참고:이 연구에서 9 야생 타입 P14 남성 Wistar 쥐 사용 되었다. 뇌 추출 및 후속 슬라이스 이후 그들은 신속 하 게 수행 해야 (10 분) 이내 방지 하거나 적어도 조직 변성 과정 감속 프로토콜의 중요 한 부분을 구성 합니다.
- 유도 챔버로 면 레이어에 isoflurane의 100 %w / w 1.5 mL을 추가, 내부, 동물 놓고 뚜껑을 닫습니다. 동물 깊이 취 페달 반사의 부재를 확인 될 때까지 기다립니다 고 단두대를 사용 하 여 동물을 목을 벨.
- 계속 차가운 남 비를 포함 하는 내에서 동물의 머리 두뇌 제거 단계 동안 실제 조각화 (그림 2A -C).
- 외과 블레이드, 두개골을 통해 피부를 incise 다음 후부 부분에서 중간, 다음가 위를 사용 하 여 두개골을 잘라 고 anteriorly OBs (그림 2A) 위에 뼈를 도달할 때까지.
- 옆 뇌 (그림 2B)에 액세스할 수 있습니다 한 쌍의 집게를 사용 하 여 두개골의 두 측면을 당겨. 뇌에 ventrally 주걱을 삽입, 그것을 밖으로, 그리고 그것은 약 5 분 (그림 2C)에 대 한 차가운 "슬라이스" 실제에 충분 한지 체크 해 계속 부드럽게 푸.
- 필터 종이에 두뇌를 처분 하 고 (그림 2D) 블레이드를 사용 하 여 소 뇌를 잘라. Vibratome 디스크에 세로로 두뇌 접착제 및 단면 챔버 내부 삽입, 차가운 "슬라이스" 실제 그것을 채울 제공 되며 산소 (그림 2E).
- 절단 간격을 조정 하 고 뇌 단면 (그림 2F)와 함께 진행. 앞에서 설명한22로 중간 심장 (MS), Broca (DBB), 그리고 substantia innominata (SI)의 대각선 밴드 등 관심 영역을 포함 하는 섹션을 수집 합니다. 위에서 아래, 3 조각 rostral (R), 중급 (I), 그리고 BF (그림 2G)의 꼬리 (C) 부분을 포함합니다.
- 작은 위, 각 섹션 중간 선 따라 분할 취득 두 반사 hemislices (그림 2 H), 개별적으로 제어와 같은 해 부 비행기에서 대우 조건 사용.
- 5-10 분, vibratome 챔버에는 hemisections를 계속 한 다음 녹음 실제를 포함 하는 버블링 냄비에 유리 피 펫과 그들을 전송. 복구를 약 30 분 동안 RT에서 유지.
- 한편, 혼자 녹음 실제의 3 mL (이전 단계 컨트롤 그룹에 대 한 1.6에서에서 준비)와 함께 3 개의 유리 튜브와 실제 T30 (이전 단계 1.6에서에서 준비) 대우 그룹에 대 한 강화의 3 mL와 함께 3 개의 튜브 작성.
3. 설치 준비
- 제어 그룹 (녹색 프레임, 그림 2J) 3 연속 hemislices (rostral, 중간, 및 꼬리 BF 지역 포함) 순서는 hemisections 그들의 해당 유리 튜브 (그림 2I)로 전송 하 고 그들의 대우 그룹 (레드 프레임, 그림 2J)에 대 한 대응을 일치.
- 조건 사이 어떤 오염 든 지 방지 하기 위해 제어 hemislices 및 다른 처리 대응에 대 한 두 개의 다른 붓과 뇌 조직의 전송.
- 각 유리 유리병 oxygenating 바늘 (21 G) (그림 2J) 제시 해당 뚜껑을 봉인. Carbogen 소스 (그림 2 K) 기구의 주요 튜브를 연결 합니다. 실험 기간 동안 뇌 조직과 기계적 손상의 어떤 움직임을 피하기 위하여 2 mL/min의 최소 유량과 인큐베이션 기간 동안 hemislices에 산소를 제공 합니다. 5 h 부 화를 시작 합니다. 5 분 이내 3.1-3.3 단계를 실행 합니다.
참고: 체크 자주 (매 15-20 분) 모든 튜브에 산소 제공 여부와 흐름 아래에서 조직을 이동 하지 않습니다.
4. 샘플 균질
- 부 화 후 산소 흐름을 중지 하 고 튜브에서 모든 뚜껑을 제거 합니다. Hemislices, 얼음 (그림 2 L)에 튜브를 유지 세포의 용 해 버퍼의 250 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 적절 한 브러쉬를 사용 하 여 전송 합니다. 세포의 용 해 버퍼, PBS 1 인산 가수분해 효소와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 모두에서 1: 100, 희석와 조직 샘플 중 오염을 방지 하기 위해 다른 pestles와 균질. 10-15 분 내에서 이러한 작업을 완료 합니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 1000 x g에서 lysate 뇌 원심 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 샘플-80 ° c.에 유지
5. 단백질 농도 및 서쪽 오 점 분석의 읽기
- 각 샘플의 단백질 농도 확인 하 고 이후에 aliquots 앞에서 설명한22로 서쪽 오 점 분석을 위한 준비.
- 단백질 표정에 치료의 효과 평가 하기 위해 통계 분석을 수행 합니다.
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Representative Results
여기에 제시 된 프로토콜 나타냅니다 독성 펩 티 드, T30, 관리 사이트-종속 방식에서 p α7 nAChR의 표현을 변조-타우, 그리고 Aβ BF-포함 된 섹션 (그림 3A). Nicotinic 수용 체의 제어 대응에 비해 rostral 처리 hemislice에서는 크게 증가 (슬라이스 1, p = 0.0310) (그림 3B), 동안 중간 슬라이스 두 가지 조건 (사이 어떤 변화를 공개 하지 않습니다 슬라이스 2, p = 0.1195) (그림 3B). 후부 섹션에서 상당한 감소의 제어 측면에 T30 노출 부분에는 (슬라이스 3, p = 0.0476) (그림 3B). T30 응용 프로그램에 따라 p-타우 레벨은 측면을 일치 하는 컨트롤에 대 한 전방 지역에서 크게 증가 한다 (슬라이스 1, p = 0.0158) (그림 3C). 다른 한편으로, 다른 두 BF 포함 된 섹션 조건 사이 상당한 차이 표시 하지 않습니다 (슬라이스 2, p = 0.1014; 슬라이스 3, p = 0.6405) (그림 3C). T30 노출, Aβ는 크게 향상 된 rostral와 중간 hemisections 그들의 치료 contralateral 부분에 비교 될 때에 (슬라이스 1, p = 0.0136; 슬라이스 2, p = 0.0109) (그림 3D). 꼬리 조각에는 2 개의 처리 사이 변화가 없습니다 (슬라이스 3, p = 0.1231) (그림 3D). P-타우에 대 한 1 차적인 항 체 epitope phosphorylated Ser202 잔류물을 포함 하는 인식 합니다. Aβ에 대 한 1 차적인 항 체 여러 isoforms, Aβ37에서 Aβ42까지를 검색 합니다. 데이터는 2를 사용 하 여 앞에서 설명한22 쌍체 t검정으로 분석 되었다-테스트 및 SEM. N으로 표현 =은 (그룹 당 hemislices 쥐) (27, 9).
그림 1: 시퀀스 및 주요 단계를 나타내는 타이밍 실험 절차 동안 수행. 첫 번째 및 세 번째 단계를 완료 하는 시간 간격 연산자의 경험 수준에 관하여 달라질 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 프로토콜 진행을 보여주는 일련의 단계. (A-D) 두개골과 두뇌의 나머지에서 소 뇌의 분리에서 두뇌의 추출. Vibratome 디스크에 전송 해 부 챔버, 얼음으로 둘러싸인 고 가득 찬 실제 끊임없이 부 러 뜨 리는 하는 동안 산소에 두뇌의 (E) 첨부 합니다. (F) 코로나 뇌 단면입니다. (G) rostral (R), 중급 (나), 그리고 기저 개의 꼬리 (C) 구조과는 조각의 컬렉션입니다. (H) 두 일치 hemislices에 섹션의 분리. (나) 각 hemisection는 해당 유리병에 배치 됩니다. (J) 튜브 지원 장치 상자 안쪽에 배치 하 고 별도로 폐쇄 합니다. (K) 인큐베이션 기간 산소 소스 (검은 원) 시스템의 연결 시. 치료 후 샘플 (L) 균질 이 그림22에서 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: T30 중재 p α7 nAChR의 특정 표현-타우, 그리고 BF rostro 꼬리 축 Aβ. (A) 뇌 코로나 조각 기저 개 핵 (흰색 점선), 두 개의 보완적인 부분에서 분할 하 고 서로 다른 조건에 노출 등의 표현입니다. (B) 후 T30 노출, nicotinic 수용 체 앞쪽 서브 (T30 1)와 하나 (T30 3) 해당 제어 측면 (ctrl 1 및 ctrl 3)에 비해 뒷부분에 표시 된 감소에 상당한 증가 보여줍니다. 중간 조각 팬 들은 두 가지 조건 (ctrl 2, T30 2) 사이의 변경의 정보를 표시 하지 않습니다. (C) p-타우 식이 끝났습니다 치료 rostral 부분 (T30 1)에 상당히 높은 제어 일치 대응 (ctrl 1), 반면 다른 두 조각 (슬라이스 2와 슬라이스 3) 두 그룹에 어떤 차이 공개 하지 않습니다. (D) Aβ는 앞쪽에 및 중간 처리 세분 (T30 1과 T30 2)의 해당 치료 면 (ctrl 1 및 2 ctrl)에 비해 크게 증가 표시 됩니다. 꼬리 부분에서는 두 그룹 사이의 아무 변화입니다. 오차 막대 표시 SEM. * p < 0.05.n =은 (그룹 당 hemislices 쥐) (27, 9). 눈금 막대는 1 m m 이다. 이 그림22에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
잘 설립 비보 전 뇌 기술에 따라,이 프로토콜의 주요 측면 동기적으로 특정의 신청 후에 그들의 응답을 모니터링 같은 해 부 비행기에서 얻은 두 개의 반사 hemislices 테스트를 수합니다 조건 제어 (치료를); 이 따라서 최대한으로 엄격 하 게 제어 하는 실험 패러다임을 제공 합니다. 시간-, 복용량-및 특정 방식으로 서로 다른 neurochemicals 신경 장애에 관련 된 신경 이벤트22, 동안 본 평가의 가능성 필수적인 기능을 나타냅니다. 이 방법론 그 시험관에서 준비, 관심 영역 및 이상적인 extracellular 컨텍스트를 만드는 정확도 등의 생체 내에서 생리 적 환경의 장점을 연결 합니다. 이 프로토콜 나타냅니다 비보 전 electrophysiological 녹음25,,2627 및 광학 이미징28, 널리 이용 되는 절차를 자르는 일반적인 뇌의 적응 29,30또는 생체 외에서 organotypic 조각, 둘 다 구조와 시 냅 스 조직23,24 의 보존 함으로써 가까이 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 ,3132.
또한,이 절차는 vivo에서부분적으로 복제 하기 때문에 행동 연구에 사용 하는 동물의 수를 줄일 도울 수- 체 외에서 데이터, 세포 배양 등을 확인 하는 채택 했다 수 상태 처럼 고 immunohistochemical 분석 다음 vivo에서 실험을 기대 하 고.
제안 된 방법론 또한 몇 가지 제한 섹션 두께 하지 때 최종 결과 변경할 수 있습니다 무결성 등을 제공 합니다. 보육 시간 그것은 제어 그룹 및 대우 한 사이 비교에 영향을 줄 수 있기 때문에이 기술의 기본 구성 요소 이기도 합니다. 또한, 일련의 절차적 또는 기술적인 문제 발생할 수 있습니다 프로토콜의 모든 단계와 같은: 추출 또는 조직;의 정확 하 고 부드러운 처리에 의해 피할 수 있다 뇌 단면 (1) 기계적 손상 (에 따라서 그것의 무결성에 영향을 미치는 실제 침수 2) 때문에 의하여 바늘을 접촉 하는 경우는 조직 손상 기계적으로 할 수 있는 과도 한 산소 흐름, 외피 동안에 hemislices의 부동. 이 버블링; 최소 속도를 조정 하 여 방지 될 수 있다 (3) 부재 또는 변덕 스러운 산소 흐름, 어떤 관련이 있을 수 있습니다 빈 용기, 손상 또는 단절 튜브 시스템, oxygenating 바늘에 플러그 또는 때 그것은 하지 제대로 몰입에 실제. 이후 지속적인 산소와 절차를 통해 그것의 흐름이이 프로토콜의 가장 중요 한 측면 중 하나를 나타냅니다, 그것은 자주 조사 그룹 간의 균질 상태를 유지 하기 위해 이러한 모든 매개이 변수를 모니터링 하는 것이 중요.
다른 중요 한 단계는 프로토콜에 표시 되는 각 작업을 수행 하는 데 필요한 시간 창이 때 뒤 지 보존 가능한 무결성 및 조직의 기능 만큼. 또한, 이러한 매개 변수를 평가 하 immunohistochemical 분석 앞에서 설명한23,29신경 생존 및 electrophysiological 녹음에 관련 된 특정 마커 검출을 수행할 수 있습니다.
여기서 설명 하는 결과 넘어이 메서드는 디자인 임시 특정 조사에 대 한 될 수 있습니다. 예를 들어, 그것은에 적용 될 수 있습니다: (1) 모니터와 여러 다른 화합물의 활동 비교 뇌 영역, 선택한 솔루션의 실제 등 Neurobasal 매체; 잠복기 (2) 수행 연구에 저 산소 증, 산소 흐름을 각 hemisection;에 선택적으로 제어할 수 있기 때문 (3) 조사; 다른 질병의 유전자 변형 동물 모델에서 뇌 조직 속성 (4) 동시에 같은 해 부 수준에서 vivo에서 일방적인 뇌 주사의 영향을 탐구 하 고 제어 반구;와 그들을 비교합니다 (5) 다른 장기 또는 조직 속성, 따라서 잠재적으로 촉진 및 마약 재판 심사의 길이 줄이고 탐구.
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Disclosures
저자는 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 수잔 A. 그린 필드는 설립자 이자 신경-바이오 제한, 개인 소유의 회사, 및 보유 주식 회사의 사장. 에마누엘레 땋 고 Antonella Cogoni는 신경-바이오 회사의 직원
Acknowledgments
이 작품은 신경-바이오 회사에 의해 투자 되었다 우리는 그들의 의견 및 조언을 원고에 대 한 박사 조반니 Ferrati와 박사 세르지오로 톤도 (신경-바이오) 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
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