Summary
Apresentamos um método que pode fornecer mais insights sobre os primeiros eventos subjacentes a neurodegeneração e baseia a técnica de cérebro estabelecido ex vivo , combinando as vantagens dos experimentos in vivo e in vitro . Além disso, representa uma oportunidade única para comparação directa do grupo tratado e não tratado no mesmo plano anatômico.
Abstract
Apesar de numerosos estudos que tentam desenvolver modelos animais confiáveis que refletir o primário processa neurodegeneração subjacente, muito poucos foram amplamente aceites. Aqui, propomos um novo procedimento adaptado de conhecidos ex vivo cérebro fatia técnica, que oferece um mais perto na vivo-como cenário do que em vitro preparações para investigar os eventos iniciais provocando degeneração celular, como observada na doença de Alzheimer (AD). Esta variação consiste em etapas simples e facilmente reproduzíveis, que permitem a preservação do cytoarchitecture anatômica da região selecionada do cérebro e sua funcionalidade local em um ambiente fisiológico. Diferentes áreas anatômicas podem ser obtidas o mesmo cérebro, proporcionando a oportunidade de realizar várias experiências com os tratamentos em questão em um local-, dose e tempo-dependente. Limitações potenciais que poderiam afetar os resultados relacionados com esta metodologia estão relacionadas com a conservação do tecido, ou seja, a manutenção da sua integridade anatômica durante as etapas de corte e a incubação e a espessura de corte, que pode influenciar a análise bioquímica e imuno-histoquímica. Esta abordagem pode ser utilizada para diferentes fins, tais como explorar mecanismos moleculares envolvidos em condições fisiológicas ou patológicas, triagem de drogas ou ensaios de dose-resposta. Finalmente, este protocolo também poderia reduzir o número de animais utilizados em estudos comportamentais. O aplicativo aqui relatado foi recentemente descrito e testado pela primeira vez na ex vivo fatias cérebro rato contendo o prosencéfalo basal (BF), que é uma das regiões cerebrais afetadas principalmente no AD. Especificamente, foi demonstrado que a administração de um peptídeo tóxico derivado do C-terminal da acetilcolinesterase (AChE) poderia solicitar um AD-como o perfil, provocando, ao longo do eixo antero-posterior do BF, uma expressão diferencial de proteínas alteradas na AD, como o receptor nicotínico alpha7 (α7-nAChR), fosforilada Tau (p-Tau) e beta amiloide (Aβ).
Introduction
AD é que uma patologia crônica caracterizada por imparidade neurodegenerativa progressiva, afetando áreas diferentes do cérebro, tais como o córtex entorhinal (CE), BF, hipocampo (HC) e bulbo olfatório (OB)1,2,3, 4,5. Estágios finais de desenvolvimento AD conduzem a um progressivo declínio cognitivo, tornando esta doença, a forma mais comum de demência, representando aproximadamente 70% de todos os casos6. Apesar das tentativas extensas para entender os estágios iniciais, causando AD, não há atualmente uma indicação experimental definida elucidá-los. Além disso, a teoria mais popular - a "hipótese amiloide" - é cada vez mais questionada desde que ele não fornece um perfil completo em explicar o Patobiológico AD, nem um alvo farmacêutico que se revelou eficaz7,8 ,9.
Uma teoria alternativa que está recebendo atenção crescente sugere que os mecanismos iniciais ocorrem durante neurodegeneração estão relacionados a um cluster neuronal principalmente sensível no AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. este hub celular heterogênea englobada no âmbito dos projectos BF, mesencéfalo e tronco cerebral, para várias regiões, tais como o CE, HC e OB15,16. Apesar de sua diversidade na morfologia neuronal e síntese de neurotransmissor, esse núcleo de células compartilha uma característica comum em expressar a dor, que também pode ter uma função não-enzimática de17,18. Este papel não-clássica como um romance de sinalização molécula Medeia o fluxo de cálcio (Ca2 +) em neurônios que pode passar por eventos tróficos ou tóxicos em relação à dose de Ca2 + , disponibilidade e idade neuronal17,18 , 19.
Durante neurodegeneração, a perda celular observada pode ser, portanto, associada a esta função não enzimáticos17,18,20, que é atribuível a um peptídeo 30mer (T30) clivado de dor C-terminal 20. em consonância com os resultados anteriores, realizados na cultura de pilha e óptico de imagem18,21 preparações, temos demonstrado, através de uma nova abordagem baseada em ex vivo fatias cérebro rato contendo estruturas BF, que induziu T30 um perfil AD22. Especificamente, esta nova metodologia oferece um cenário mais fisiológico do que cultura celular desde que ele mantém muitas das características de um tecido intacto, variando de anatômica para preservação de circuitos, embora para uma janela de tempo de horas. Aplicamos este protocolo para explorar os eventos que ocorrem durante as primeiras fases de neurodegeneração, monitoramento da resposta aguda a T30 pedido.
Apesar da grande corpus de literatura sobre o uso do cérebro fatias para investigar as vias moleculares implícita no dano neuronal ou neurogênese23,24, este protocolo fornece pela primeira vez uma mais imediata e sensível à leitura comparada para o uso comum de organotypic fatias. No entanto, como é o caso de organotypic seções do cérebro, este procedimento de fatia aguda pode também ser adotado para fins diversos, tais como a avaliação de neuroprotective ou moléculas neurotóxicas, descoberta de mudanças moleculares primárias que ocorrem em um processo específico, a análise imuno-histoquímica e ensaios farmacológicos para o sistema nervoso central relacionadas com patologias.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram realizados sob protocolos aprovados.
Nota: Nesta seção, a sequência das principais fases executadas durante o procedimento experimental e o intervalo de tempo sugerido é fornecido (Figura 1). Além disso, uma descrição passo a passo do protocolo é complementada por um painel ilustrativo, mostrando ações críticas que variam de remoção do cérebro a homogeneização do tecido após o período de incubação (Figura 2). Os detalhes sobre os materiais e instruções para construir o aparelho e a fase subsequente para a análise de WB são descritas anteriormente22.
1. cirúrgicas ferramentas, configurações de Vibratome e preparação de tratamento
Nota: Execute as etapas a seguir antes de iniciar o procedimento experimental:
- Prepare dois diferentes artificiais cerebrospinal fluidos (aCSFs), que usou para cortar o cérebro e o outro para a etapa de incubação como descrito anteriormente29. Brevemente, as concentrações de trabalho (em mmol) dos dois aCSFs são para o "fatiar" aCSF: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4e 10 glicose; 6.7 HEPES sal e ácido HEPES 3.3; pH: 7.1. Tempo para a "gravação" aCSF: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2PO4e 10 glicose; pH: 7.1.
- Misture bem as soluções e colocar no gelo e oxigenar a aCSF corte a fim de tê-lo frio ao remover o cérebro e o seccionamento subsequentes. Manter a temperatura (RT) e fornecimento de oxigênio para a aCSF de gravação.
- Coloque os instrumentos sob a capa de dissecação para a remoção de decapitação e cérebro, ou seja, guilhotina, kit cirúrgico de dissecação (tesouras, pinças, lâminas) e espátula.
- Configure os parâmetros de vibratome, selecionando a espessura da fatia (300 µm nesta preparação) e a frequência às 7 e a velocidade em 6. Inserir a câmara de vibratome no seu espaço apropriado e cercá-lo com gelo.
- Abra a válvula de carbogênio (95% O2, 5% CO2) para oxigenar o "corte" (aCSF) durante o corte do cérebro. Selecione a taxa de vazão mínima, em torno de 2 mL/min.
- Pegue dois tubos de 15 mL para preparar as condições para testar. Adicione em um tubo de 10 mL da "gravação" aCSF sozinho (grupo controle) e no outro, 10 mL da "gravação" aCSF enriquecido com T30 em uma concentração de 2 µM (grupo tratado). Vórtice tanto tubos e mantê-los no gelo até sua utilização na fase de preparação de instalação (secção 3).
2. anestesia, extração de cérebro e de corte
Nota: Neste estudo, foram usados 9 tipo selvagem P14 ratos machos Wistar. Extração do cérebro e subsequente corte constituem uma parte crítica do protocolo, desde que eles devem ser realizados rapidamente (dentro de 10 min) a fim de evitar ou pelo menos abrandar os processos de degeneração do tecido.
- Adicione 1,5 mL de 100% w/w de isoflurano em uma camada de algodão para a câmara de indução, colocar o animal dentro e feche a tampa. Espere até que o animal é anestesiado profundamente, confirmando a ausência do pedal reflexo e então decapitar o animal usando a guilhotina.
- Mantenha a cabeça do animal dentro de um pote contendo gelada corte aCSF durante a etapa de remoção do cérebro (Figura 2A -C).
- Faça uma incisão na pele sobre o crânio com uma lâmina cirúrgica, em seguida, recorte usando a tesoura, seguindo a linha mediana, desde a parte posterior do crânio e proceda anteriormente até atingir o osso acima do OBs (Figura 2A).
- Puxe lateralmente os dois lados do crânio usando um par de pinças para poder ter acesso ao cérebro (Figura 2B). Insira uma espátula ventralmente ao cérebro, colher-se suavemente para fora e mantê-lo hidratado na gelada aCSF "fatiar" por aproximadamente 5 min (Figura 2).
- Elimine o cérebro no filtro de papel e cortar o cerebelo usando uma lâmina (Figura 2D). Cola o cérebro verticalmente sobre o disco de vibratome e inseri-lo no interior da câmara de corte, preenchê-lo com aCSF "fatiar" gelada e fornecer oxigênio (Figura 2E).
- Ajustar o intervalo de corte e prosseguir com o seccionamento do cérebro (Figura 2F). Recolha as seções que contém a região de interesse, tais como o septo medial (MS), a banda diagonal de Broca (DBB) e substância innominata (SI), como descrito anteriormente,22. De cima para baixo, as três fatias contêm o rostral (R), intermediário (I) e caudal (C) parte do BF (Figura 2).
- Dividir ao longo da linha mediana de cada seção com uma pequena tesoura, obtendo dois hemislices especulares (Figura 2 H), usado individualmente como o controle e a condição tratada no mesmo plano anatômico.
- Manter o hemisections na câmara de vibratome por 5-10 min, em seguida, transferi-los com uma pipeta de vidro em um subida pote contendo gravação aCSF. Mantenha a RT para cerca de 30 min para recuperar.
- Preencha, entretanto, três frascos de vidro com 3 ml de solução de gravação aCSF sozinho (anteriormente na etapa 1.6 para o grupo de controle) e três tubos de ensaio com 3 mL de aCSF enriquecido com T30 (previamente preparado no passo 1.6) para o grupo tratado.
3. preparação da instalação
- Transferir o hemisections para seus frascos de vidro correspondente (Figura 2I) a fim de ter três hemislices consecutivos (incluindo a região BF rostral, intermediária e caudal) para o grupo de controle (quadro verde, Figura 2J) e suas correspondência de contrapartes para o grupo tratado (quadro vermelho, Figura 2J).
- Transferi o tecido cerebral com duas escovas diferentes, uma para o controle hemislices e outro para as contrapartes tratadas, para evitar qualquer contaminação entre as condições.
- Sele cada frasco de vidro com a tampa correspondente, apresentando a agulha oxigenação (21G) (Figura 2J). Ligar o tubo principal do aparelho para a fonte de carbogênio (Figura 2 K). Entrega oxigênio para a hemislices durante todo o período de incubação com um caudal mínimo de 2 mL/min para evitar qualquer movimento do tecido cerebral e possíveis danos mecânicos durante o experimento. Inicie a incubação de 5h. Execute as etapas de 3.1-3.3 dentro de 5 min.
Nota: Verifique frequentemente (cada 15-20 min) se o oxigênio é fornecido em todos os frascos e que seu fluxo não está se movendo o tecido do fundo.
4. homogeneização da amostra
- Parar o fluxo de oxigênio após a incubação e remover todas as tampas dos frascos. Transferi o hemislices, usando os pincéis adequados, para tubos de 1,5 mL, contendo 250 µ l de tampão de Lise, manter os tubos em gelo (Figura 2 L). Para fazer a lise de tampão, misturar PBS 1 x com cocktails de inibidores da fosfatase e protease tanto diluído a 1: 100 e homogeneizar o tecido com macacos diferentes para evitar a contaminação entre as amostras. Conclua essas ações dentro de 10-15 min.
- Centrifugue o cérebro lisado a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para tubos novos e manter as amostras a-80 ° C.
5. leitura da concentração de proteínas e análise ocidental do borrão
- Determinar a concentração de proteína de cada amostra e posteriormente, preparar as alíquotas para análise ocidental do borrão como descrito anteriormente,22.
- Realizar análise estatística para avaliar os efeitos do tratamento na expressão da proteína.
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Representative Results
O protocolo aqui apresentado indica que a administração de um peptídeo tóxico, T30, modula de forma local-dependente da expressão do nAChR, α7-p-Tau e Aβ nas seções contendo BF (Figura 3A). O receptor nicotínico mostra um aumento significativo no hemislice rostral-tratados, comparado ao seu homólogo de controle (fatia 1, p = 0.0310) (Figura 3B), enquanto a fatia intermediária não revela qualquer alteração entre o (duas condições fatia de 2, p = 0.1195) (Figura 3B). Na seção posterior uma redução significativa é presente na porção T30-expostos ao longo de seu lado controle (fatia 3, p = 0.0476) (Figura 3B). A pedido de T30, níveis de p-Tau são aumentou significativamente na região anterior contra o controle de correspondência de lado (fatia 1, p = 0.0158) (Figura 3). Por outro lado, as outras duas BF-contendo seções não mostram qualquer diferença significativa entre as condições (fatia 2, p = 0.1014; cortar 3, p = 0.6405) (Figura 3). Após a exposição T30, Aβ é significativamente reforçada no hemisections rostral e intermediário, quando comparado com suas parcelas contralaterais não tratadas (fatia 1, p = 0.0136; cortar 2, p = 0.0109) (Figura 3D). A fatia de caudal, não há alteração entre os dois tratamentos (fatia 3, p = 0.1231) (Figura 3D). O anticorpo primário contra p-Tau reconhece o epítopo contendo o resíduo Ser202 fosforilado. O anticorpo primário contra Aβ detecta várias isoformas, variando de Aβ37 a Aβ42. Os dados foram analisados conforme descrito anteriormente22 usando dois de cauda emparelhados t-testes e representado como SEM. N = (hemislices por grupo, ratos) é (27, 9).
Figura 1: sequência e o calendário indicativo das principais etapas realizadas durante o procedimento experimental. O intervalo de tempo para completar a primeira e a terceira etapa pode variar em relação ao nível de experiência do operador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: etapas sequenciais, ilustrando a progressão de protocolo. (–D) Extração do cérebro do crânio e separação do cerebelo do resto do cérebro. (E) acessório do cérebro sobre o disco de vibratome e transferência para a câmara de dissecação, que é rodeada por gelo e cheio de frio aCSF oxigenado constantemente durante o corte. (F) cérebro Coronal de seccionamento. (G) coleção das fatias, contendo rostral (R), intermediário (eu) e caudal (C) estruturas do prosencéfalo basal. (H) separação das seções em dois hemislices correspondentes. (eu) cada hemisection é colocada em seu frasco correspondente. (J) frascos posicionado no suporte, dentro da caixa do aparelho e fecharam separadamente. (K) incubação período após a conexão do sistema para a fonte de oxigênio (círculo preto). (L) homogeneização das amostras após o tratamento. Esta figura é modificada de22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: T30 mediada site-specific expressão de α7-nAChR, p-Tau e Aβ ao longo do eixo rostro-caudal BF. (A) representação de fatias coronais de cérebro incluindo núcleos do prosencéfalo basal (brancos linhas pontilhadas), dividido em duas partes complementares e expostos a diferentes condições. (B) T30 após a exposição, o receptor nicotínico mostra um aumento significativo na subdivisão anterior (T30 1) e uma redução marcada no posterior um (T30 3) em comparação com os lados de controle correspondente (ctrl 1 e ctrl 3). A fatia intermediária não exibirá qualquer mudança entre as duas condições (Ctrl + 2, 2 T30). Expressão de p-Tau (C) é significativamente maior na porção rostral tratada (T30 1) sobre o seu homólogo correspondente do controle (Ctrl + 1), enquanto as outras duas fatias não revelam qualquer diferença nos dois grupos (fatia 2 e 3 de fatia). (D) Aβ exibe um aumento significativo no anteriores e intermediárias tratadas subdivisões (T30 1 e 2 T30) em comparação com seus correspondentes lados não tratados (ctrl 1 e ctrl 2). As seções de caudal, não há nenhuma variação entre os dois grupos. As barras de erro indicam SEM. * p < 0.05.n = (hemislices por grupo, ratos) é (27, 9). Barra de escala é de 1 mm. Esta figura foi modificada em22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O principal aspecto do presente protocolo, baseado na técnica cérebro bem-estabelecida ex vivo , permite testar sincronicamente duas hemislices especulares, obtidas no mesmo plano anatômico, monitorando sua resposta após a aplicação de um determinado condição (controlar ou tratados); Este, portanto, oferece uma paradigma experimental tão rigidamente controlada quanto possível. A possibilidade de avaliar em um tempo - dose- e site-specific maneira diferente neuroquímicos relacionados com comprometimento neuronal, como pode ser visto durante neurodegenerativas eventos22, representa uma característica essencial. Esta metodologia vincula as vantagens de um ambiente fisiológico na vivo com aqueles em vitro preparações, tais como a precisão em obter a região de interesse e criar o contexto ideal extracelular. Este protocolo representa uma adaptação do cérebro comum corte procedimento amplamente usado para ex vivo gravações eletrofisiológicos25,26,27 e óptico de imagem28, 29,30, ou em vitro organotypic fatias, que simulam uma situação mais de perto na vivo , permitindo a preservação de ambos os organização estrutural e sináptica23,24 ,31,32.
Além disso, este procedimento pode ajudar a diminuir o número de animais utilizados em estudos comportamentais, uma vez que reproduz-se parcialmente um na vivo-como condição, que pode ser adotada para confirmar em vitro dados, tais como a cultura de células e análise imuno-histoquímica e então antecipar experiências na vivo .
A metodologia proposta apresenta também algumas limitações, tais como a espessura de corte e integridade que, quando não for apropriado, pode alterar o resultado final. O tempo de incubação é também um componente fundamental desta técnica desde que possa influenciar a comparação entre o grupo controle e um tratado. Além disso, uma série de problemas processuais ou técnicos pode ser encontrada durante todas as etapas do protocolo, tais como: (1) danos mecânicos durante a extração ou corte do cérebro, que pode ser evitado pelo tratamento preciso e suave do tecido; (2) flutuante do hemislices durante a incubação devido a um fluxo excessivo de oxigênio, que mecanicamente pode danificar o tecido se toca a agulha oxigenante submerso na aCSF, afetando sua integridade. Isto pode ser evitado ajustando a taxa mínima a borbulhar; e (3) ausência ou fluxo inconstante de oxigênio, que pode estar relacionado com o tubo vazio, uma desconexão ou danos no sistema de tubulação, um plug na agulha oxigenante, ou quando ele não está devidamente imerso na aCSF. Desde que o fluxo ao longo do processo e a oxigenação constante representa um dos aspectos mais críticos do presente protocolo, é importante monitorar frequentemente todos estes parâmetros, para manter uma condição homogênea entre os grupos investigados.
Outros passos críticos no protocolo são representados pela janela do tempo necessária para executar cada ação, que quando seguido vai preservar, tanto quanto possível, a integridade e a funcionalidade do tecido. Além disso, para avaliar estes parâmetros, a análise imuno-histoquímica pode ser realizada para detectar marcadores específicos relacionados à viabilidade neuronal e gravações eletrofisiológicas como descrito anteriormente,23,29.
Além dos resultados descritos aqui, este método pode ser projetado ad-hoc para investigações específicas. Por exemplo, pode ser aplicado para: (1) monitor e comparar a atividade de diferentes compostos em vários o cérebro áreas, incubando-os com a solução selecionada, como aCSF ou Neurobasal médio; (2) realizar estudos em hipóxia, desde que o fluxo de oxigênio pode ser seletivamente controlado em cada hemisection; (3) investigar Propriedades de tecido cerebral de modelos animais transgénicos de diferentes doenças; (4) simultaneamente, explorar, no mesmo nível anatômico, os efeitos de injeções de cérebro unilateral na vivo e compará-los com o hemisfério de controle; e (5) explorar outras propriedades de órgãos ou tecidos, portanto, potencialmente facilitar e reduzir a duração dos testes de despistagem de drogas.
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Disclosures
Os autores declaram concorrentes interesses financeiros. Susan A. Greenfield é o fundador e presidente da Neuro-Bio Limited, uma empresa canadense e detém ações da empresa. Emanuele Brai e Antonella Cogoni são empregados da Neuro-Bio Ltd.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Neuro-Bio Ltd. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Giovanni Ferrati e Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) para seus comentários e conselhos sobre o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
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