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Immunology and Infection

लैंब्डा सीआईआई उत्परिवर्तन जांच प्रणाली का चयन करें

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

हम लैंब्डा के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन का चयन करें ट्रांसजेनिक कुतर या इसी जानवरों के साथ इलाज किया और ब्याज की एक रासायनिक/शारीरिक एजेंट के प्रसंस्कृत कोशिकाओं में सीआईआई उत्परिवर्तन परख । यह दृष्टिकोण स्तनधारी कोशिकाओं में यलो के mutagenicity परीक्षण के लिए व्यापक रूप से प्रयोग किया गया है.

Abstract

स्तनधारी कोशिकाओं में यलो के mutagenicity टेस्टिंग के लिए कई ट्रांसजेनिक एनिमल मॉडल्स और उत्परिवर्तन डिटेक्शन सिस्टम विकसित किए गए हैं । इनमें से, ट्रांसजेनिक चूहों और लैंब्डा (λ) का चयन करें सीआईआई उत्परिवर्तन जांच प्रणाली दुनिया भर में कई अनुसंधान समूहों द्वारा mutagenicity प्रयोगों के लिए नियोजित किया गया है । यहां, हम लैंब्डा चुनें सीआईआई उत्परिवर्तन परख, जो ट्रांसजेनिक चूहों की प्रसंस्कृत कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन/चूहों या इसी जानवरों के साथ इलाज एक रासायनिक/ प्रोटोकॉल निंनलिखित चरणों के होते हैं: (1) जीनोमिक डीएनए के कोशिकाओं या अंगों से ट्रांसजेनिक पशुओं के ऊतकों/ इन विट्रो में या vivo में, क्रमशः, एक परीक्षण परिसर के साथ अलगाव; (2) जीनोमिक डीएनए से लैंब्डा शटल वेक्टर के एक उत्परिवर्तन रिपोर्टर जीन (यानी, सीआईआई transgene) ले जाने की वसूली; (3) संक्रामक bacteriophages में बचाया वैक्टर की पैकेजिंग; (4) एक मेजबान बैक्टीरिया और चयनात्मक शर्तों के तहत संवर्धन प्रेरित सीआईआई उत्परिवर्तनों के प्रसार की अनुमति के लिए संक्रमण; और (5) सीआईआई-म्यूटेंट और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण स्कोरिंग क्रमशः सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति और उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम का निर्धारण करने के लिए ।

Introduction

ट्रांसजेनिक पशु मॉडल और उत्परिवर्तन का पता लगाने प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला स्तनधारी कोशिकाओं में कैंसर के mutagenicity परीक्षण के लिए विकसित किया गया है । इनमें से, ट्रांसजेनिक बड़े नीले (इसके बाद बी के रूप में संदर्भित) चूहों और λ चुनें सीआईआई उत्परिवर्तन जांच प्रणाली इस समूह द्वारा mutagenicity प्रयोगों के लिए नियोजित किया गया है और कई अंय अनुसंधान समूहों दुनिया भर में1,2, 3,4,5,6,7,8,9. पिछले 16 वर्षों के लिए, हम विभिंन रासायनिक और/या शारीरिक इन ट्रांसजेनिक पशुओं या उनके इसी भ्रूण fibroblast कोशिका एक परीक्षण परिसर के साथ इलाज संस्कृतियों का उपयोग कर एजेंटों के mutagenic प्रभाव की जांच की है, और बाद में विश्लेषण phenotype और जीनोटाइप द्वारा सीआईआई transgene के λ चयन सीआईआई परख और डीएनए अनुक्रमण, क्रमशः10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. इन ट्रांसजेनिक जानवरों के जीनोम में एक भोजी λ शटल वेक्टर (λLIZ) 4 गुणसूत्र पर एक बहु के रूप में एकीकृत-प्रति सिर से पूंछ concatemer1,2,25शामिल हैं । λLIZ शटल वेक्टर दो उत्परिवर्तन रिपोर्टर जीन किया जाता है, अर्थात् lacI और सीआईआई transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,३२,३३,३४,३५,३६, ३७,३८,३९,४०,४१,४२,४३,४४,४५ , ४६ , ४७. λ का चयन सीआईआई परख λLIZ शटल वैक्टर के अंगों से व्युत्पंन कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए की वसूली पर आधारित है/1,2,25 . बरामद λLIZ शटल वैक्टर तो λ फेज एक संकेतक मेजबान ई कोलाईसंक्रमण में सक्षम सिर में पैक कर रहे हैं । इसके बाद, संक्रमित बैक्टीरिया चुनिंदा शर्तों के तहत हो रहे हैं, जो सीआईआई transgene1,3में उत्परिवर्तनों के स्कोरिंग और विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।

यहां, हम λ का चयन करें सीआईआई परख, जो कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए के अलगाव के होते है के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन/ इन विट्रोमें इलाज ट्रांसजेनिक पशु के अंगों/vivo में एक परीक्षण परिसर के साथ, λLIZ शटल वैक्टर की पुनः प्राप्ति जीनोमिक डीएनए से, संक्रामक λ phages में वैक्टर की पैकेजिंग, bacteriophages के साथ मेजबान ई. कोलाई के संक्रमण, सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति का निर्धारण करने के लिए चुनिंदा शर्तों के तहत सीआईआई-म्यूटेंट की पहचान, और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण के लिए सीआईआई उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम की स्थापना । प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक माउस के लिए लागू किया जा सकता है/चूहा सेल संस्कृतियों में इलाज के साथ इन विट्रो एक रासायनिक/ब्याज की शारीरिक एजेंट, या इसी जानवरों के ऊतकों/परीक्षण रसायन के साथ vivo में इलाज/ 2,4,४८,४९,५०,५१,५२. λ चयन सीआईआई की परख की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति चित्रा 1में दिखाया गया है ।

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Protocol

1. माउस भ्रूण Fibroblasts से जीनोमिक डीएनए अलगाव

नोट: प्राथमिक माउस भ्रूण fibroblasts C57BL/6 आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ बी एम ट्रांसजेनिक चूहों से व्युत्पंन भ्रूण से अलग कर रहे हैं, प्रकाशित प्रोटोकॉल५३के अनुसार । इस प्रोटोकॉल के लिए शुरू सामग्री 1 x 106 के लिए 1 x 107 भ्रूण fibroblast एक परीक्षण यौगिक बनाम नियंत्रण के साथ इलाज कोशिकाओं के होते हैं । मानक विधियों का उपयोग कर इन कक्षों की कटाई और गिनती का संदर्भ10,५४,५५में वर्णन किया गया है ।

  1. एक बफर तैयार (०.३ मीटर सुक्रोज, ६० एमएम KCl, 15 एमएम NaCl, ६० एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ८.०, ०.५ एमएम spermidine, ०.१५ एमएम spermine, और 2 एमएम EDTA), बफर बी (१५० एमएम NaCl और 5 एमएम EDTA, पीएच ७.८), और बफर सी (20 एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ८.० , 20 मिमी NaCl, 20 मिमी EDTA, और 1% एसडीएस) अग्रिम में, और कमरे के तापमान पर संरक्षित करने के लिए (आरटी) एक वर्ष तक के लिए५४,५५.
  2. 2 में कोशिकाओं reसस्पेंड-4 मिलीलीटर बफर एक में एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब बार द्वारा pipetting ऊपर और नीचे एक विस्तृत बोर का उपयोग कर १,००० µ l पिपेट टिप.
  3. एक खंड जोड़ें (2 – 4 एमएल) बफ़र a युक्त 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (उदा, Nonidet P40) एक ग्लास सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर ।
  4. 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब मशीन ।
  5. आर टी पर 5 मिनट के लिए १,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक
  6. supernatant त्यागें और 10 – 15 मिलीलीटर बफर एक ग्लास सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर के साथ गोली धो लो ।
  7. 2 में गोली reसस्पेंड-4 एमएल बफर बी
  8. एक खंड जोड़ें (2-4 एमएल) बफर सी युक्त ६०० µ g/mL proteinase K.
  9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए ट्यूब मशीन ।
  10. १०० µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए RNase ए जोड़ें ।
  11. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 1 एच के लिए ट्यूब मशीन ।
  12. एक खंड जोड़ें (2-4 एमएल) phenol (०.१ एम Tris में संतृप्त-एचसीएल, पीएच 8.0): क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (25:24:1 vol/
    नोट: Phenol एक गंभीर स्वास्थ्य खतरा पैदा कर सकते है और अत्यधिक सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए । Phenol त्वचा के लिए अत्यधिक संक्षारक है और आसानी से इसके माध्यम से अवशोषित, और अंय प्रभाव दर्शाती है । जब हैंडलिंग phenol, हमेशा डबल gloving का उपयोग करें, सुरक्षात्मक eyewear पहनते हैं, और एक रासायनिक धुएं हुड में काम करते हैं ।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ट्यूब रोटेटर पर 5 मिनट के लिए ट्यूब पलटने से अच्छी तरह से मिलाएं ।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
  15. एक गिलास सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर एक नया ट्यूब के लिए जलीय चरण (ऊपर परत) निकालें ।
  16. दोहराने phenol: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब निष्कर्षण 1 से 3 बार जब तक जलीय चरण स्पष्ट है और इंटरफ़ेस अब पंकिल है ।
  17. जोड़ें 1/10 volume (200-400 µ एल) 3m सोडियम एसीटेट, पीएच ५.२ ।
  18. जोड़ें २.५ मात्रा (5-10 मिलीलीटर) १००% इथेनॉल (ठंडा) और धीरे 2 के लिए हाथ से ट्यूब पलटना-3 मिनट ।
  19. एक गिलास हुक के साथ डीएनए स्पूल और एक नई ट्यूब को हस्तांतरण 1-5 मिलीलीटर ७०% इथेनॉल और यह अच्छी तरह से धो । वैकल्पिक रूप से, उच्च गति पर ट्यूब केंद्रापसारक (३,५०० एक्स जी) 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए गोली और यह अच्छी तरह से धो 1 के साथ-5 मिलीलीटर ७०% इथेनॉल ।
  20. आर टी पर उच्च गति (३,५०० x g) पर ट्यूब केंद्रापसारक, supernatant को हटाने, और हवा 10-15 मिनट के लिए डीएनए शुष्क ।
  21. 10 में डीएनए भंग-100 µ एल ते बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी EDTA, पीएच ७.५), और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर (एक महीने तक के छोटे भंडारण के लिए) या पर-20 ° c (अब भंडारण अवधि के लिए). λ के लिए डीएनए के लिए इष्टतम एकाग्रता का चयन करें सीआईआई परख 0.5 है – 1.0 µ g/µ l (ते बफर में)५६.

2. इन विट्रो पैकेजिंग प्रतिक्रिया

  1. एक पैकेजिंग प्रतिक्रिया के प्रति, जोड़ें ~ 5 µ जी जीनोमिक डीएनए (अंतिम मात्रा: 8-12 µ एल, जीनोमिक डीएनए एक परीक्षण यौगिक या नियंत्रण के साथ इन विट्रो में इलाज माउस से धारा 1 में अलग किया गया था fibroblasts युक्त ट्यूब करने के लिए पहले रिएक्शन मिक्स (~ 10 µ l).
    नोट: घर में तैयार या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध λ पैकेजिंग निष्कर्षों का उपयोग विभिंन प्रयोगशालाओं में किया जाता है । वाणिज्यिक पैकेजिंग निकालें किट में यहां इस्तेमाल किया५६ ( सामग्री की तालिकादेखें), लाल ट्यूबों पहली प्रतिक्रिया मिश्रण निहित (~ 10 µ एल) और ब्लू ट्यूब दूसरी प्रतिक्रिया मिश्रण समाहित (~ ७० µ l के लिए कम से 5 प्रतिक्रियाओं).
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए ट्यूब मशीन ।
  3. आवश्यक मात्रा में जोड़ें (~ 12 µ एल) दूसरी प्रतिक्रिया मिश्रण के ट्यूब करने के लिए.
  4. 30 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त ९० मिनट के लिए ट्यूब मशीन ।
  5. जोड़ें SM बफर के १.१ मिलीलीटर ट्यूब ।
    नोट: इस समाधान की 1 मिलीलीटर (यानी, पैकेजिंग रिएक्शन मिक्सचर) का इस्तेमाल स्क्रीनिंग λ सीआईआई-म्यूटेंट के लिए किया जाएगा । शेष titering के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    1. ५.८ g NaCl, २.० g MgSO4. 7H2O, ५० मिलीलीटर 1 M Tris-HCl (pH ७.५), और 5 मिलीलीटर 2% (w/v) जिलेटिन को मिलाकर एसएम बफर तैयार करें । 1 लीटर के अंतिम वॉल्यूम के लिए डीएच2O जोड़ें, 30 min. Store के लिए आटोक्लेव के लिए कमरे के तापमान पर एक वर्ष तक ।
  6. आरटी (जोरदार भंवर) में 10 एस के लिए पैक डीएनए नमूना युक्त ट्यूब भंवर ।
  7. पल्स एक microcentrifuge में ट्यूब स्पिन और बर्फ पर स्टोर जब तक उपयोग करने के लिए तैयार. यदि नमूना पैकेजिंग के एक ही दिन के भीतर इस्तेमाल किया जा करने के लिए नहीं जा रहा है, पैक डीएनए नमूना के प्रति मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म के ५० µ एल जोड़ने, धीरे भंवर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 2 सप्ताह.

3. ई. कोलाई G1250 बैक्टीरियल संस्कृति की तैयारी

  1. चढ़ाना से पहले दो दिन से कम, ई कोलाई (ई. कोलाई) G1250 से कुछ जीवाणु लकीर प्लेटें बनाने TB1-कनमीसिन आगार प्लेटों पर ।
    1. TB1-कनमीसिन आगार प्लेटें निम्नानुसार तैयार करें । मिक्स ५.० g NaCl, १०.० g कैसिइन peptone, व १२.० g आगर. जोड ८०० एमएल डीएच2ओ. एड 1 एमएल ०.१% Thiamine हाइडरोक्लॉराइड । NaOH या एचसीएल के साथ ७.० के लिए पीएच समायोजित करें । 1 लीटर के अंतिम खंड में डीएच2जोड़ें ।
    2. मिश्रण अच्छी तरह से और 30 मिनट के लिए आटोक्लेव ५५ ° c करने के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें । जोड़ें ५०.० मिलीग्राम कनमीसिन और मिश्रण । बाँझ १०० मिमी पेट्री व्यंजन (पकवान प्रति 20-25 मिलीलीटर) में डालो । दो सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट्स स्टोर ।
  2. न्यूनतम 24 घंटे के लिए एक स्टेशनरी 30 डिग्री सेल्सियस मशीन में बैक्टीरियल लकीर प्लेटें ।
  3. चढ़ाना से पहले एक दिन, TB1 तरल मध्यम के १०० µ एल के साथ 10 मिलीलीटर गठबंधन 20% (डब्ल्यू/वी) माल्टोज़-1 M MgSO4 समाधान में एक बाँझ ५० एमएल पेंच कैप शंकु ट्यूब.
    1. TB1 लिक्विड मीडियम को निम्नानुसार तैयार करें । ५.० g NaCl और १०.० g कैसिइन peptone को मिलाएं, फिर ८०० ml डीएच2O, 1 मिलीलीटर ०.१% Thiamine हाइडरोक्लॉराइड जोड़ें, और pH को NaOH या HCl के साथ ७.० पर समायोजित करें । फिर 1 लीटर के एक अंतिम मात्रा में डीएच2O जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और 30 मिनट के लिए आटोक्लेव के लिए आर टी पर तीन महीने के लिए मध्यम स्टोर ।
    2. 20% (w/v) माल्टोज़-1 M MgSO4 को निम्नानुसार तैयार करें । मिक्स २०.० g माल्टोज़ और २४.६ g MgSO4. 7H2हे, तो डीएच2ओ जोड़ने के लिए एक अंतिम मात्रा १०० मिलीलीटर । फ़िल्टर बंध्याकरण और 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. जीवाणु लकीर प्लेट से कई कालोनियों के साथ तरल माध्यम Inoculate एक बाँझ inoculating पाश५६का उपयोग कर ।
  5. जोरदार मिलाते (250-300 rpm) के साथ एक 30 ° c मिलाते हुए मशीन में रात भर तरल संस्कृति की मशीन ।
  6. चढ़ाना के दिन पर, 10 मिनट के लिए RT पर बैक्टीरियल कोशिकाओं गोली के लिए १,५०० x जी पर G1250 तरल संस्कृति युक्त शंकु ट्यूब केंद्रापसारक ।
  7. supernatant को त्यागें और 10 मिमी MgSO4में से 10 मिलीलीटर में सेल गोली स्थगित ।
  8. एक यूवी की तुलना spectrophotometer का उपयोग कर तरंग दैर्ध्य ६०० एनएम पर सेल निलंबन के 1:10 कमजोर पड़ने के अवशोषण को मापने (उदा., १०० µ l सेल सस्पेंशन + ९०० µ l 10 mM MgSO4)५६.
  9. सेल निलंबन 10 मिमी MgSO4के साथ ०.५ के एक अंतिम आयुध डिपो६०० को पतला । G1250 ई. कोलाई के आयुध डिपो के साथ तैयार निलंबन६०० = ०.५ ' G1250 चढ़ाना संस्कृति ' के रूप में जाना जाता है ।
  10. बर्फ पर G1250 चढ़ाना संस्कृति की दुकान और 1-2 एच के भीतर का उपयोग करें ।

4. पैक डीएनए नमूने चढ़ाना

  1. एक पैक डीएनए नमूना प्रति, सोलह बाँझ 14 x १०० mm2 गोल-नीचे ट्यूब और सोलह TB1 आगार प्लेटें तैयार करते हैं । प्रत्येक सेट से दस स्क्रीनिंग के लिए और छह titering के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (तीन के लिए Titer 20 और तीन Titer १०० के लिए) ।
    1. TB1 आगार प्लेटें निम्नानुसार तैयार करें । मिश्रण ५.० ग्राम NaCl, १०.० ग्राम कैसिइन peptone, और १२.० ग्राम आगर, फिर इसमें ८०० एमएल डीएच2ओ, और 1 एमएल ०.१% Thiamine हाइडरोक्लॉराइड जोड़ें । NaOH या HCl के साथ ७.० करने के लिए पीएच समायोजित करें, और 1 एल के एक अंतिम मात्रा के लिए डीएच2O जोड़ें ।
    2. मिश्रण अच्छी तरह से और 30 मिनट के लिए आटोक्लेव मिश्रण ५५ ° c करने के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें, तो यह बाँझ १०० mm पेट्री व्यंजन में डालना (20 – डिश प्रति 25 मिलीलीटर). प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर दो सप्ताह तक के लिए स्टोर ।
      नोट: TB1 आगार प्लेटों का उपयोग करने के लिए पहले से कम 24 ज तैयार किया जाना चाहिए ।
  2. Aliquot २०० प्रत्येक दौर-नीचे ट्यूब में G1250 चढ़ाना संस्कृति के µ एल ।
  3. titering के लिए, पैक डीएनए नमूना के एक 1:100 कमजोर पड़ने बनाने के लिए और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण (यानी, 10 µ एल पैक डीएनए नमूना + ९९० µ एल एसएम बफर).
  4. जोड़ें 20 µ तीन Titer 20 ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए 1:100 कमजोर पड़ने के एल ।
  5. तीन Titer १०० ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए 1:100 कमजोर पड़ने के १०० µ एल जोड़ें ।
  6. स्क्रीनिंग के लिए, दस स्क्रीनिंग ट्यूब में से प्रत्येक के लिए 'पतला ' पैक डीएनए नमूना के १०० µ एल जोड़ें ।
  7. प्रक्रिया सभी titering और स्क्रीनिंग ट्यूब (2 x 3 + 10 = 16 ट्यूबों), के रूप में इस प्रकार है: अच्छी तरह से लगभग 10 एस के लिए भंवर से मिश्रण है, और फिर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन के लिए मेजबान ई. कोलाई phages adsorb अनुमति देते हैं ।
  8. जोड़ें २.५ मिलीग्राम माइक्रोवेव पिघला हुआ TB1 शीर्ष आगर (५५ डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा) प्रत्येक titer या स्क्रीनिंग ट्यूब के लिए, (धीरे) भंवर से तुरंत मिश्रण है, और उचित titer या स्क्रीनिंग TB1 आगार प्लेटों में डाल ।
    1. TB1 शीर्ष आगार निम्नानुसार तैयार करें । मिक्स ५.० g NaCl, १०.० g कैसिइन peptone, and ७.० g आगर, तो ८०० ml डीएच2ओ जोड़ें. 1 मिलीलीटर ०.१% Thiamine हाइडरोक्लॉराइड जोड़ें, फिर NaOH या एचसीएल के साथ पीएच को ७.० से समायोजित करें । अंत में, 1 लीटर के अंतिम खंड में डीएच2O जोड़ें ।
    2. मिश्रण अच्छी तरह से और आटोक्लेव के लिए 20-25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर करने के लिए तीन महीने ।
    3. पहले का उपयोग करने के लिए, एक माइक्रोवेव में तैयार TB1 शीर्ष आगर पिघल, अच्छी तरह से मिश्रण है, और एक पानी स्नान में ५५ ° c करने के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
      नोट: पिघला हुआ और ठंडा TB1 शीर्ष प्रत्येक titer या स्क्रीनिंग ट्यूब की सामग्री के लिए जोड़ा गया है, और मिश्रण के बाद, उचित titer या स्क्रीनिंग TB1 आगार प्लेटों में डाला जाता है ।
  9. प्लेटें 15 के लिए खड़े हो जाओ-कमरे के तापमान पर 30 मिनट, ढक्कन अझर को रोकने के साथ ।
  10. प्लेटों को पलटना और एक स्थिर 24 डिग्री सेल्सियस मशीन और 46 के लिए मशीन में दस स्क्रीनिंग प्लेट जगह-48 ज (यानी, चुनिंदा शर्तों) और एक स्थिर ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में छह titer प्लेटें और 24 घंटे के लिए मशीन/(यानी, गैर-चयनात्मक शर्तें) ।
    नोट: गुणवत्ता आश्वासन और परिणाम के मानकीकरण के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नियंत्रण फेज समाधान ज्ञात उत्परिवर्ती आवृत्ति के साथ wildtype और उत्परिवर्ती सीआईआई के एक मिश्रण युक्त पैक डीएनए नमूनों के साथ चढ़ाया जाता है और सभी में शामिल परख५६चलाता है ।

5. सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति का निर्धारण करने के लिए Titer और स्क्रीनिंग प्लेटों की जांच

  1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे की मशीन के बाद, तीन Titer 20 प्लेटों और Titer १०० प्लेटों में से प्रत्येक में गठित सजीले टुकड़े की संख्या की गणना । अधिक आसानी से सजीले टुकड़े की पहचान करने के लिए, एक सफेद प्रकाश बॉक्स के बगल में और ढक्कन के साथ एक काले रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ थाली पकड़ ( चित्रा 2देखें).
  2. Titer 20 प्लेटों और Titer १०० प्लेट्स (तपसिल, प्रत्येक) के प्रत्येक सेट में गिना सजीले टुकड़े की संख्या का एक औसत (मतलब) बनाओ ।
  3. titer प्लेटों के सेट से औसत संख्या चुनें कि 50 की सीमा के निकटतम जाता है-थाली प्रति 200 पट्टिका सेट ।
  4. इस प्रकार के रूप में दस स्क्रीनिंग प्लेटों में दिखलाई सजीले टुकड़े की कुल संख्या की गणना:
    कुल पट्टिकाएं दिखलाई जाती है = (titer प्लेट्स के चुने हुए सेट में पट्टिकाओं की संख्या का मतलब चुना titer प्लेट के प्रति प्रयुक्त कमजोर पड़ने के µ l का ÷ number) एक्स कमजोर पड़ने फैक्टर स्क्रीनिंग प्लेट प्रति पैक डीएनए नमूने के µ एल के एक्स नंबर [१०० µ l/प्लेट] एक्स स्क्रीनिंग प्लेटों के नंबर [10] ।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि Titer के सेट में थाली प्रति पट्टिका की संख्या 20 प्लेटें १२८ है और Titer १०० प्लेटों के सेट में इसी संख्या ४७८ है, संख्या १२८ की कुल संख्या की गणना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा पट्टिकाओं की जांच निम्नानुसार:
    (१२८ ÷ 20) x १०० [कमजोर पड़ने का कारक] x १०० [µ l/प्लेट x 10 [प्लेटें] = ६४०,०००
    यह ५,००० या १,००० द्वारा पट्टिकाओं की मतलब संख्या गुणा करने के लिए बराबर है, अगर औसत संख्या Titer 20 प्लेट या Titer १०० प्लेटें, क्रमशः से गिनती पर आधारित है ।
  5. 24 डिग्री सेल्सियस पर 46-48 एच मशीन के बाद, दस स्क्रीनिंग प्लेटों में गठित सजीले टुकड़े की कुल संख्या की गणना (धारा ५.१ में दिए गए निर्देशों का पालन करें) ।
    नोट: सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति स्क्रीनिंग प्लेटों में गठित सजीले टुकड़े की कुल संख्या के द्वारा बनाई गई पट्टिकाओं की संख्या में विभाजित करके गणना की जाती है । उपरोक्त उदाहरण का उपयोग करना, यदि दस स्क्रीनिंग प्लेटों में गिनी जाने वाली पट्टिकाओं की कुल संख्या ११२ है, तो इस डीएनए नमूने के लिए सीआईआई उत्परिवर्ती फ्रीक्वेंसी ११२ ÷ ६४०,००० = १७.५ x 10-5होगी ।

6. ख्यात λ सीआईआई म्यूटेंट, पीसीआर प्रवर्धन, और डीएनए अनुक्रमण का सत्यापन

  1. एक बाँझ, वाइड-बोर प्लास्टिक टिप के साथ प्रश्न में पट्टिका कोर और इसे निष्कासित (ऊपर और नीचे pipetting द्वारा) एक बाँझ microcentrifuge युक्त ट्यूब में बाँझ एसएम बफर के ५०० µ l.
  2. कमरे के तापमान, या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में कम से 2 ज के लिए गर्मी, फेज कणों की अनुमति के लिए आगर प्लग से elute करने के लिए ।
  3. एक बाँझ 14 एक्स १०० मिमी में2 गोल नीचे ट्यूब, फेज समाधान के 1 µ एल के साथ G1250 चढ़ाना संस्कृति के २०० µ एल मिश्रण, और आरटी पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  4. ५५ डिग्री पिघला हुआ TB1 शीर्ष आगार के २.५ मिलीलीटर का उपयोग कर नमूना प्लेट और 46 के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट मशीन-48 एच (चुनिंदा शर्तों), के रूप में 4.8 वर्गों में वर्णित-4.10 ।
  5. एक बार माध्यमिक पट्टिकाओं का गठन किया है, एक पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए ध्यान से एक भी अच्छी तरह से पृथक सत्यापित λ सीआईआई-उत्परिवर्ती पट्टिका लेने (निचले आगार को छूने से बचें) ।
    नोट: reख्यात सीआईआई उत्परिवर्ती सजीले टुकड़े दो प्रयोजनों के कार्य करता है: (i) चढ़ाना कलाकृतियों कभी-कभार छोटे आकार सजीले टुकड़े के लिए गलत हो सकता है; और (ii) एक agarose एक स्क्रीनिंग प्लेट से लिया कोर गैर उत्परिवर्ती फेज (एस) एक उत्परिवर्ती फेज के साथ शामिल हो सकते हैं । एक कम घनत्व चढ़ाना से माध्यमिक पट्टिका पीसीआर और बाद में डीएनए अनुक्रम विश्लेषण के लिए एक दूषित उत्परिवर्ती टेम्पलेट प्रदान करेगा ।
  6. इस पट्टिका को एक microcentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करें जिसमें 25 µ l को pipetting करके ऊपर और नीचे तक डबल-आसुत पानी होता है ।
  7. 5 मिनट के लिए उबलते पानी में ट्यूब प्लेस ।
  8. आरटी में 3 मिनट के लिए अधिकतम गति (१८,००० x g) पर केंद्रापसारक
  9. supernatant के 10 µ l का अंतरण तुरंत एक नई microcentrifuge ट्यूब से होता है जिसमें एक पीसीआर mastermix की ४० µ l होती है जिसमें रिएजेंटों की अंतिम सांद्रता 1 x Taq पीसीआर बफर होती है, 10 pmol प्रत्येक फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरी, प्रत्येक nmol की १२.५ dNTP , और २.५ यू ऑफ Taq डीएनए पोलीमरेज़.
    नोट: आगे और रिवर्स प्राइमरों निंनानुसार हैं: 5 '-CCACACCTATGGTGTATG-3 ' (पदों-६८ से-५० के सापेक्ष सीआईआई प्रारंभ codon) और 5 '-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3 ' (पदों + ३४५ को + ३६५ के सापेक्ष सीआईआई प्रारंभ codon), क्रमशः ।
  10. निंनलिखित सायक्लिंग मापदंडों का उपयोग कर टेंपलेट बढ़ाना: ९५ ° c पर एक 3 मिनट विकार, ९५ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 30 चक्र के बाद, ६० डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, और ७२ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, ७२ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की एक अंतिम विस्तार के साथ ।
  11. निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर शोधन किटों का उपयोग करते हुए सीआईआई जीन और पार्श्व क्षेत्र युक्त ४३२ बीपी पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें ।
  12. एक उपयुक्त अनुक्रमण मंच का उपयोग कर डीएनए अनुक्रमण करते हैं, और सीआईआई transgene में उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए परिणामी डीएनए दृश्यों का विश्लेषण) (नीचे नोट देखें).
    नोट: यह सबसे अच्छा संदर्भ सीआईआई अनुक्रम के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, जैसे वेब आधारित टी कॉफी अनुक्रम संरेखण सर्वर के साथ संरेखण द्वारा हासिल की है । प्रोग्राम का उपयोग करने के बारे में निर्देशों के लिए, यात्रा: http://tcoffee.crg.cat/

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Representative Results

डेटा वितरण के आधार पर, पैरामीट्रिक या गैर पैरामीट्रिक परीक्षण उपचार और नियंत्रण समूहों के बीच सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति में अंतर के महत्व को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है (यानी, सहज उत्परिवर्ती आवृत्तियों बनाम प्रेरित) . विभिंन उपचार समूहों में प्रेरित सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्तियों की तुलना के रूप में लागू विभिंन (pairwise) सांख्यिकीय परीक्षणों के द्वारा किया जाता है । एडंस और Skopek के अतिगुणोत्तर माध्य परीक्षण सामांयतः के लिए समग्र प्रेरित-और सहज उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा ५७ तुलना में इस्तेमाल किया है, हालांकि χ 2 परीक्षण या विचरण के विश्लेषण (ANOVA) के रूप में अंय परीक्षणों, भी आवृत्ति की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उत्परिवर्तन के प्रत्येक विशिष्ट प्रकार के (जैसे, संक्रमण, transversion, प्रविष्टि, या विलोपन) के बीच प्रेरित और नियंत्रण उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा, या विभिंन उत्परिवर्तन विभिंन रसायनों/एजेंटों या समान की खुराक अलग द्वारा प्रेरित में स्पेक्ट्रा के बीच रासायनिक एजेंट/

चित्रा 3 प्रकाशित अध्ययनों से उत्परिवर्ती आवृत्ति डेटा का एक संकलन है जिसमें हम दिखा दिया है कि माउस भ्रूण fibroblasts में रिश्तेदार सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति में वृद्धि की हद तक विभिन्न रसायनों के साथ इलाज किया और/ physicalagents कुछ-कई सौ गुना से भिन्न हो सकते हैं, परीक्षण यौगिक के mutagenic 'शक्ति' पर निर्भर करता है । सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण गुना बढ़ जाती है माउस भ्रूण fibroblasts acrylamide12, glycidamide14, aflatoxinB1 (AFB1)22, tamoxifen18के साथ इलाज के लिए दिखाए जाते हैं, δ-aminolevulinic एसिड (δ-ाला) प्लस कम खुराक पराबैंगनी प्रकाश एक (UVA: λ > 320 − 400 एनएम)15, benzo (क) pyrene दिओल epoxide (बी (ए) PDE)19, और equilethal की UVA खुराक, UVB (λ = 2 80 − 320 एनएम), और अनुकरणीय सूर्यप्रकाश यूवी (SSL) 21 (देखें चित्रा 3) ।

चित्रा 4 उत्परिवर्तनों के ' अनुक्रम-विशिष्टता ' का एक प्रदर्शन है जिसमें हमने सीआईआई के transgene में mouseembryonicfibroblasts विकिरणित में UVBrelativetocontrol23के साथ विशेष प्रकार के उत्परिवर्तन की प्रेरण दिखाई है । UVB-प्रेरित उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम न्यूक्लियोटाइड dinucleotides में एकल या मिलकर सी → टी संक्रमण के सापेक्ष आवृत्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि की विशेषता है ।

Figure 1
चित्रा 1: λ की योजनाबद्ध प्रस्तुति का चयन करें सीआईआई परख । परख λLIZ शटल वैक्टर, जो एक उत्परिवर्तन रिपोर्टर जीन के रूप में सीआईआई transgene शामिल की पुनर्प्राप्ति पर आधारित है, ट्रांसजेनिक से व्युत्पंन प्रसंस्कृत कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए से एक परीक्षण परिसर के साथ इन विट्रो में इलाज कुतर या vivo में इलाज किया रासायनिक/एजेंट (A और B) के साथ संबंधित जानवरों के ऊतकों/ बचाया वैक्टर λ फेज प्रमुखों कि एक उपयुक्त मेजबान ई. कोलाई (सी और डी) संक्रमित कर सकते है में पैक कर रहे हैं । संक्रमित जीवाणु तो चुनिंदा शर्तों के तहत हो रहे है सीआईआई transgene1,2,3,25में उत्परिवर्तनों के स्कोरिंग और विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ५२ (ङ) । प्रेरित सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति और डीएनए अनुक्रमण द्वारा उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम की स्थापना का निर्धारण एफ और जीमें उल्लिखित हैं । प्रेरित-और सहज उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा विभिंन स्वरूपों में कल्पना कर रहे हैं । उदाहरण प्रयोजनों के लिए, हमने एक ऐसा स्वरूप हाइलाइट किया है जिसमें प्रेरित सीआईआई उत्परिवर्तन संदर्भ अनुक्रम के ऊपर लिखे गए हैं, जबकि सहज उत्परिवर्तन (नियंत्रण) संदर्भ अनुक्रम (एच) के नीचे लिखे गए हैं । एक रूपांतरित आधार की ऊंचाई (यानीउत्परिवर्तनों की अपनी आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है, उच्च आधार है, और अक्सर रूपांतरित हो) । एक रूपांतरित आधार से ऊपर की संख्या है कि आधार में उत्परिवर्तनों की प्रतिशत आवृत्ति से संकेत मिलता है । हटाए गए आधारों को रेखांकित किया जाता है । संमिलित की गई कुर्सियां एक तीर से दिखाई जाती हैं । कुर्सियां के नीचे संख्याएं संदर्भ न्यूक्लियोटाइड स्थितियां हैं । डेटा एक प्रकाशित अध्ययन23से हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: titer प्लेटों में गिनती पट्टिकाएं । और अधिक आसानी से पट्टिकाओं की पहचान करने के लिए, प्लेटें एक सफेद प्रकाश बॉक्स के बगल में और हटाया ढक्कन के साथ एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ आयोजित कर रहे हैं । Titer 20 प्लेट (ए) और Titer १०० प्लेट (बी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
3 चित्रा: माउस भ्रूण में सीआईआई transgene के उत्परिवर्ती आवृत्तियों नियंत्रण की तुलना में विभिन्न रसायनों और/या शारीरिक एजेंटों के साथ इलाज किया fibroblasts । डाटा acrylamide12पर प्रकाशित अध्ययन से हैं, glycidamide14, aflatoxinB1 (AFB1)22, tamoxifen18, δ-aminolevulinic एसिड (δ-ाला) प्लस कम खुराक पराबैंगनी प्रकाश ए (UVA: λ > 320 − 400 एनएम)15, benzo (ए) pyrenediol epoxide (बी (ए) PDE)19, और UVA के equilethal खुराक, UVB (λ = 280 − 320 एनएम), और नकली सूरज की रोशनी यूवी (SSL)21। को कुशलतापूर्वक माउस भ्रूण fibroblast कोशिकाओं में tamoxifen metabolize, हम S9-सक्रियण प्रणाली (S9 मिश्रण) Aroclor १,२५४-प्रेरित चूहे जिगर की तैयारी और cofactor रिएजेंट22से मिलकर इस्तेमाल किया । स्वास्थ्यकर्मी-और नियंत्रण नमूनों के बीच सभी अंतर सांख्यिकीय रूप से p < 0.05 पर महत्वपूर्ण हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: नियंत्रण के सापेक्ष UVB के साथ माउस भ्रूण fibroblasts विकिरणित में सीआईआई transgene के उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा । डेटा एक प्रकाशित अध्ययन23से हैं । कतरा सभी संक्रमण के समकक्षों दर्पण (उदा, जी → ए और सी → टी) और transversions (जैसे, जी → टी और सी → एक या जी → सी और सी → जी) संयुक्त कर रहे हैं । Ins: प्रविष्टि; Del: हटाना । UVB-प्रेरित उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम न्यूक्लियोटाइड dinucleotides में एकल या मिलकर सी → टी संक्रमण के सापेक्ष आवृत्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि की विशेषता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

λ का चयन सीआईआई की परख सीआईआई transgene में उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है जीनोमिक के अंगों से व्युत्पंन कोशिकाओं के डीएनए से बरामद3। इन ट्रांसजेनिक पशुओं के जीनोम chromosomally एकीकृत λLIZ शटल वेक्टर, जो सीआईआई (२९४ बीपी) और lacI (१,०८० बीपी) transgenes, उत्परिवर्तन रिपोर्टर जीन1के रूप में किया जाता है की कई मिलकर प्रतियां शामिल हैं, 2 , 25. λ चयन सीआईआई परख कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए से λLIZ शटल वैक्टर की पुनर्प्राप्ति पर आधारित है/ट्रांसजेनिक पशुओं के ऊतकों, λ फेज प्रमुखों कि एक उचित मेजबान संक्रमित कर सकते है में बचाया वैक्टर की पैकेजिंग द्वारा पीछा ई. कोलाई। इसके बाद, संक्रमित बैक्टीरिया चुनिंदा शर्तों के तहत हो रहे हैं सीआईआई transgene में उत्परिवर्तनों के स्कोरिंग और विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए ( चित्रा 1)1,3देखें । λ चयन सीआईआई परख बड़े पैमाने पर रसायनों और/या शारीरिक एजेंटों की एक विस्तृत श्रृंखला के mutagenicity परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया गया है (संदर्भ2,४९में समीक्षा की) । परख सफलतापूर्वक ट्रांसजेनिक माउस/चूहा सेल विभिंन रसायनों और/या शारीरिक एजेंटों के साथ इन विट्रो में इलाज संस्कृतियों के लिए लागू किया गया है, और ऊतक संबंधित जानवरों के विभिंन परीक्षण के साथ vivo में इलाज के अंगों/ रसायन एजेंटों/4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , ३४ , ५८ , ५९ , ६० , ६१ , ६२ , ६३ , ६४ , ६५ , ६६ , ६७ , ६८ , ६९ , ७० , ७१ , ७२ , ७३ , ७४ , ७५.

λ का चयन करें सीआईआई परख ट्रांसजेनिक के प्रसंस्कृत कोशिकाओं में एक परीक्षण परिसर का प्रतिनिधित्व करता है के साथ इलाज किया, कई मायनों में, vivo में mutagenicity प्रयोगों के लिए एक व्यवहार्य विकल्प संबंधित जानवरों के साथ इलाज किया परीक्षण रासायनिक/एजेंट 3. एक सामांय नियम के रूप में, इन विट्रो मॉडल vivo पशु मॉडलों में अपने समकक्ष पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं, के रूप में वे बहुत कम श्रम गहन और महंगा कर रहे हैं, अब तक कम समय की आवश्यकता के लिए पूरा हो, और सबसे महत्वपूर्ण बात, नहीं जानवरों2,५०,५२के प्रत्यक्ष उपयोग शामिल है । एक ही समय में, इन विट्रो मॉडल पूरी तरह से दोहराऊंगा और प्रयोगात्मक पशुओं में संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के बीच रसायनों के pharmacokinetic और pharmacodynamic गुणों में अंतर के कारण mutagenesis के सभी पहलुओं को नहीं हो सकता है vivo में 2 , 3. उदाहरण के लिए, रसायनों जिसका जोखिम के मार्ग साँस लेना (जैसे, सिगरेट का धुआं या इलेक्ट्रॉनिक सिगरेट भाप) केवल इन विट्रो सेल संस्कृतियों में परीक्षण के बाद वे गैसीय या वाष्प से बदल रहे हैं के लिए उत्तरदायी बनाया जा सकता है तरल या घनीभूत, जो उनके फार्माकोकाइनेटिक्स पेचीदा रूपों । इसके अलावा, एक अपूर्ण या अनुपस्थित चयापचय क्षमता इन विट्रो में कुछ रसायनों में परिवर्तित करने के लिए डीएनए-प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में डीएनए का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं, genotoxic रसायनों को vivo में उजागर पशुओं में mutagenicity प्रेरित क्षति2 ,3. हालांकि, इस खामी के लिए क्षतिपूर्ति किया जा सकता है, हद तक अलग करने के लिए, एक बाहरी चयापचय सक्रियण प्रणाली के अलावा द्वारा (यानी, S9 मिश्रण) इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल22करने के लिए.

इसके अलावा, genotoxic रसायनों के लिए वास्तविक जीवन मानव जोखिम की प्रतिकृति/एजेंटों के साथ और अधिक सीमित है इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल विवो मेंप्रयोगात्मक पशुओं के साथ तुलना में । आम तौर पर, मनुष्य कई वर्षों की अवधि में genotoxic एजेंटों की पुरानी खुराक के लिए कुछ दशकों७६,७७,७८को उजागर कर रहे हैं । संस्कृति में कोशिकाओं के परिमित उंर, के रूप में कुतर के अपेक्षाकृत लंबे जीवनकाल की तुलना में (यानी, दिनों/कुछ साल बनाम ) मानव जोखिम की मॉडलिंग के लिए genotoxins अधिक चुनौतीपूर्ण पूर्व मॉडल में2बनाता है, 3. बहरहाल, mutagenicity विश्लेषण के साथ इन इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल एक दिया रासायनिक के genotoxic क्षमता का एक प्रारंभिक संकेत प्रदान कर सकते है/एजेंट (ओं), और परिणामों के डिजाइन के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ' परिष्कृत ' vivo में प्रयोगों जो जानवरों की एक ' कम ' संख्या2,3सुविधा ।

अंत में, λ का चयन करें सीआईआई परख ट्रांसजेनिक के प्रसंस्कृत कोशिकाओं में एक परीक्षण परिसर के साथ इलाज कुतर, या इसी जानवरों का परीक्षण रासायनिक/एजेंट के साथ इलाज किया, mutagenicity परीक्षण के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है । हम सफलतापूर्वक दृष्टिकोण का उपयोग किया है, के रूप में दुनिया भर में अंय अनुसंधान समूह है4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24,३४,५८,५९,६०, ६१,६२,६३,६४,६५,६६,६७,६८,६९, ७०,७१,७२,७३,७४,७५. हाल ही में, हम एक नई तकनीक है जिसमें λ का चयन करें के एक संशोधन के साथ सीआईआई परख अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ एक समय में उत्परिवर्तनों के उच्च प्रवाह विश्लेषण सक्षम बनाता है विकसित करके इस दृष्टिकोण के आवेदनों का विस्तार किया है, लागत, और श्रम प्रभावी ढंग से23।

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Disclosures

सभी लेखक हितों का टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

हम अपने मूल अध्ययन, जिसका परिणाम इस पांडुलिपि में संदर्भित किया गया है (उदाहरण के प्रयोजनों के लिए) के लिए सभी साथियों और सहयोगियों के योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं । ' लेखकों का काम राष्ट्रीय दंत चिकित्सा और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (1R01DE026043) के Craniofacial अनुसंधान संस्थान से अटल बिहारी और कैलिफोर्निया तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम के लिए अटल बिहारी विश्वविद्यालय से अनुदान द्वारा समर्थित है ( TRDRP-26IR-0015) और ST (TRDRP-25IP-0001) । अध्ययन के प्रायोजक अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह, डेटा विश्लेषण, डेटा व्याख्या, रिपोर्ट के लेखन, या प्रकाशन के लिए प्रस्तुत करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

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