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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

우리는 유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 람다 선택 cII 돌연변이 분석 결과 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트 처리에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 접근은 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위한 널리 사용 되었습니다.

Abstract

유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템의 수 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 생쥐와 돌연변이 탐지 시스템 람다 (λ) 선택 cII 되었습니다 고용 했다 변이 실험에 대 한 전 세계 많은 연구 그룹에 의해. 여기, 우리가 선택 하는 람다 cII 돌연변이 분석 결과, 유전자 변형 쥐/쥐의 배양된 세포에 적용 될 수 있는 대 한 자세한 프로토콜 설명 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트와 치료. 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 세포에서 게놈 DNA의 (1) 절연 또는 유전자 변형 동물의 기관/조직 치료 생체 외에서 또는 vivo에서각각, 시험 화합물; (2) 게놈 DNA;에서 mutational 리포터 유전자 (즉, cII transgene) 들고 람다 셔틀 벡터의 복구 (3) 포장 구조 벡터의 전염 성 살 균 소;에 (4) 호스트 박테리아를 감염 하 고 유도 cII 돌연변이;의 전파 수 있도록 선택적 조건 하에서 배양 그리고 (5) 득점 cII-돌연변이 DNA 순서 분석을 cII 돌연변이 주파수 및 돌연변이 스펙트럼, 각각.

Introduction

다양 한 유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 (라고도 BB) 빅 블루 마우스 및 돌연변이 탐지 시스템 λ 선택 cII 있다 변이 실험에 의해 고용 되었다이 그룹 및 많은 다른 연구 그룹 전세계1,2, 3,,45,6,7,,89. 지난 16 년 동안, 우리가이 유전자 변형 동물을 사용 하 여 다양 한 화학 및 물리적 에이전트의 변이 원 성 영향 조사 또는 자신의 해당 미 발달 섬유 아 세포 세포 배양 시험 화합물으로 치료 하 고 이후에 분석은 표현 형 및 λ 선택 cII 분석 결과와 DNA 시퀀싱, 각각10,,1112,,1314 cII transgene의 유전자 형 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. 유전자 변형 동물의 게놈 다중 복사 머리-투-꼬리 concatemer1,,2254 염색체에 통합 된 살 균 소 λ 셔틀 벡터 (λLIZ) 포함 되어 있습니다. ΛLIZ 셔틀 벡터 운반 두 mutational 리포터 유전자, 즉 lacI 및 cII transgenes1,2,25,,2627, 28,29,30,31,32,33,,3435,36, 37,38,39,40,41,42,43,,4445 , 46 , 47. λ 선택 cII 분석 결과 유전자 변형 동물1,2,25의 기관/조직에서 파생 된 세포의 게놈 DNA에서 λLIZ 셔틀 벡터의 회복에 따라 . 복구 된 λLIZ 셔틀 벡터 다음 λ 살 균 소 머리 표시기 호스트 대장균감염의 수에 포장 됩니다. 그 후, 감염 된 박테리아는 점수 및 cII transgene1,3에 있는 돌연변이의 분석에 대 한 수 있도록 선택적 조건 하에서 성장 된다.

여기, 우리가 치료 하는 유전자 변형 동물에 체 외에서의 셀/기관에서 게놈 DNA의 분리를 이루어져 있는 λ 선택 cII 분석 결과 대 한 자세한 프로토콜 설명 /vivo에 는 λLIZ의 시험 화합물, 검색으로 셔틀 벡터 genomic DNA에서 전염 성 λ 페이지, 살 균 소, cII의 id와 호스트 대장균 의 감염에는 벡터의 포장- cII 돌연변이 주파수를 결정 하는 선택적 조건 돌연변이 및 CII 돌연변이 스펙트럼을 설정할 DNA 순서 분석. 프로토콜 유전자 변형 마우스/쥐 셀 문화 치료 체 외에 관심, 화학/물리 에이전트에 적용할 수 또는 해당 동물의 조직/장기에서 치료 vivo에서 테스트 화학/에이전트1, 2,4,48,49,50,,5152. Λ 선택 cII 분석 결과의 프레 젠 테이 션이 회로도 그림 1에 표시 됩니다.

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Protocol

1. 게놈 DNA 절연 마우스 미 발달 섬유 아 세포에서

참고: 기본 마우스 미 발달 섬유 아 세포는53게시 된 프로토콜 따라 BB 유전자 변형 마우스 C57BL/6 유전 배경에서 파생 된 배아에서 격리 됩니다. 1 x 107 배아 섬유 아 세포 세포 제어 복합 대 테스트와 치료 1 x 106 이 프로토콜에 대 한 시작 물자에 의하여 이루어져 있다. 참조10,,5455는 수확 하 고 표준 방법을 사용 하 여 이러한 셀의 계산을 참조 하십시오.

  1. 준비는 (0.3 M 자당, 60 m m KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5 m m spermidine, 0.15 m m spermine와 2 mM EDTA) 버퍼, 버퍼 B (150 m m NaCl 및 5 m m EDTA, pH 7.8), 및 C (20 mM Tris HCl, pH 8.0 버퍼 20 mM NaCl, 20 mM EDTA, 그리고 1 %SDS) 미리, 및 최대 1 년54,55실 온 (RT)에서 보존.
  2. 넓은 사용 하 여 위아래로 pipetting 반복 하 여 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 내경 1000 µ L 피 펫 팁 2-4 mL 버퍼에 셀 resuspend
  3. 한 볼륨 (2-4 mL) 버퍼 A 포함 1 %octylphenoxypolyethoxyethanol (예를 들어, Nonidet P40) 추가 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여.
  4. 5 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.
  5. 1000 x g 실시간에 5 분 동안에 관을 원심
  6. 삭제는 상쾌한 고 10-15 mL 버퍼 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하는 펠 릿을 세척.
  7. 2-4 mL 버퍼 B. 펠 릿 resuspend
  8. 한 볼륨 (2-4 mL)가 버퍼 C에 포함 600 µ g/mL 가수분해 K. 추가
  9. 37 ° c.에 3 h에 대 한 튜브를 품 어
  10. 100 µ g/mL의 최종 농도에 RNase A를 추가 합니다.
  11. 37 ° c.에 추가 1 시간에 대 한 튜브를 품 어
  12. 추가 한 볼륨 (2-4 mL) 페 놀 (0.1에서 포화 M Tris HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl 알코올 (25:24:1 vol/vol).
    참고: 페 놀 심각한 건강 위험 포즈 수 있습니다 고 극단주의 함께 처리 되어야 합니다. 페 놀 피부에 높게 부식성 이며, 그것을 통해 쉽게 흡수 하 고 다른 효과 전시. 이중 gloving 사용 항상 페 놀, 처리, 보호 안경 착용 및 화학 증기 두건.
  13. 튜브 회전에서 4 ° c.에 5 분 동안 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합
  14. 1000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 관을 원심
  15. 수성 단계 (상위 계층) 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 새 튜브를 제거 합니다.
  16. 수성 단계는 명확 하 고 인터페이스는 더 이상 탁 될 때까지 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 추출 1 ~ 3 회 반복 합니다.
  17. 1/10 볼륨 (200-400 µ L) 3 M 아세트산 나트륨, pH 5.2 추가 합니다.
  18. (냉장) 2.5 볼륨 (5-10 mL) 100% 에탄올을 추가 하 고 2-3 분 위해 손으로 부드럽게 튜브를 반전.
  19. 유리 걸이를 가진 DNA 스풀 및 70 %1-5 mL를 포함 하는 새로운 관에 전송 에탄올 철저 하 게 씻어. 또는, 고속 (3500 x g) 튜브 DNA를 작은 그것을 70 %1-5 mL을 철저 하 게 세척 하 4 ° C에서 원심 에탄올.
  20. RT에 고속 (3500 x g) 튜브 원심, 상쾌한, 제거 하 고 10-15 분에 대 한 DNA를 건조.
  21. 10-100 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), DNA를 녹이 고 또는 (더 긴 저장 기간) 동안-20 ° C에서 4 ° C (최대 1 개월의 짧은 스토리지)에 저장. Λ 선택 cII 분석 결과 대 한 DNA에 대 한 최적 농도 0.5-1.0 µ g / µ L (에 테 버퍼)56.

2. 포장 반응 생체 외에서

  1. 1 개 포장 반응 당 ~ 5 µ g 게놈 DNA를 추가 (최종 볼륨: 8-12 µ L, genomic DNA에서 마우스 미 발달 섬유 아 세포 치료 생체 외에서 시험 화합물 이나 컨트롤 섹션 1 에 분리 되었습니다) 첫 번째를 포함 하는 microcentrifuge 튜브를 반응 혼합 (~ 10 µ L)입니다.
    참고: 자체 준비 또는 상용 λ 포장 추출 다른 실험실에 사용 됩니다. 상업 포장에 추출 키트 사용 여기56 ( 테이블의 자료를 참조), 빨간 튜브 포함 된 첫 번째 반응 혼합 (~ 10 µ L) 및 파란색 튜브 포함 된 두 번째 반응 혼합 (적어도 5 반응 ~ 70 µ L).
  2. 30 ° c.에 90 분에 대 한 튜브를 품 어
  3. 튜브를 두 번째 반응 혼합의 필요한 볼륨 (~ 12 µ L)를 추가 합니다.
  4. 30 ° c.에 추가 90 분에 대 한 튜브를 품 어
  5. 튜브를 SM 버퍼의 1.1 mL를 추가 합니다.
    참고:이 솔루션 (즉, 포장 반응 혼합물)의 1 mL 사용 됩니다 λ cII심사-돌연변이. 나머지 titering 사용 될 것입니다.
    1. 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL를 혼합 하 여 SM 버퍼 를 준비 1 M Tris HCl (pH 7.5), 그리고 5 mL 2% (w/v) 젤라틴. DH2O 1 리터, 최대 1 년 동안 실 온에서 30 분이 게에 대 한 고압의 최종 볼륨을 추가 합니다.
  6. 와 10에 대 한 패키지 DNA 샘플을 포함 하는 관 동 RT (활기찬 vortexing)에 s.
  7. 펄스를 사용할 준비가 될 때까지 microcentrifuge에 게 얼음에 튜브를 회전 합니다. 샘플 포장의 같은 날에 내에서 사용 하려고 하지 않습니다, 경우 추가 포장된 DNA의 mL 당 클로 프롬의 50 µ L 샘플, 소용돌이 부드럽게, 그리고 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장.

3. 준비 대장균 G1250 세균성 문화

  1. 최소 2 일 전에 도금, TB1-대 한 천 배지에서 대장균 (대장균) G1250에서 몇 가지 세균성 줄무늬 접시를 확인 합니다.
    1. TB1-대 한 천 배지를 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl, 10.0 g 카 세 인 펩, 그리고 12.0 g 한 천. 800 mL dH2오 추가 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염을 추가 합니다. NaOH와 HCl 추가 7.0에 pH를 조정 dH2O 1 리터의 최종 볼륨을.
    2. 믹스 잘와 30 분 55 ° c에 냉각 하는 허용에 대 한 오토 클레이 브 대 50.0 mg을 추가 하 고 혼합. 살 균 100 mm 페 트리 접시 (접시 당 20-25 mL)에 부 어. 2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장.
  2. 적어도 24 h에 대 한 고정 30 ° C 배양 기에서 세균성 줄무늬 접시를 품 어.
  3. 도금, 전에 1 일 TB1 액체 매체의 10 mL를 100 µ L 살 균 50 mL 스크류 캡 원뿔 관에서 20% (w/v) 맥 아당 1 M MgSO4 솔루션의 결합.
    1. TB1 액체 매체를 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl 및 10.0 g 카 세 인 펩, 800 mL dH2O, 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염을 추가 하 고 NaOH와 HCl 7.0에 pH를 조정. 다음 1 리터의 최종 볼륨을 dH2O를 추가, 최대 3 개월까지 잘하고 압력솥 30 분 저장소 RT에서 매체에 대 한 믹스.
    2. 20% (w/v) 맥 아당 1 M MgSO4 를 다음과 같이 준비 합니다. 20.0 g 맥 아당과 24.6 g MgSO4혼합. 7 H2O, dH2O 100 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다. 필터를 소독 하 고 최대 6 개월까지 4 ° C에서 저장.
  4. 살 균 inoculating 루프56를 사용 하 여 세균성 줄무늬 접시에서 여러 식민지와 액체 매체 접종
  5. 활기찬 동요 (250-300 rpm)으로 인큐베이터를 떨고 30 ° C에서 하룻밤 액체 문화를 품 어.
  6. 도금의 날, 작은 세균 세포를 실시간에 10 분 동안 1500 x g 에서 G1250 액체 문화를 포함 하는 원뿔 튜브 원심.
  7. 삭제는 상쾌한 고 10mm MgSO410 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
  8. 1시 10분의 흡 광도 측정 파장 600 nm 대 일 분 광 광도 계 (예를 들어, 100 µ L 세포 현 탁 액 + 900 µ L 10 m m MgSO4)56를 사용 하 여 세포 현 탁 액의 희석.
  9. 10mm MgSO4로 0.5의 최종 세600 세포 현 탁 액을 희석. OD600 와 G1250 대장균 의 준비 정지 = 0.5 'G1250 도금 문화' 라고 합니다.
  10. 얼음에 G1250 도금 문화를 저장 하 고 1-2 시간 이내에 사용.

4. 도금 패키지 DNA 샘플

  1. 한 패키지 DNA 샘플 당 16 살 균 14 x 100 m m2 라운드-하단 튜브와 16 TB1 한 천 배지를 준비 합니다. 각 세트에서 10 개 심사 및 6 titering (Titer 20 3) 및 Titer 100 세에 대 한 사용 됩니다.
    1. TB1 한 천 배지를 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl, 10.0 g 카 세 인 펩, 12.0 g 한 천, 다음 추가 800 mL dH2O, 그리고 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염. NaOH와 HCl, 7.0에 pH를 조정 하 고 추가 dH2O l. 1의 최종 볼륨을
    2. 잘 혼합 하 고 30 분에 대 한 고압 수 55 ° C에 냉각 후 살 균 100 mm 페 트리 접시 (접시 당 20-25 mL)에 부 어 혼합. 2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장.
      참고: TB1 한 천 배지 적어도 24 h 사용 하기 전에 준비 되어야 한다.
  2. Aliquot 200 µ L의 각 라운드 하단 튜브에 G1250 도금 문화.
  3. Titering에 대 한, 포장된 DNA 샘플의 1: 100 희석 만들고 vortexing (즉, 10 µ L 포장 DNA 샘플 + 990 µ L SM 버퍼)에 의해 잘 혼합.
  4. 각 3 Titer 20 튜브의 1: 100 희석의 20 µ L를 추가 합니다.
  5. 각 3 Titer 100 튜브의 1: 100 희석의 100 µ L를 추가 합니다.
  6. 심사에 대 한, 100 µ L의 추가 'undiluted' 10 심사 관의 각 포장된 DNA 샘플.
  7. 모든 titering 및 심사 관 처리 (2 x 3 + 10 = 16 관), 다음과 같이: 대략 10에 대 한 vortexing에 의해 잘 섞어 s, 그리고 다음 호스트는 페이지 adsorb 대장균 수 있도록 30 분 동안 실내 온도에 품 어.
  8. Microwaved 녹은 TB1 (55 ° C에 냉각) 한 천 각 titer 위쪽 또는 심사 관, 혼합 즉시 vortexing (부드럽게), 2.5 mL를 추가 하 고 적절 한 titer에 붓는 또는 TB1 한 천 배지를 심사.
    1. TB1 최고 천 다음과 같이 준비 합니다. 믹스 5.0 g NaCl, 10.0 g 카 세 인 펩, 및 7.0 g 한 천, 800 mL dH2오 추가 1 mL 0.1% 티 아민 염 산 염, 추가 다음 NaOH와 HCl 7.0에 pH를 조정 합니다. 마지막으로, 1 리터의 최종 볼륨을 dH2O를 추가 합니다.
    2. 최대 3 개월까지 잘하고 압력솥 실 온에서 20-25 분 저장소에 대 한 믹스.
    3. 사용 전에 전자 레인지에 준비 TB1 최고 한 천 녹, 잘, 혼합 하 고 물 욕조에 55 ° C에 냉각 허용.
      참고: 용융 냉각된 TB1 가기 각 titer 또는 심사 관의 내용에 추가 되 고 혼합 후, 적절 한 titer 또는 심사 TB1 한 접시에 부 어 있다.
  9. 접시 뚜껑 열려 응축을 방지 하기 위해 실 온에서 15-30 분 동안 서 보자.
  10. 번호판을 반전 및 10 심사 플레이트 고정 24 ° C 인큐베이터에 배치 및 46-48 h (즉, 선택적 조건) 및 6 titer 플레이트 고정 37 ° C 배양 기에서 품 어와 24 h에 대 한 품 어 / (즉, 하룻밤 선택적 비 조건)입니다.
    참고: 품질 보증 및 결과의 표준화, 상용 컨트롤 페이지 솔루션 알려진 돌연변이 주파수 wildtype 돌연변이 cII 의 혼합물을 포함 하는 패키지 DNA 샘플 함께 도금 및 모두에 포함 분석 결과56을실행합니다.

5. 검사 Titer 상영 판 cII 돌연변이 주파수를 결정 하

  1. 37 ° C에서 24 h/하룻밤 인큐베이션, 다음 수 패의 수 각각 3 Titer 20 접시 및 Titer 100 판 형성. 플 라크를 쉽게 식별 하려면 잡고 접시와 어두운 배경 흰색 빛 상자 옆 뚜껑 ( 그림 2참조) 제거.
  2. 확인 플 라크의 숫자의 평균 (평균) Titer 20 접시와 Titer 100 플레이트의 각 집합에서 계산 (triplicate, 각각).
  3. 접시 세트 당 50-200 플 라크의 범위에 가장 가까운 폭포 titer 격판덮개의 세트에서 평균을 선택 합니다.
  4. 다음과 같이 10 상영 판에서 상영 하는 플 라크의 총 수를 계산.
    상영 패 총 (titer 접시 ÷ µ L 희석의 수가 선택한 titer 접시 당 사용의 선택한 세트에서 플 라크의 평균 수) = 희석 요인 x x 판 [100 µ L/접시] 심사 당 포장된 DNA 샘플의 µ L의 수 접시 [10] 상영의 x 숫자.
    참고: 예를 들어 Titer 20 접시 세트에서 접시 당 패의 평균 수는 128와 Titer 100 격판덮개의 세트에 상응 하는 숫자는 478, 번호 128 사용 됩니다 상영 하는 플 라크의 총 수의 계산 다음과 같이:
    (128 ÷ 20) x 100 [희석 요소] x 100 [µ L/판] x 10 [플레이트] 640,000 =
    이것은 평균 수 기반 이면 Titer 20 또는 Titer 100 판에서 각각 5000 또는 1, 000, 플 라크의 평균 수를 곱한 것과 같습니다.
  5. 46-48 h 24 ° C에 외피, 다음 10 심사 접시 (섹션 5.1에서 제공 하는 지침에 따라)에 형성 된 플 라크의 총 수를 계산 합니다.
    참고: cII 돌연변이 주파수 상영 하는 플 라크의 총 수로 심사 격판덮개에 형성 된 플 라크의 총 수를 나누어 계산 됩니다. 112는 플 라크의 총 수 10 심사 접시에 계산 하는 경우에 위의 예제를 사용 하 여,이 DNA 샘플 cII 돌연변이 주파수 112 ÷ 640,000 = 17.5 x 10-5.

6. Putative λ cII 돌연변이의 확인, PCR 확대, 및 DNA 시퀀싱

  1. 코어에 살 균, 넓은 구멍 피펫으로 팁과 질문에 플 라크와 살 균 SM 버퍼의 500 µ L을 포함 살 균 microcentrifuge 관으로 (아래로 pipetting)에 의해 추방.
  2. 실 온에서 2 h 이상 incubate 또는 4 ° c 하룻밤, 살 균 소 입자는 agar에서 elute를 허용 하도록 연결 합니다.
  3. 살 균 14 x 100 m m2 라운드-하단 튜브에서 코드 페이지 솔루션의 1 µ L 200 µ L G1250 도금 문화의 혼합 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어
  4. 55 ° C 용융 TB1 최고 agar의 2.5 mL를 사용 하 여 샘플 접시 하 고 섹션 4.8-4.10에 설명 된 대로 46-48 h (선택 조건), 24 ° C에서 접시를 품 어.
  5. 일단 보조 플 라크 형성, 피 펫 팁을 사용 하 여 단일 잘 격리 된 검증된 λ cII를 신중 하 게 선택-돌연변이 패 (낮은 agar를 만지지 마십시오).
    참고: 두 가지 목적을 제공 Replating putative cII 돌연변이 패: (i) 유물을 도금 수 있습니다 가끔 오인 될 소형 패; 그리고 (ii) 검열 판에서 가져온 agarose 코어 비 돌연변이 phage(s) 돌연변이 살 균 소에 함께 포함 될 수 있습니다. 저밀도 replating에서 2 차 패 PCR 및 후속 DNA 순서 분석에 대 한 오염된 돌연변이 서식 파일을 제공 합니다.
  6. 아래로 pipetting으로 25 µ L 이중 증 류 물을 포함 하는 microcentrifuge 튜브에 플 라크를 전송.
  7. 끓는 5 분 동안 물에 튜브를 놓습니다.
  8. 최대 속도 (18000 x g)에 실시간에 3 분간 원심
  9. 시 약의 최종 농도 1 x Taq PCR 버퍼, 10 pmol 각 정방향 및 역방향 뇌관의 각 dNTP의 12.5 nmol PCR mastermix의 40 µ L을 포함 하는 새로운 microcentrifuge 관에는 상쾌한의 10 µ L를 즉시 전송 및 2.5 U Taq DNA 중 합 효소의.
    참고: 정방향 및 역방향 뇌관은 다음과 같습니다: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' ( cII 기준-50-68 시작 codon 위치) 및 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (위치 cII 시작 codon 기준으로 365 +345), 각각.
  10. 다음 자전거 매개 변수를 사용 하 여 템플릿을 증폭: 95 ° C에서 3 분 변성 30 30 사이클 뒤에 s 95 ° C, 60 ° C에서 1 분에 72 ° c.에서 10 분의 최종 확장명이 72 ° C에서 1 분
  11. 제조업체의 지침에 따라 cII 유전자를 포함 하 고 상업적으로 이용 가능한 PCR 정화 키트를 사용 하 여 영역을 노릴 432 bp PCR 제품을 정화.
  12. 적절 한 시퀀싱 플랫폼을 사용 하 여 DNA 시퀀싱을 수행 하 고 cII transgene의 돌연변이 검색 결과 DNA 시퀀스 분석 (아래 참고 참조).
    참고:이 최고의 T 커피 시퀀스 정렬 웹 기반 서버 소프트웨어를 사용 하 여 참조 cII 시퀀스와 정렬에 의해 달성 된다. 프로그램을 사용 하는 방법에 대 한, 방문: http://tcoffee.crg.cat/

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Representative Results

데이터 배포에 따라 패라메트릭 또는 비-파라 메 트릭 테스트 치료 및 제어 그룹 (즉, 자연 스러운 돌연변이 주파수 대 유도) cII 돌연변이 주파수 차이의 중요성을 결정 하기 위해 사용 됩니다. . 다른 치료 그룹 유도 cII 돌연변이 주파수의 비교에 의해 이루어집니다 다양 한 (인덱스도) 적용으로 통계적 테스트. 주파수를 비교 하는 χ2 테스트 또는 분산 분석 (ANOVA), 같은 다른 테스트를 사용할 수 있습니다 있지만 아담스 및 Skopek의 초기 하 시험 전체 유도-그리고 자연 스러운 돌연변이 스펙트럼57, 비교 하 일반적으로 사용 (예를 들어, 전환, transversion, 삽입 또는 삭제) 돌연변이 유도 및 제어 돌연변이 스펙트럼 사이 또는 다른 화학 물질/대리인 또는 동일의 다양 한 복용량에 의해 유도 된 다양 한 돌연변이 스펙트럼 가운데 각 특정 유형의 화학/에이전트입니다.

그림 3 은 출판된 연구는 우리는 시연 마우스 미 발달 섬유 아 세포에 상대 cII 돌연변이 주파수에 증가의 범위 다양 한 화학 제품으로 대우에서 돌연변이 주파수 데이터의 편집 및 physicalagents 수 있습니다 변화할 몇-몇 가지 hundred-fold, 돌연변이 '힘'의 테스트 화합물. CII 돌연변이 주파수에서 통계적으로 중요 한 배 증가 마우스 미 발달 섬유 아 세포와 아크릴12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, 치료에 대 한 표시 됩니다. Δ-aminolevulinic 산 (δ-ALA) 플러스 낮은 복용량 자외선 빛 A (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo (a) pyrene diol epoxide(B(a)PDE)19및 UVA, UVB의 equilethal 복용량 (λ = 2 80−320 nm), 햇빛 UV (SSL) 21 (참조 시뮬레이션 그림 3).

그림 4 는 우리가 특정 유형의 돌연변이의 유도에 나타났습니다 mouseembryonicfibroblasts UVBrelativetocontrol23반구에서 cII transgene 돌연변이의 ' 순서 특이성 '의 데모 이다. UVB 유발 돌연변이 스펙트럼 pyrimidine 디에서 단일-또는 탠덤 C→T 전환의 상대 주파수에서 상당한 증가 의해 특징입니다.

Figure 1
그림 1: λ 선택 cII 분석 결과의 도식 프리젠테이션. 분석 결과에서 치료 하는 유전자 변형 설치류에 생체 외에서 시험 화합물과 파생 된 배양된 세포의 게놈 DNA에서 mutational 리포터 유전자로 cII transgene를 포함 하는 λLIZ 셔틀 벡터의 검색에 따라 또는 해당 동물의 조직/기관에 처리 vivo에서 시험 화학/에이전트 (A 및 B). 구조 벡터 대장균 (C , D)는 적절 한 호스트를 감염 시킬 수 있는 λ 살 균 소 머리에 포장 됩니다. 감염 된 박테리아 점수 및 cII transgene1,2,,325, 돌연변이의 분석에 대 한 수 있도록 선택적 조건 하에서 재배 되 고 다음 52 (E). DNA 시퀀싱에 의해 돌연변이 스펙트럼의 설립 및 유도 cII 돌연변이 주파수 F 와 G에 설명 되어 있습니다. 유도-그리고 자연 스러운 돌연변이 스펙트럼 다른 형식으로 시각화 됩니다. 반면 자연 스러운 돌연변이 (제어)은 아래 참조 시퀀스 (H) 입력 용도로, 우리 유도 cII 변이 참조 순서 위에 입력 포맷을 강조 했습니다. 돌연변이 자료의 높이 (즉, 높은 기지, 더 자주 돌연변이) 돌연변이의 주파수를 나타냅니다. 돌연변이 자료 위에 숫자는 그 기반에는 돌연변이의 비율 주파수를 나타냅니다. 삭제 된 기지 밑줄이 그어집니다. 삽입 된 기지는 화살표와 함께 표시 됩니다. 숫자 아래 기초는 뉴클레오티드 위치 참조. 데이터 게시 연구23에서 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 계산 titer 접시에 plaques. 플 라크를 쉽게 식별 하려면 번호판 뚜껑 제거 및 어두운 배경 흰색 빛 상자 옆 개최 됩니다. Titer 20 판 (A)과 Titer 100 판 (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 마우스 미 발달 섬유 아 세포에서 cII transgene의 돌연변이 주파수 다양 한 화학 물질 또는 물리적 에이전트 컨트롤에 비해 치료. 데이터는 아크릴12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, δ-aminolevulinic 산 (δ-ALA) 플러스 낮은 복용량 자외선 빛 A에 출판된 연구에서 (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo(a) pyrenediol 에폭시 (B(a)PDE)19및 UVA, UVB의 equilethal 복용량 (λ = 280−320 nm), 시뮬레이션 햇빛 UV (SSL)21. 효율적으로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 세포에 tamoxifen 대사, 하 우리 Aroclor 1,254 유발 쥐 간 준비 및 공동 인자 시 약22의 구성 된 S9-활성화 시스템 (S9 mix)를 사용. 모든 차이 사이의 취급-컨트롤 샘플은 p 에서 통계적 및 < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 돌연변이 스펙트럼 마우스 미 발달 섬유 아 세포 컨트롤에 상대적인 UVB와 반구에서 cII transgene의. 데이터 게시 연구23에서 있습니다. 모든 전환 (예를 들어, G→A 및 C→T) 및 transversions (예를 들어, G→T 및 C→A 또는 G→C 및 C→G)의 가닥 미러 대응 결합 됩니다. 기능: 삽입; 델: 삭제. UVB 유발 돌연변이 스펙트럼 pyrimidine 디에서 단일-또는 탠덤 C→T 전환의 상대 주파수에서 상당한 증가 의해 특징입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

Λ 선택 cII 분석 결과 BB 설치류3의 장기/조직에서 파생 된 세포의 게놈 DNA에서 복구 cII transgene에 변이의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이러한 유전자 변형 동물의 게놈 cII 운반 하는 chromosomally 통합된 λLIZ 셔틀 벡터의 여러 탠덤 복사본이 포함 (294 bp)와 lacI (1080 bp) transgenes mutational 리포터 유전자1, 2 , 25. λ 선택 cII 분석 결과 세포/조직 구조 벡터의 포장 뒤에 적절 한 호스트를 감염 시킬 수 있는 λ 살 균 소 머리에 유전자 변형 동물의 게놈 DNA에서 λLIZ 셔틀 벡터의 검색에 따라 E. 콜라 이입니다. 감염 된 박테리아 점수 및 cII transgene에 돌연변이의 분석에 대 한 수 있도록 선택적 조건 하에서 재배 되 고 그 후, ( 그림 1참조)1,3. Λ 선택 cII 분석 결과 변이 다양 한 화학 물질 및 물리적 에이전트 (참조2,49에서 검토)의 테스트에 대 한 광범위 하 게 사용 되었습니다. 분석 결과 유전자 변형 마우스/쥐 셀 문화 치료 체 외에 다양 한 화학 물질 또는 물리적 에이전트에 성공적으로 적용 된 및 해당 동물의 조직/장기 치료 vivo에서 다른 테스트 화학 물질/에이전트4,5,6,7,8,9,10,,1112 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 λ 선택 cII 분석 결과 많은 방법으로, 시험 화합물 나타내는 테스트 화학/에이전트와 함께 처리 하는 해당 동물의 변이 실험 vivo에서 대안 치료 3. 일반적으로 체 외에 모델 비해 상당한 이점을 제공 그들의 대응 vivo에서 동물 모델, 그들은 훨씬 더 적은 노동 집중 하 고 비용이 많이 드는, 완료 될, 훨씬 적은 시간이 필요 하지 않습니다 가장 중요 한 것은, 동물2,,5052의 직접적인 사용을 포함 한다. 동시에 체 외에서 모델 수 있습니다 하지 완전히 정리 체 외에서 배양된 세포와 실험 동물 사이 화학 물질의 pharmacokinetic 및 pharmacodynamic 속성의 차이로 인해 mutagenesis의 모든 측면 vivo에서 2 , 3. 예를 들어 화학 물질 노출의 그 경로입니다 (예를 들어, 담배 연기 또는 전자 담배 수증기) 흡입 할 수 있다만 생체 외에서 세포 배양에서 테스트 후 그들은 기체에서 변환 또는 증기 의무가 액체 또는 그들의 약 동학을 복잡 하 게 응축 양식. 또한, 불완전 또는 배양된 세포의 대사 능력에 결 석 체 외에서 DNA 반응 종 특정 화학 물질 변환 하 수 있습니다 대표 하지 DNA 손상 차적인 화학 물질2에 vivo에서 동물 노출에 변이 구동 ,3. 하지만이 단점은 다양 한 범위를,에 대 한 보상 수 있습니다 외부 신진 대사 활성화를 추가 하 여 시스템 (즉, S9 믹스) 생체 외에서 문화 모델22셀.

또한, 실제 인간의 노출 차적인 화학 물질/에이전트의 복제 체 외에서 세포 문화 모델 보다 vivo에서실험 동물3더 제한 됩니다. 일반적으로, 인간 차적인 에이전트의 만성 복용량에 몇 년간76,,7778몇 년의 기간 동안 노출 됩니다. 문화, 설치류 (즉, 일/주 대 몇 년)의 비교적 긴 수명에 비해 셀의 한정 된 수명이 더 도전 전 모델2, genotoxins에 인간 노출의 모델링은 3. 그럼에도 불구 하 고, 변이 분석 모델과 체 외에서 세포 문화 주어진된 화학의 차적인 잠재력의 초기 표시를 제공할 수 있습니다 / 에이전트, 그리고 결과 '세련 된' vivo에서 실험 설계를 가이드로 사용 될 수 있습니다 '감소' 다양 한 동물2,3기능.

결론적으로, 유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 λ 선택 cII 분석 결과 치료 화합물, 테스트 또는 테스트 화학/에이전트 처리 해당 동물 변이 테스트에 대 한 귀중 한 접근. 다른 연구 단체는 세계4,5,6,7,8,,910를 통해 서 우리가 성공적으로 접근, 사용 11,12,13,14,15,,1617,18,19, 20,21,22,23,24,34,,5859,60, 61,,6263,64,65,66,67,68,69, 70,,7172,,7374,75. 최근에, 우리는 차세대 시퀀싱 함께 λ 선택 cII 분석 결과의 수정에 시간, 비용-돌연변이의 높은 처리량 분석을 통해 새로운 기술을 개발 하 여이 방법의 응용 프로그램을 확장 했다 그리고 노동-효과적인 방식으로23.

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Disclosures

모든 저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 모든 동료의 기여 금 및 그 결과에 추천 된이 원고 (예시)에 대 한 우리의 원래 연구에 공동 작업자를 인정 하 고 싶습니다. 작가 작품은 AB (California Tobacco-Related 질병 연구 프로그램의 대학 및 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구는 건강의 국가 학회 (1R01DE026043) ab의 교부 금에 의해 지원 TRDRP-26IR-0015)와 세인트 (TRDRP-25IP-0001). 연구의 스폰서 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 데이터 해석, 보고서의 작성 또는 게시를 위해 제출 하는 결정에 있는 역할을 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

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Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).

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