Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Лямбда выбрать cII мутации системы обнаружения

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Мы описываем подробный протокол для assay лямбда выбрать мутации cII в культивируемых клеток трансгенных грызунов или соответствующих животных, лечение с агентом химические/физические интерес. Такой подход широко использовался для тестирования мутагенность канцерогенов в mammalian клетках.

Abstract

Ряд трансгенных животных моделей и систем обнаружения мутации были разработаны для мутагенность тестирования канцерогенов в mammalian клетках. Из них трансгенных мышей и лямбда (λ) выберите cII мутации системы обнаружения были заняты на мутагенность экспериментов на многих исследовательских групп во всем мире. Здесь мы описываем подробный протокол для лямбда выбрать assay cII мутации, которые могут быть применены для культивируемых клеток трансгенных мышей/крыс или соответствующих животных обрабатывают с агентом химические/физические интерес. Протокол состоит из следующих этапов: (1) изоляции геномной ДНК из клеток или органов/тканей трансгенных животных рассматривается в vitro или в естественных условиях, соответственно, с тест соединения; (2) восстановление вектора Трансфер лямбда, перевозящих мутационного Репортер ген (то есть, cII трансген) от геномной ДНК; (3) упаковки спасли векторов в инфекционных бактериофагов; (4) заражающий принимающей бактерии и культивирования условиях выборочный разрешить распространение мутаций индуцированных ИСИ ; и (5) забил cII-мутанты и ДНК последовательности анализа для определения частоты мутантных cII и спектра мутаций, соответственно.

Introduction

Широкий спектр трансгенных животных моделей и систем обнаружения мутации были разработаны для мутагенность тестирования канцерогенов в mammalian клетках. Из них трансгенных Big Blue (далее именуемое BB) мышах и λ выберите cII мутации системы обнаружения использовались для экспериментов мутагенность этой группой и многих других исследовательских групп во всем мире1,2, 3,4,5,6,,78,9. За последние 16 лет, мы исследовали мутагенные эффекты различных химических или физических агентов, используя эти трансгенных животных или их соответствующих культур клеток эмбриональных фибробластов, относились с тест соединения и впоследствии проанализированы фенотип и генотип cII трансген λ выберите cII пробирного и секвенирования ДНК, соответственно10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. геном этих трансгенных животных содержит бактериофага вектор Трансфер λ (λLIZ) интегрированы на хромосоме 4 как мульти копирования голова хвост concatemer1,2,25. ΛLIZ Трансфер вектор осуществляет два мутационного репортер генов, а именно ЗСБН и cII трансгенов1,2,25,26,27, 28,29,30,,3132,33,34,,3536, 37,,3839,40,41,42,,4344,45 , 46 , 47. пробирного выберите cII λ основывается на восстановление λLIZ Трансфер векторов геномной ДНК клеток, полученных от органов/тканей трансгенных животных1,2,25 . Восстановленный λLIZ Трансфер векторов затем упаковываются в λ Фаговые руководители способны заражать узла индикатор Escherichia coli. Впоследствии зараженных бактерий выращивают под селективного условий для оценки и анализа мутаций в ИСИ трансген1,3.

Здесь мы описываем подробный протокол для assay выберите cII λ, который состоит из изоляции genomic дна от клеток/органов трансгенных животных рассматривается в vitro/в vivo с тест соединения, Поиск λLIZ Трансфер векторов от genomic дна упаковка векторов в инфекционных λ бактериофаги, инфекции принимающей E. coli с бактериофагов, выявление cII-мутанты селективного условиях для определения частоты мутантных cII , и Анализ последовательности ДНК установить спектра мутаций cII . Протокол могут быть применены к трансгенные мыши/крыса клеток культур рассматривается в пробирке с агентом химические/физические интерес, или тканей/органы соответствующих животных обрабатывают в vivo с испытаний химических/агент1, 2,4,48,49,50,,5152. Схематическое представление выберите cII пробирного λ показан на рисунке 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. геномной ДНК изоляции от мыши эмбриональных фибробластов

Примечание: Основная мышь эмбриональных фибробластов изолированы от эмбрионов, полученных от BB трансгенных мышей C57BL/6 генетическим фоном, согласно опубликованной протокол53. Исходным материалом для этого протокола состоит из 1 x 10-6 до 1 x 107 эмбриональных фибробластов клетки относиться с тест соединения по сравнению с элементом управления. Сбора и подсчета этих клеток, используя стандартные методы описаны в ссылки на10,54,55.

  1. Подготовка буфера (0,3 М сахарозы, 60 мм KCl, 15 мм NaCl, 60 мм трис-HCl, рН 8,0, 0,5 мм спермидина, Спермин 0,15 мм и 2 мм ЭДТА), буфер B (150 мм ЭДТА NaCl и 5 мм, pH 7,8) и буфера C (20 мм трис-HCl, рН 8,0 20 мм NaCl, ЭДТА 20 мм и 1% SDS) заранее и сохранить при комнатной температуре (RT) на срок до одного года54,55.
  2. Ресуспензируйте клетки в 2-4 мл буфера, который В 15 мл конические пластиковых пробирок, неоднократно закупорить вверх и вниз с помощью широкого родила 1000 мкл наконечник пипетки.
  3. Добавьте один из тома (2-4 мл) буфера A содержащие 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (например, Nonidet P40) с использованием стеклянные Серологические Пипетки.
  4. Инкубируйте трубку на льду на 5 мин.
  5. Центрифуга для трубки на 1000 x g 5 мин на RT.
  6. Отменить супернатант и помыть лепешка с 10 – 15 мл буфера, используя стеклянные Серологические Пипетки.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 2-4 мл буфера б.
  8. Добавление одного тома (2-4 мл) буфера C содержащие 600 мкг/мл протеиназы K.
  9. Инкубировать трубки для 3 ч при 37 ° C.
  10. Добавьте РНКазы A в конечной концентрации 100 мкг/мл.
  11. Инкубировать трубки для дополнительного 1 ч при 37 ° C.
  12. Добавьте один фенолом тома (2-4 мл) (насыщенных в 0,1 М трис-HCl, рН 8,0):chloroform:isoamyl алкоголя (25:24:1 vol/vol).
    Примечание: Фенол может представлять опасность для тяжелой здоровья и должна осуществляться с крайней осторожностью. Фенол сильнокоррозионные на кожу и легко всасывается через него и экспонаты другие эффекты. При обработке фенолом, всегда используйте надевание двух пар перчаток, носить защитные очки и работать в химической зонта.
  13. Смесь хорошо, инвертирование трубки для 5 минут на трубку ротатор при 4 ° C.
  14. Центрифуга для трубки на 1000 x g 5 мин при 4 ° C.
  15. Удалите водяной участок (верхний слой) к новой трубки с помощью стеклянные Серологические Пипетки.
  16. Повторяйте фенола: хлороформ: изоамилового спирта извлечения 1-3 раза водной фазе ясно и интерфейс больше не мутная.
  17. Добавьте 1/10 объема (200 – 400 мкл) 3M ацетат натрия, рН 5.2.
  18. Добавьте 2.5 тома (5 – 10 мл) 100% этанола (охлажденные) и инвертировать трубка мягко вручную для 2-3 мин.
  19. Катушка ДНК с крюком стекла и перенести его на новый трубка, содержащая 1 – 5 мл 70% этанола и вымыть его. Кроме того, центрифуга трубки на высокой скорости (3500 x g) при 4 ° C для пеллет ДНК и промыть тщательно 1 – 5 мл 70% этанола.
  20. Центрифуга трубки на высокой скорости (3500 x g) на RT, удалить супернатант и просушите ДНК для 10-15 мин.
  21. Распустить ДНК в 10 – 100 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl, 1 ЭДТА, pH 7.5) и хранить при 4 ° C (для коротких хранения до одного месяца) или при-20 ° C (для длительного хранения). Оптимальная концентрация ДНК для assay выберите cII λ — 0,5 – 1,0 мкг/мкл (в буфере TE)56.

2. в пробирке реакция упаковки

  1. В одной упаковке реакции, добавить ~ 5 мкг геномной ДНК (конечный объем: 8 – 12 мкл, геномной ДНК был изолирован в разделе 1 от мыши эмбриональных фибробластов лечение в пробирке с испытанием составных или управления) к microcentrifuge трубка, содержащая первый смесь реакции (~ 10 мкл).
    Примечание: В доме подготовлен или коммерчески доступных λ упаковки экстракты используются в различных лабораториях. В коммерческой упаковке комплекта экстракт используется здесь56 (см. Таблицу материалы), красные трубы содержится первый микс реакции (~ 10 мкл) а синий трубы второй реакции микс (~ 70 мкл для по крайней мере 5 реакций).
  2. Инкубировать трубки для 90 мин при 30 ° C.
  3. Добавьте требуемый объем (~ 12 мкл) вторая реакция смеси к трубе.
  4. Инкубировать трубки для дополнительных 90 мин при 30 ° C.
  5. Добавление 1.1 мл SM буфера к трубе.
    Примечание: 1 мл этого раствора (т.е., упаковка реакционную смесь) будут использоваться для отбора λ cII-мутантов. Остаток будет использоваться для titering.
    1. Подготовка SM буфера путем смешивания 5,8 г NaCl, 2.0 г MgSO4.7H2O, 50 мл 1 М трис-HCl (рН 7,5) и 5 мл 2% (w/v) желатина. Добавьте dH2O окончательный объемом 1 литр, автоклав для 30 мин хранить при комнатной температуре на срок до 1 года.
  6. Вихревой тубы упакованы образца ДНК для 10 s на RT (активные vortexing).
  7. Пульс спина пробки microcentrifuge и магазин на льду до готовой к использованию. Если образец не будет использоваться в тот же день упаковка, 50 мкл метилхлороформа на мл упакованных ДНК образца, вихревой мягко и хранить при 4 ° C на срок до 2 недель.

3. Подготовка бактериальной культуры е. coli G1250

  1. По крайней мере за два дня до обшивки, сделайте несколько бактериальных полосу плиты из G1250 Escherichia coli (E. coli) на плитах агара TB1-канамицин.
    1. Плиты агара TB1-канамицин готовят следующим образом. Mix 5,0 г NaCl, Пептон казеина 10,0 г, а 12.0 g агар. Добавьте 800 мл dH2O. Добавить 1 мл 0,1% тиамина гидрохлорида. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с NaOH или HCl. Добавить dH2O окончательный объемом 1 литр.
    2. Смесь хорошо и автоклав для 30 мин разрешить охладить до 55 ° C. Добавить 50,0 мг канамицин и перемешать. Налейте в стерильные чашки Петри 100-мм (20-25 мл на блюдо). Хранить пластины на 4 ° C на срок до двух недель.
  2. Инкубируйте бактериальной полосу плиты в инкубаторе стационарных 30 ° C в течение 24 часов.
  3. Один день перед обшивкой, объединить 10 мл жидкой среды TB1 с 100 мкл 20% (w/v) мальтоза-1 M MgSO4 раствора в стерильных 50 мл-колпачок Конические трубки.
    1. Готовят TB1 жидкой среды следующим образом. Mix 5,0 г NaCl и Пептон казеина 10,0 г, затем добавить 800 мл dH2O, 1 мл 0,1% тиамина гидрохлорид и Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с NaOH или HCl. Затем добавить dH2O окончательный объемом 1 литр, смесь хорошо и автоклав для 30 мин хранить средство в РТ на срок до трех месяцев.
    2. 20% (w/v) мальтоза-1 M MgSO4 готовят следующим образом. Mix 20,0 g мальтозу и 24,6 g MgSO4. 7H2O, затем добавить dH2O конечный объем 100 мл. Фильтр стерилизовать и хранить при 4 ° C на срок до 6 месяцев.
  4. Прививать жидкой среды с несколькими колоний от бактериальных полоска пластины с помощью стерильных пересевать цикла56.
  5. Инкубируйте культур в жидкой среде на ночь в 30 ° C, пожимая инкубатор с энергичной встряхивания (250 – 300 об/мин).
  6. В день обшивки центрифуга конические трубка, содержащая жидкость культуры G1250 на 1500 x g 10 мин на RT для пеллет бактериальные клетки.
  7. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл 10 мм MgSO4.
  8. Измерение оптической плотности 1:10 разбавления суспензии клеток на длине волны 600 нм с помощью UV-Vis спектрофотометра (например, 100 мкл суспензии клеток + 900 мкл 10 мм MgSO4)56.
  9. Разбавления суспензии клеток до окончательного ОД600 0,5 с 10 мм MgSO4. Подготовленные подвеска G1250 E. coli с ОД600 = 0,5 именуется как «культура обшивка G1250».
  10. Хранить G1250 покрытие культуры на льду и использовать в течение 1-2 ч.

4. гальваническое образцы упакованных ДНК

  1. В одной упаковке образца ДНК Подготовьте шестнадцать стерильные 14 x 100 мм2 раунд нижней трубы и шестнадцать плиты агара TB1. Десять из каждого набора будет использоваться для скрининга и шесть titering (три титр 20) и три для 100 титр.
    1. Плиты агара TB1 готовят следующим образом. Mix 5.0 г NaCl, Пептон казеина 10,0 г и 12.0 g агар, затем добавить 800 мл dH2O и 1 мл 0,1% тиамина гидрохлорида. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с NaOH или HCl и добавить dH2O окончательный объемом 1 л.
    2. Хорошо перемешайте и автоклав для 30 мин Позвольте смеси остыть до 55 ° C, а затем налить его в Петри стерильные 100 мм (20-25 мл на блюдо). Храните пластины на 4 ° C на срок до двух недель.
      Примечание: Плиты агара TB1 должен быть подготовлен по крайней мере 24 часа до использования.
  2. Аликвота 200 мкл G1250 покрытие культуры в каждую пробирку раунд снизу.
  3. Для titering, сделать разведение 1: 100 упакованных образца ДНК и смешайте хорошо vortexing (т.е., 10 мкл упакованы образца ДНК + 990 мкл буфера SM).
  4. 20 мкл разбавления 1: 100, для каждого из трех титр 20 труб.
  5. 100 мкл разбавления 1: 100, для каждого из трех титр 100 пробирок.
  6. Для скрининга, 100 мкл 'неразбавленном ' упакованных образец ДНК каждой из десяти скрининг трубок.
  7. Обработать все titering и скрининг трубок (2 x 3 + 10 = 16 трубы), следующим образом: Смешайте хорошо vortexing для приблизительно 10 s и затем инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин разрешить хосту E. coli адсорбировать бактериофаги.
  8. Добавить 2,5 мл микроволновой печи расплавленного TB1 Топ агар (охлаждением до 55 ° C) для каждого титра или экранирующая труба, mix немедленно vortexing (мягко), и вливаются в соответствующие титр или скрининг плиты агара TB1.
    1. TB1 Топ агар готовят следующим образом. Mix 5,0 г NaCl, Пептон казеина 10,0 г, 7,0 g агар, добавить 800 мл dH2O. Добавить 1 мл 0,1% тиамина гидрохлорида, а затем Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с NaOH или HCl. Наконец добавьте dH2O окончательный объемом 1 литр.
    2. Смесь хорошо и автоклав для 20-25 мин хранить при комнатной температуре на срок до трех месяцев.
    3. Перед использованием расплава подготовленный TB1 Топ агар в микроволновой, хорошо перемешайте и дайте ему остыть до 55 ° C на водяной бане.
      Примечание: Расплавленный и охлаждением TB1 верхней добавляется к содержимому каждого титра антител или экранирующей трубы и после смешивания, заливается в соответствующие титр или плиты агара скрининг TB1.
  9. Пусть стоять за 15 – 30 мин при комнатной температуре, с крышкой, приоткрытой для предотвращения конденсации пластины.
  10. Инвертировать пластины и поместите пластины для десяти скрининга в инкубаторе стационарных 24 ° C и проинкубируйте 46 – 48 h (то есть, селективный условий) и шести пластин титр в инкубаторе стационарных 37 ° C и проинкубируйте 24 ч/ночь (т.е., неселективной условия).
    Примечание: Для обеспечения качества и стандартизации результатов, коммерчески доступных управления Фаговые растворы, содержащие смесь wildtype и мутантов cII с известными мутант частотой покрытием наряду с упакованных образцов ДНК и включены в все проба проходит56.

5. изучение титр и скрининг пластины для определения cII мутант частоты

  1. После 24 ч/ночь инкубации при 37 ° C подсчитать количество металлических пластинк сформирован в каждом из трех титр 20 пластин и титр 100 пластин. Легче идентифицировать бляшек, удерживайте пластины рядом с поле белый свет и на темном фоне с крышкой, удалить (см. Рисунок 2).
  2. Сделать в среднем (среднее) количество металлических пластинк учитывается в каждом наборе титр 20 пластин и титр 100 пластин (triplicate, каждый).
  3. Выберите среднее число из набора пластин титр, падает ближе к диапазон 50 – 200 бляшки за комплект пластины.
  4. Рассчитайте общее количество металлических пластинк, демонстрировались в десяти скрининг пластины следующим:
    Всего бляшек экранированный = (среднее количество бляшек в выбранный набор титр пластины ÷ количество мкл разрежения, используемых каждой выбранной титр пластины) x коэффициент разбавления x количество мкл упакованных образца ДНК на скрининг плита [100 мкл/плита] x количество скрининг плиты [10].
    Примечание: например, если среднее количество бляшек на пластину в наборе титр 20 пластин 128 и соответствующий номер в наборе титр 100 пластин 478, число 128 будет использоваться для вычисления общего числа бляшек, экранированный , следующим образом:
    (128 ÷ 20) x 100 [коэффициент разбавления] x 100 [мкл/плита] x 10 [пластины] = 640 000
    Это эквивалентно умножения среднее количество бляшек на 5000 человек, или 1000, если среднее число на основе графов из титр 20 пластин или титр 100 плит, соответственно.
  5. После 46 – 48 ч инкубации при температуре 24 ° C подсчитать общее количество металлических пластинк, образованная в десяти скрининг пластины (следуйте инструкциям, приведенным в разделе 5.1).
    Примечание: CII мутант частота рассчитывается путем деления общего количества бляшек, образованная в скрининга пластины на общее количество металлических пластинк экранированный. С помощью приведенного выше примера, если посчитать общее количество металлических пластинк в десяти скрининг пластины 112, cII мутант частоту для этого образца ДНК будет 112 ÷ 640 000 = 17,5 x 10-5.

6. Проверка распространение λ cII мутантов, амплификации PCR и секвенирования ДНК

  1. Основной вопрос с наконечником, стерильный, широкий родила накапайте налета и изгнать его (путем закупорить вверх и вниз) в стерильных microcentrifuge трубка, содержащая 500 мкл стерильных SM буфера.
  2. Проинкубируйте по крайней мере 2 ч при комнатной температуре, или на 4 ° C на ночь, чтобы позволить Фаговые частицы элюировать из агар вилку.
  3. В стерильные 14 x 100 мм2 раунд снизу трубку с 1 мкл раствора порошковой ФАГ смешать 200 мкл G1250 покрытие культуры и Инкубируйте 30 мин на RT.
  4. Пластины образца с помощью 2,5 мл 55 ° C расплавленного TB1 Топ агар и инкубировать пластину на 24 ° C для 46-48 h (селективный условия), как описано в разделах 4,8 – 4.10.
  5. После того, как сформировались вторичного металлических пластинк, использовать наконечник пипетки тщательно выбрать один хорошо изолированные проверенных λ cII-мутант налета (не прикасайтесь к нижней агар).
    Примечание: Replating мутант бляшек предполагаемого cII служит двум целям: (i) покрытие артефакты могут иногда быть ошибочно принято за металлическими пластинками малого размера; и (ii) ядро агарозы, взяты из плиты скрининг может содержать non мутант phage(s) вместе с мутант ФАГ. Вторичные таблички с низкой плотностью replating обеспечит незагрязненный мутант шаблон для ПЦР и последующего анализа последовательностей ДНК.
  6. Передать доска microcentrifuge трубка, содержащая 25 мкл двойной дистиллированной воды, закупорить вверх и вниз.
  7. Поместите трубку в кипящую воду на 5 мин.
  8. Центрифуга с максимальной скоростью (18 000 x g) за 3 минуты на RT.
  9. Незамедлительно передать 10 мкл супернатант новой microcentrifuge трубка, содержащая 40 мкл mastermix PCR, в котором окончательный концентрации реагентов, 1 x полимеразы PCR буфера, 10 пмоль каждого прямого и обратного праймеров, 12,5 нмоль каждого dNTP и 2,5 U полимеразы дна Taq.
    Примечание: Прямого и обратного грунтовки являются следующие: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (позиции,-68 к -50, по отношению к cII начать кодон) и 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (места + 345 к 365 относительно начала кодон cII ), соответственно.
  10. Усилить шаблон, используя следующие параметры Велоспорт: 3 мин Денатурация при 95 ° C, а затем 30 циклов 30 сек при 95 ° C, 1 мин при 60 ° C и 1 мин при 72 ° C, с расширением окончательного 10 мин при 72 ° C.
  11. Очищайте 432 продукт PCR bp содержащие ген ИСИ и фланговые регионов с использованием коммерчески доступных ПЦР очистки наборы, согласно инструкциям производителя.
  12. Выполнять секвенирования ДНК, используя платформу соответствующей последовательности и анализировать результирующие последовательности ДНК для обнаружения мутаций в ИСИ трансген (см. Примечание ниже).
    Примечание: Это лучше всего достигается выравнивание с последовательность cII ссылку, с помощью программного обеспечения, таких как сервер веб-выравнивание последовательности T-Coffee. Для получения инструкций о том, как использовать программу, посетите: http://tcoffee.crg.cat/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В зависимости от распределения данных параметрические и непараметрические тесты используются для определения значимости различий в частоте мутант cII между группами лечения и управления (т.е., индуцированной против спонтанной частоты мутантных) . Производится сравнение индуцированных cII мутант частот между группами различных лечения различными (попарно) статистических тестов, если это применимо. Гипергеометрическая испытание Адамс и Скопек обычно используется для сравнения спектров общий индуцированных - и спонтанной мутации57, хотя другие тесты, например χ2 тест или дисперсионный анализ (ANOVA), также могут использоваться для сравнения частоты каждого конкретного типа мутаций (например, переход, трехчастичных, вставки или удаления) между спектрами мутации индуцированных - и управления, или среди различных спектров мутации, под воздействием различных химических веществ/агентов или разных дозировках того же Химическая/агент.

Рисунок 3 представляет собой сборник мутант частота данных из опубликованных исследований, в которых мы показали, что степень повышения относительной cII мутант частоты в мыши эмбриональных фибробластов обращаются с различными химикатами или physicalagents может меняться от нескольких-несколько перспективнее, мутагенным «потенции» тест соединения. Для мыши эмбриональных фибробластов, получавших акриламида12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, тамоксифен18, приведены статистически фолд увеличение частоты мутантных cII Δ-аминолевулиновой кислоты (δ-Ала) плюс низкой дозы ультрафиолетового света A (UVA: λ > 320−400 Нм)15, бензо (а) пирена диол epoxide(B(a)PDE)19и equilethal дозы UVA UVB (λ = 2 80−320 нм) и методы имитации солнечного УФ (SSL) 21 (см. Рисунок 3).

Рисунок 4 является проявлением «последовательность специфика мутаций, в которых мы показали индукции конкретные виды мутаций в ИСИ трансген в облученном с UVBrelativetocontrol23mouseembryonicfibroblasts. Спектр UVB-индуцированной мутации характеризуется значительного увеличения относительной частоты одно - или тандем C→T переходов на dinucleotides пиримидина.

Figure 1
Рисунок 1: Схема презентация пробирного λ выберите cII . Проба основана на получение λLIZ Трансфер векторов, которые содержат cII трансген как мутационного Репортер ген, от геномной ДНК культивируемых клеток, полученных от трансгенных лечение грызунов в пробирке с тест соединения или ткани/органы соответствующих животных рассматривается в vivo с испытанных химических/агент (A и B). Спасли векторы упаковываются в главы ФАГ λ, которые могут заразить соответствующий хост E. coli (C и D). Зараженных бактерий выращивают затем выборочной условиях для оценки и анализа мутаций в ИСИ трансген1,2,3,-25, 52 (E). Определение частоты индуцированных cII мутант и установление спектра мутаций по секвенированию ДНК изложены в F и G. Индуцированная - и спонтанной мутации спектры визуализируются в различных форматах. Для целей иллюстрации мы выделили формат, в котором индуцированных cII мутации являются типизированными выше последовательности ссылок, тогда как спонтанные мутации (управления) набираются ниже ссылка последовательности (H). Высота мутировавших базы представляет свою частоту мутаций (то есть, тем выше база, более часто мутировавших). Номера выше мутировавших база указывают процент частоты мутаций в этой базе. Удаленные базы подчеркнуты. Вставленные базы отображаются со стрелкой. Цифры ниже основания ссылаться нуклеотидной позиции. Данные, опубликованные исследования23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: подсчет бляшек в титре пластин. Легче идентифицировать бляшек, плит проводятся рядом с поле белый свет и на темном фоне с крышками, удалены. Титр 20 (A) и крышку титр 100 (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Мутант частоты трансген cII в мыши эмбриональных фибробластов относились с различных химических веществ и/или физических агентов по сравнению с управления. Данные взяты из опубликованных исследований по акриламида12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, тамоксифен18, δ-аминолевулиновой кислоты (δ-Ала) плюс низкой дозы ультрафиолетового света A (UVA: λ > 320−400 Нм)15, benzo(a) pyrenediol эпоксид (B(a)PDE)19и equilethal дозы UVA UVB (λ = 280−320 нм) и методы имитации солнечного УФ (SSL)21. Чтобы эффективно усваивать тамоксифен в мышиных эмбриональных фибробластов клеток, мы использовали система S9-активации (S9 микс), состоящая из Арохлор 1254-Индуцированная печени крыс препараты и реагенты кофактор22. Все различия между лечение- и контрольные образцы являются статистически значимыми на p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Мутация спектры трансген cII в мыши эмбриональных фибробластов, облученном с UVB относительно управления. Данные, опубликованные исследования23. Комбинируются стренги зеркало коллегами всех переходов (например, G→A и C→T) и transversions (например, G→T и C→A или G→C и C→G). Модули: вставки; Del: исключить. Спектр UVB-индуцированной мутации характеризуется значительного увеличения относительной частоты одно - или тандем C→T переходов на dinucleotides пиримидина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Выберите cII пробирного λ используется для обнаружения мутаций в ИСИ трансген, оправился от геномной ДНК клеток, полученных от органов/тканей BB грызунов3. Геном этих трансгенных животных содержит несколько копий тандем хромосомно комплексной λLIZ Трансфер вектора, который несет cII (294 bp) и ЗСБН (1080 bp) трансгенов, как гены мутационного репортер1, 2 , 25. пробирного выберите cII λ основывается на получение λLIZ векторов Трансфер от геномной ДНК клеток/тканей трансгенных животных, следуют упаковки спасли векторов в головы ФАГ λ, которые могут заразить соответствующий хост E. coli. Впоследствии, зараженных бактерий выращивают под селективного условий для оценки и анализа мутаций в ИСИ трансген (см. рис. 1)1,3. Assay выберите cII λ широко используется для мутагенность тестирования широкого круга химических веществ и/или физических агентов (обзор в ссылки2,49). Assay был успешно применен к трансгенные мыши/крыса клеток культур рассматривается в пробирке с различных химических веществ и/или физических агентов, и ткани/органы соответствующих животных в естественных условиях лечили различные испытания химические вещества/агентов4,5,6,,78,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

Выберите cII пробирного λ в культивируемых клеток трансгенных грызунов относились с тест соединения представляет, во многих отношениях, жизнеспособной альтернативой в vivo мутагенность эксперименты в соответствующих животных, получавших испытанных химических/агент 3. как общее правило, в пробирке модели предлагают значительные преимущества над их двойники в естественных условиях Животные модели, как они гораздо меньше труда, интенсивный и дорогостоящим, требует гораздо меньше времени, чтобы завершить и самое главное, не связаны с прямым использованием животных2,50,52. В то же время в пробирке модели не могут полностью резюмировать все аспекты мутагенеза различиями в фармакокинетические и фармакодинамические свойства химических веществ между культивируемых клеток в пробирке и экспериментальных животных в естественных условиях 2 , 3. Например, химических веществ, в которого путь воздействия ингаляции (например, сигаретный дым или электронные сигареты пара) могут быть сделаны только поддаются в vitro тестирования в клеточных культурах, после того, как они преобразуются из газообразных или пара формы для жидкость или конденсат, что усложняет их Фармакокинетика. Кроме того, неполная или отсутствует метаболических количество культивируемых клеток в пробирке для преобразования определенных химических веществ в ДНК реактивных видов могут не представляют повреждения ДНК в животных в естественных условиях вынуждены мутагенность генотоксичность химических веществ2 ,3. Хотя, этот недостаток можно компенсировать, в различной степени, путем добавления внешней активации метаболических системы (то есть, S9 микс) в vitro клетки культуры модели22.

Кроме того репликация реальной жизни человека подверженности генотоксичность химических веществ/агентов более ограничен в vitro клетки культуры моделей, чем с подопытных животных в естественных условиях3. Как правило люди подвергаются действию к хронической дозы генотоксичным агентам на протяжении нескольких лет до нескольких десятилетий76,,77-78. Конечный срок жизни клеток в культуре, по сравнению с относительно длиннее время жизни грызунов (то есть, дней/недель по сравнению с несколько лет) делает моделирование воздействия человека генотоксинов более сложной в бывшей модели2, 3. Тем не менее, мутагенность анализ с в vitro клетки культуры модели может служить показателем первоначальный генотоксического потенциала данного химического вещества / агент(ы) и результаты могут быть использованы в качестве руководства для разработки «изысканный» в естественных условиях экспериментов который есть «сокращения» количество животных2,3.

В заключение λ выберите cII assay в культивируемых клеток трансгенных грызунов обрабатывают составные теста, или соответствующих животных, лечение с испытанных химических/агентом, является ценным подход к тестированию мутагенность. Мы успешно использовал этот подход, как у других исследовательских групп во всем мире4,5,6,,78,9,10, 11,12,13,14,,1516,,1718,19, 20,21,,2223,24,34,,5859,60, 61,62,63,64,65,,6667,,6869, 70,,7172,,7374,75. Совсем недавно мы расширили применение этого подхода путем разработки новой техники, в котором изменения выберите cII пробирного λ вместе с секвенирование нового поколения позволяет высокой пропускной способности анализа мутаций в времени-, стоимость-, и труда эффективным образом23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы признать вклад всех коллег и партнеров для наших оригинальных исследований, результаты которого были переданы в этой рукописи (для примера). Работа авторов поддерживается за счет субсидий из Национального Института стоматологии и челюстно-лицевой исследования национальных институтов здравоохранения (1R01DE026043) для AB и из университета California Tobacco-Related программы исследований болезни (AB TRDRP-26IR-0015) и ST (TRDRP-25IP-0001). Авторы данного исследования было никакой роли в дизайн исследования, сбор данных, анализ данных, интерпретация данных, написание доклада, или решение представить для публикации.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828 (2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116 (2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 134 бактериофага cII трансген эмбриональных фибробластов мыши EMF мутации Трансфер в/из вектора
Лямбда выбрать <em>cII</em> мутации системы обнаружения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Besaratinia, A., Tommasi, S. The… More

Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter