Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Den Lambda Välj cII Mutation Detection System

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Vi beskriver ett detaljerat protokoll för den Lambda Välj cII -mutationsanalys i odlade celler av transgena gnagare eller de motsvarande djur som behandlats med en kemisk/fysikaliska agent av intresse. Detta tillvägagångssätt har använts för mutagenicitet testning av cancerframkallande ämnen i däggdjursceller.

Abstract

Ett antal transgena djurmodeller och mutation detekteringssystem har utvecklats för mutagenicitet testning av cancerframkallande ämnen i däggdjursceller. Av dessa har transgena möss och Lambda (λ) Välj cII Mutation Detection System använts för mutagenicitet experiment av många forskargrupper världen över. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för den Lambda Välj cII mutationsanalys, som kan tillämpas på odlade celler från transgena möss/råttor eller motsvarande djur behandlats med en kemisk/fysikaliska agent av intresse. Protokollet består av följande steg: (1) isolering av genomisk DNA från celler eller organ/vävnader av transgena djur behandlas in vitro- eller in-vivo, respektive med en test förening; (2) återvinning vektorns lambda pendelbuss transporterar en mutationsanalys reporter gen (dvs, cII transgenens) genomisk DNA; (3) förpackningar räddade vektorer i smittsamma bakteriofager; (4) infekterar en värd bakterier och odlingsskålar selektiv villkor att tillåta spridning av de inducerade cII mutationerna; och (5) poängsättning av cII-mutanter och DNA sekvens analys för att fastställa cII Mutantfrekvensen och mutation spektrum, respektive.

Introduction

Ett brett utbud av transgena djurmodeller och mutation detekteringssystem har utvecklats för mutagenicitet testning av cancerframkallande ämnen i däggdjursceller. Av dessa har transgena Big Blue (kallas härefter BB) möss och λ väljer cII Mutation Detection System använts för mutagenicitet experiment av denna grupp och många andra forskning grupper över hela världen1,2, 3,4,5,6,7,8,9. För de senaste 16 åren, vi har undersökt de mutagena effekterna av olika kemiska eller fysikaliska agenser som använder dessa transgena djur eller deras motsvarande embryonala fibroblast cellkulturer behandlas med en test-förening, och därefter analyseras den fenotyp och genotyp av den cII transgenens av λ väljer cII assay och DNA-sekvensering, respektive10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. genomet hos dessa transgena djur innehåller en bacteriophage λ transfer vektor (λLIZ) integrerade på kromosom 4 som flera exemplar head-to-tail concatemer1,2,25. ΛLIZ transfer vektorn bär två mutationsanalys reporter gener, nämligen lacI och cII transgener1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ väljer cII analysen bygger på återvinning av λLIZ transfer vektorer från genomisk DNA celler som härrör från organ/vävnader av transgena djur1,2,25 . Återvunna λLIZ transfer vektorerna är sedan förpackade i λ phage huvuden kan infektera en indikator värd Escherichia coli. Därefter odlas de infekterade bakterierna selektiv villkor för att scoring och analys av mutationer i cII transgenens1,3.

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för λ väljer cII analysen, som består av isolering av genomisk DNA från celler/organ av transgena djur behandlas i vitro/i vivo med en test förening, hämtning av λLIZ shuttle vektorer genomiskt DNA, förpackningar av vektorer i smittsamma λ fagocyt, infektion i mottagande E. coli med bakteriofager, identifiering av den cII-mutanter selektiv villkor att fastställa cII mutant frekvens, och DNA sekvens-analys att upprätta cII mutation spektrumet. Protokollet kan tillämpas på transgena mus/råtta cell kulturer behandlas i vitro med en kemisk/fysikaliska agent av intresse, eller vävnader/organ motsvarande djur behandlas i vivo med test kemiska/agent1, 2,4,48,49,50,51,52. En schematisk presentation av λ väljer cII analysen visas i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. genomiskt DNA isolering från mus embryonala fibroblaster

Obs: Primära mus embryonala fibroblaster är isolerade från embryon som härrör från BB transgena möss med C57BL/6 genetiska bakgrund, enligt den publicerade protokollet53. Utgångsmaterialet för detta protokoll består av 1 x 106 till 1 x 107 embryonala fibroblast celler behandlas med en test sammansatta kontra kontroll. Skörd och räknar dessa celler med vanliga metoder beskrivs i referenser10,54,55.

  1. Förbereda buffert en (0,3 M sackaros, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM spermidine, 0,15 mM spermine och 2 mM EDTA), buffert B (150 mM NaCl och 5 mM EDTA, pH 7,8) och buffert C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM NaCl, 20 mM EDTA och 1% SDS) i förväg, och bevara i rumstemperatur (RT) i upp till ett år54,55.
  2. Att resuspendera cellerna i 2 – 4 mL buffert i en 15 mL koniskt centrifugrör genom att upprepade gånger upp och ner med ett brett med bore 1000 µL pipettspetsen.
  3. Lägga till en volym (2 – 4 mL) buffert A innehållande 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (t.ex., Nonidet P40) med glas serologiska pipett.
  4. Inkubera röret på is för 5 min.
  5. Centrifugera röret vid 1 000 x g i 5 min på RT.
  6. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 10 – 15 mL buffert en med glas serologiska pipett.
  7. Återsuspendera pelleten i 2 – 4 mL buffert B.
  8. Lägga till en volym (2 – 4 mL) buffert C innehållande 600 µg/mL proteinas K.
  9. Inkubera röret under 3 timmar vid 37 ° C.
  10. Lägg till RNase A till en slutlig koncentration på 100 µg/mL.
  11. Inkubera röret för en ytterligare 1 h vid 37 ° C.
  12. Lägga till en volym (2 – 4 mL) fenol (mättad i 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0):chloroform:isoamyl alkohol (25:24:1 vol/vol).
    Obs: Fenol kan utgöra en allvarlig hälsorisk och måste hanteras med yttersta försiktighet. Fenol är starkt frätande på huden och lätt absorberas genom den och uppvisar andra effekter. När hantering fenol, Använd alltid användning av dubbla handskar, bära skyddsglasögon och arbeta i dragskåp kemiska.
  13. Blanda väl genom att vända tuben för 5 min på en tube rotator vid 4 ° C.
  14. Centrifugera röret vid 1 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
  15. Ta bort den vattenhaltiga fasen (översta lagret) till en ny tub med glas serologiska pipett.
  16. Upprepa fenol: kloroform: isoamylacetat alkohol utvinning 1 till 3 gånger tills den vattenhaltiga fasen är klar och gränssnittet är inte längre grumligt.
  17. Lägg till 1/10 volym (200 – 400 µL) 3M natriumacetat, pH 5.2.
  18. Tillsätt 2,5 volym (5 – 10 mL) 100% etanol (kylda) och Invertera röret försiktigt för hand för 2 – 3 min.
  19. Buffra DNA med en glas-krok och överföra den till en ny tub som innehåller 1 – 5 mL 70% etanol och tvätta det noga. Alternativt kan du Centrifugera röret med hög hastighet (3 500 x g) vid 4 ° C till pellet DNA och tvätta den noga med 1 – 5 mL 70% etanol.
  20. Centrifugera röret med hög hastighet (3 500 x g) vid RT, avlägsna supernatanten och lufttorka DNA för 10-15 min.
  21. Lös upp DNA i 10 – 100 µL TE buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), och förvaras vid 4 ° C (för kort lagring av upp till en månad) eller vid-20 ° C (för längre lagringsperiod). Den optimala koncentrationen för DNA för λ väljer cII analysen är 0,5 – 1,0 µg/µL (i TE buffert)56.

2. in Vitro förpackning reaktion

  1. Per en förpackning reaktion, lägga till ~ 5 µg genomiskt DNA (slutlig volym: 8 – 12 µL, genomisk DNA var isolerad i avsnitt 1 från mus embryonala fibroblaster behandlas i vitro med ett test som är sammansatta eller kontroll) i en mikrocentrifug rör som innehåller först reaktionsblandning (~ 10 µL).
    Obs: Beredda internt eller kommersiellt tillgängliga λ förpackning extrakt används i olika laboratorier. I kommersiell förpackning extrakt kit används här56 (se Tabell för material), röda rör innehöll den första reaktion mix (~ 10 µL) och blå rör innehöll den andra reaktionsblandning (~ 70 µL för minst 5 reaktioner).
  2. Inkubera röret för 90 min vid 30 ° C.
  3. Lägga till volymen som krävs (~ 12 µL) av den andra reaktionsblandning till röret.
  4. Inkubera röret för en ytterligare 90 min vid 30 ° C.
  5. Tillsätt 1,1 mL SM buffert till röret.
    Obs: 1 mL av denna lösning (dvs, förpackning reaktionsblandningen) kommer att användas för screening λ cII-mutanter. Återstoden kommer att användas för patientserumprov.
    1. Förbered SM buffert genom att blanda 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) och 5 mL 2% (w/v) gelatin. Lägg till dH2O till en slutlig volym av 1 liter, autoklav för 30 min. Store i rumstemperatur i upp till 1 år.
  6. Vortex röret som innehåller det paketerade DNA-provet för 10 s vid RT (kraftig vortexa).
  7. Pulse snurra röret i en mikrocentrifug och lagra på is tills klar att använda. Om provet inte kommer att användas inom samma dag av förpackningar, tillsätt 50 μl kloroform per mL paketerade DNA prov, vortex försiktigt, och förvaras vid 4 ° C i upp till 2 veckor.

3. Förbered E. coli G1250 bakteriella kulturen

  1. Minst två dagar före plätering, göra några bakteriell strimma plåtar från Escherichia coli (E. coli) G1250 på TB1-kanamycin agarplattor.
    1. Förbereda TB1-kanamycin agarplattor som följer. Blanda 5,0 g NaCl, 10,0 g kaseinpepton och 12,0 g agar. Lägga till 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1% tiamin hydroklorid. Justera pH till 7,0 med NaOH eller HCl. Lägg dH2O till en slutlig volym av 1 liter.
    2. Blanda väl och autoklav för 30 min. Tillåt svalna till 55 ° C. Lägg till 50,0 mg Kanamycin och blanda. Häll i steril 100 mm petriskålar (20 – 25 mL per maträtt). Förvara tallrikar vid 4 ° C i upp till två veckor.
  2. Inkubera bakteriell strimma plattorna i en inkubator för stationära 30 ° C under minst 24 h.
  3. En dag före plätering, kombinera 10 mL TB1 flytande medium med 100 µL av 20% (w/v) maltos-1 M MgSO4 lösningen i en steril 50 mL skruvkork koniska tub.
    1. Förbereda TB1 flytande medium enligt följande. Blanda 5.0 g NaCl och 10,0 g kaseinpepton, sedan lägga till 800 mL dH2O, 1 mL 0,1% tiamin hydroklorid, och justera pH till 7,0 med NaOH eller HCl. Lägg sedan till dH2O till en slutlig volym av 1 liter, blanda väl och autoklav för 30 min. Förvara mediet vid RT i upp till tre månader.
    2. Förbereda 20% (w/v) maltos-1 M MgSO4 enligt följande. Blanda 20,0 g maltos och 24,6 g MgSO4. 7H2O, Lägg sedan till dH2O en slutlig volym av 100 mL. Filter sterilisera och förvara vid 4 ° C i upp till 6 månader.
  4. Inokulera det flytande mediet med flera kolonier från bakteriell strimma plattan med hjälp av en steril inoculating loop56.
  5. Inkubera flytande kulturen över natten i en 30 ° C skakar inkubator med kraftig skakning (250 – 300 rpm).
  6. På dagen för plätering, Centrifugera koniska röret som innehåller G1250 flytande kulturen på 1 500 x g under 10 minuter vid RT till pellet bakteriecellerna.
  7. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 mL 10 mM MgSO4.
  8. Mät absorbansen hos en 1:10 utspädning av cellsuspensionen på våglängd 600 nm med en UV-Vis spektrofotometer (t.ex., 100 µL cellsuspension + 900 µL 10 mM MgSO4)56.
  9. Späd cellsuspensionen till en slutlig OD600 0,5 med 10 mM MgSO4. Den beredda suspensionen av G1250 E. coli med OD600 = 0,5 benämns 'G1250 plätering kultur'.
  10. Lagra G1250 plätering kulturen på is och använda inom 1-2 h.

4. plätering de paketerade DNA-proverna

  1. Per en paketerad DNA-prov, förbereda sexton sterila 14 x 100 mm2 runda-botten rör och sexton TB1 agarplattor. Tio från varje uppsättning kommer att användas för screening och sex för patientserumprov (tre för Titer 20) och tre för Titer 100.
    1. Förbereda TB1 agarplattor som följer. Blanda 5.0 g NaCl, 10,0 g kaseinpepton och 12,0 g Agar, Lägg sedan till 800 mL dH2O och 1 mL 0,1% tiamin hydroklorid. Justera pH till 7,0 med NaOH eller HCl, och lägga till dH2O till en slutlig volym av 1 L.
    2. Blanda väl och autoklav för 30 min. Låt blandningen svalna till 55 ° C, sedan Häll det i steril 100 mm petriskålar (20 – 25 mL per maträtt). Förvara plattorna vid 4 ° C i upp till två veckor.
      Obs: TB1 agarplattor bör beredas minst 24 timmar före användning.
  2. Alikvotens 200 µL G1250 plätering kulturen i varje runda-botten röret.
  3. För patientserumprov, en 1: 100 utspädning av det paketerade DNA-provet och blanda väl genom vortexa (dvs, 10 µL förpackas DNA-prov + 990 µL SM buffert).
  4. Tillsätt 20 µL av 1: 100 utspädning till var och en av tre Titer 20 rören.
  5. Tillsätt 100 µL av 1: 100 utspädning till var och en av tre Titer 100 rören.
  6. För screening, tillsätt 100 µL av den 'outspädd ' packat DNA-prov till var och en av tio screening rören.
  7. Bearbeta alla patientserumprov och screening rör (2 x 3 + 10 = 16-rör) enligt följande: blanda väl genom vortexa för cirka 10 s, och sedan odla i rumstemperatur i 30 min att tillåta värden E. coli att adsorbera Fager.
  8. Tillsätt 2,5 mL mikrad smält TB1 toppen agar (kyls till 55 ° C) till varje titer eller screening tube, blanda omedelbart genom vortexa (försiktigt), och hälla i lämpliga titern eller screening TB1 agarplattor.
    1. Förbereda TB1 topp agar enligt följande. Blanda 5.0 g NaCl, 10,0 g kaseinpepton och 7,0 g Agar, sedan lägga till 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1% tiamin hydroklorid, sedan justera pH till 7,0 med NaOH eller HCl. Slutligen, lägga till dH2O till en slutlig volym av 1 liter.
    2. Blanda väl och autoklav för 20 – 25 min. Store vid rumstemperatur i upp till tre månader.
    3. Före användning, smälta beredda TB1 topp ägarn i mikrovågsugn, blanda väl och låt svalna till 55 ° C i ett vattenbad.
      Obs: Smält och kyls TB1 överst läggs till innehållet i varje titer eller screening tube och efter blandning hälls i den lämpliga titer eller screening TB1 agarplattor.
  9. Låt plattorna står för 15 – 30 min i rumstemperatur, med locket på glänt för att förhindra kondens.
  10. Invertera plattorna och placera tio screening plattorna i en stillastående 24 ° C inkubator och inkubera i 46 – 48 h (dvs, selektiv villkor) och sex titer plattorna i en stillastående 37 ° C inkubator och inkubera i 24 h/över natten (dvs. icke-selektiva villkor).
    Obs: För kvalitetssäkring och standardisering av resultat, kommersiellt tillgängliga kontroll phage lösningar som innehåller en blandning av vildtyp och muterade cII med kända Mutantfrekvensen pläterade tillsammans med de paketerade DNA-proverna och ingår i alla analysköringar56.

5. att undersöka Titer och Screening plattor för att avgöra den cII Mutant frekvens

  1. Efter den 24 h/över natten inkubationen vid 37 ° C bildades antalet plaketter varje tre Titer 20 plattor och antikroppnivåns 100 plattor. För att lättare identifiera plack, håll plattan bredvid en vit ruta och mot en mörk bakgrund med locket tas bort (se figur 2).
  2. Gör en medelvärdet av antalet plack räknas varje uppsättning Titer 20 plattor och antikroppnivåns 100 plattor (triplicate, vardera).
  3. Välj det genomsnittliga antalet från den uppsättning titer plattor som infaller närmast spänna av 50 – 200 plack per tallrik uppsättning.
  4. Beräkna det totala antalet plack screening i tio screening plattorna enligt följande:
    Summa plack skärmad = (genomsnittlig antal plack i den valda uppsättningen titer plattor ÷ antal µL av utspädning som används per valt titer platta) x utspädningsfaktorn x antal µL av paketerade DNA prov per screening plattan [100 µL/platta] x antal screening plattor [10].
    Obs: exempelvis om det genomsnittliga antalet plack per platta i uppsättningen Titer 20 plattor är 128 och motsvarande nummer i uppsättningen Titer 100 plattor är 478, nummer 128 används för beräkning av det totala antalet plack skärmad , enligt följande:
    (128 ÷ 20) x 100 [utspädningsfaktorn] x 100 [µL/platta] x 10 [tallrikar] = 640 000
    Detta är detsamma som multipliceras med det genomsnittliga antalet plack 5 000 eller 1 000, om det genomsnittliga antalet baseras på räknas från Titer 20 plattor eller Titer 100 tallrikar, respektive.
  5. Efter 46 – 48 h inkubation vid 24 ° C, räknas det totala antalet plack bildas i tio screening tallrikar (följ instruktionerna som anges i avsnitt 5.1).
    Obs: Den cII mutationsfrekvensen beräknas genom att dividera det totala antalet plack bildas i screening tallrikar av det totala antalet plack screenas. Med exemplet ovan, om det totala antalet plack räknat i tio screening plattorna är 112, cII mutant frekvensen för DNA provet skulle vara 112 ÷ 640 000 = 17,5 x 10-5.

6. kontroll av den Putative λ cII mutanter, PCR-amplifiering och DNA sekvensering

  1. Kärna ur plack i fråga med en steril, wide-bore Pipettera spets och utvisa det (genom pipettering upp och ner) till en steril mikrocentrifug rör innehållande 500 µL sterilt SM buffert.
  2. Inkubera i minst 2 h vid rumstemperatur, eller vid 4 ° C över natten, att tillåta phage partiklarna att eluera från ägarn kontakten.
  3. Blanda 200 µL G1250 plätering kulturen med 1 µL Metallpulverfylld phage lösningen i en steril 14 x 100 mm2 runda-botten röret, och inkubera i 30 min på RT.
  4. Tavla provet med 2,5 mL 55 ° C smält TB1 topp agar och inkubera plattan vid 24 ° C för 46 – 48 h (selektiv villkorar), som beskrivs i avsnitt 4.8 – 4.10.
  5. När de sekundära plack har bildat, använda en pipettspetsen att försiktigt plocka en enda väl isolerad verifierade λ cII-mutant plack (Undvik att vidröra den lägre agar).
    Obs: Replating förmodade cII mutant plack tjänar två syften: (i) plätering artefakter kan ibland misstas för små plack; och (ii) en agaros kärna tas från en screening tallrik kan innehålla icke-mutanta phage(s) tillsammans med en mutant phage. Sekundära plack från en låg densitet replating ger en oförorenad mutant mall för PCR och efterföljande DNA-sekvensanalys.
  6. Överföra plack i en mikrocentrifug rör innehållande 25 µL dubbeldestillerat vatten pipettering upp och ner.
  7. Placera röret i kokande vatten i 5 min.
  8. Centrifugera vid högsta hastighet (18.000 x g) under 3 minuter vid RT.
  9. Över 10 µL av supernatanten omedelbart till ett nytt mikrocentrifug rör innehållande 40 µL av en PCR mastermix där de slutliga koncentrationerna av reagenser är 1 x Taq PCR-buffert, 10 pmol varje av framåt och bakåt primers, 12,5 nmol av varje dNTP , och 2.5 U Taq-DNA-polymeras.
    Obs: Framåt och bakåt primers är som följer: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (positioner -68 till -50 i förhållande till den cII starta kodon) och 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (positioner +345 till +365 i förhållande till den cII start-kodon), respektive.
  10. Förstärka mallen med följande cykel parametrar: en 3 min denaturering vid 95 ° C, följt av 30 cykler av 30 s vid 95 ° C, 1 min vid 60 ° C, och 1 min vid 72 ° C, med en sista förlängning av 10 minuter vid 72 ° C.
  11. Rena 432 bp PCR-produkten innehållande cII -genen och flankerande regioner använder kommersiellt tillgängliga PCR rening kit, enligt tillverkarens instruktioner.
  12. Utföra DNA-sekvensering med hjälp av en lämplig sekvensering plattform och analysera de resulterande DNA-sekvenserna för att påvisa mutationer i den cII transgenens (se kommentaren nedan).
    Obs: Detta uppnås bäst genom justering med referens cII sekvens med programvara, såsom webbaserade T-Coffee sekvens justering servern. För instruktioner om hur du använder programmet, besök: http://tcoffee.crg.cat/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beroende på Datadistribution används parametriska eller icke-parametriska tester för att avgöra betydelsen av skillnaden i cII mutant frekvens mellan behandling och kontroll grupper (dvs.inducerad kontra spontana mutant frekvenser) . Jämförelse av de inducerade cII mutant frekvenserna mellan olika behandlingsgrupperna görs av olika (parvis) statistiska tester, som är tillämpligt. Det hypergeometriska testet av Adams och Skopek används ofta att jämföra den totala inducerad- och spontan mutation spectra57, även andra tester, såsom χ2 -test och variansanalys (ANOVA), kan också användas för att jämföra frekvensen av varje specifik typ av mutation (t.ex., övergång, transversion, infogning eller borttagning) mellan inducerad- och kontroll mutation spektra, eller bland olika mutation spectra induceras av olika kemikalier/agenter eller varierande doser av samma kemiska/agent.

Figur 3 är en sammanställning av mutationsfrekvensen data från publicerade studier där vi har visat att omfattningen av ökningen i relativa cII Mutantfrekvensen i mus embryonala fibroblaster behandlas med olika kemikalier och/eller physicalagents kan variera från några-till flera hundrafaldigt, mutagena 'styrka' av test föreningen. Statistiskt signifikant fold-ökningar i cII mutant frekvensen visas för mus embryonala fibroblaster behandlas med akrylamid12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, Δ-aminolevulinsyra (δ-ALA) plus låg dos ultraviolett ljus A (UVA: λ > 320−400 nm)15, bens (a) pyren diol epoxide(B(a)PDE)19och equilethal doser av UVA, UVB (λ = 2 80−320 nm), och simulerat solljus UV (SSL) 21 (se Figur 3).

Figur 4 är en demonstration av 'sekvens-specificitet' mutationer där vi har visat induktion av specifika typer av mutation i den cII transgenens i mouseembryonicfibroblasts bestrålas med UVBrelativetocontrol23. UVB-inducerad mutation spektrumet kännetecknas av betydande ökningar i relativ frekvens av enkel- eller tandem C→T övergångar på pyrimidin dinucleotides.

Figure 1
Figur 1: Schematisk presentation av λ väljer cII analysen. Analysen baseras på hämtning av λLIZ transfer vektorer, som innehåller den cII transgen som en mutationsanalys reporter gen, genomisk DNA från odlade celler från transgena gnagare vilka behandlats i vitro med en test-förening eller vävnader/organ motsvarande djur behandlas i vivo med testade kemisk/agent (A och B). Räddade vektorerna paketeras till λ phage huvuden som kan infektera en lämplig värd E. coli (C och D). De infekterade bakterierna odlas sedan selektiv villkor för att scoring och analys av mutationer i cII transgenens1,2,3,25, 52 (E). Bestämning av inducerad cII Mutantfrekvensen och inrättande av mutation spektrumet av DNA-sekvensering beskrivs i F och G. Inducerad- och spontan mutation spektra visualiseras i olika format. I illustrationssyfte, har vi betonat ett format där de inducerade cII mutationerna är skrev ovan referens sekvensen, medan de spontana mutationerna (kontroll) skrivs nedan sekvensen referens (H). Höjden av en muterad bas representerar dess frekvens av mutationer (dvs., ju högre basen, den oftare muterade). Siffrorna ovan en muterad bas anger procentandel frekvensen av mutationer i det bas. Borttagna baser är understrukna. Infogade baser visas med en pil. Siffrorna nedan baserna är referera nukleotid positioner. Uppgifterna är från en publicerad studie23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: räkna plack i titer plattor. För att lättare identifiera plack, hålls tallrikar bredvid en vit ruta och mot en mörk bakgrund med lock tas bort. Titer 20 (A) och antikroppnivåns 100 plåt (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Mutant frekvenser av den cII transgenens i mus embryonala fibroblaster behandlat med olika kemikalier och/eller fysikaliska agenser jämfört med kontroller. Uppgifterna är från publicerade studier på akrylamid12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, δ-aminolevulinsyra (δ-ALA) plus låg dos ultraviolett ljus A (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo(a) pyrenediol epoxihartser (B(a)PDE)19och equilethal doser av UVA, UVB (λ = 280−320 nm), och simulerat solljus UV (SSL)21. För att effektivt metabolisera tamoxifen i mus embryonala fibroblast celler, använde vi S9-aktiveringssystemet (S9 mix) bestående av Aroclor 1 254-inducerad råtta lever preparat och kofaktor reagenser22. Alla skillnader mellan behandlade- och kontrollprover är statistiskt signifikant på p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Mutation spektra av den cII transgenens i mus embryonala fibroblaster bestrålas med UVB relativt kontrollen. Uppgifterna är från en publicerad studie23. De strand spegel motsvarigheterna till alla övergångar (t.ex., G→A och C→T) och transversions (t.ex., G→T och C→A eller G→C och C→G) kombineras. Ins: införande; Del: radering. UVB-inducerad mutation spektrumet kännetecknas av betydande ökningar i relativ frekvens av enkel- eller tandem C→T övergångar på pyrimidin dinucleotides. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Λ väljer cII analysen används för detektion av mutationer i den cII transgenens återhämtat sig från genomisk DNA celler som härrör från organ/vävnader av BB gnagare3. Genomet hos dessa transgena djur innehåller tandem kopior av kromosomalt integrerade λLIZ transfer vektor, som bär den cII (294 bp) och Lindberg (1.080 bp) transgener, som mutationsanalys reporter gener1, 2 , 25. λ väljer cII analysen baseras på hämtning av λLIZ transfer vektorerna genomisk DNA från cellerna eller vävnaderna av transgena djuren, följt av förpackningar räddade vektorer i λ phage huvuden som kan infektera en lämplig värd E. coli. Därefter de infekterade bakterierna odlas selektiv villkor för att scoring och analys av mutationer i den cII transgenens (se figur 1)1,3. Λ väljer cII analysen har använts i stor utsträckning för mutagenicitet testning av ett brett spektrum av kemikalier och/eller fysikaliska agens (ses i referenser2,49). Analysen har framgångsrikt tillämpats transgen mus/råtta cell kulturer behandlas i vitro med olika kemikalier och/eller fysikaliska agens och vävnader/organ motsvarande djuren behandlas i vivo med olika test kemikalier/agenter4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

Λ väljer cII analysen i odlade celler av transgena gnagare behandlas med en test förening representerar, på många sätt, ett lönsamt alternativ till i vivo mutagenicitet experiment i de motsvarande djur som behandlas med testade kemisk/agent 3. som regel den in vitro- modeller erbjuder betydande fördelar jämfört med deras motsvarighet i vivo djurmodeller, som de är mycket mindre labor intensiv och kostsam, kräver mycket mindre tid att slutföra, och viktigast av allt, inte innebär direkt användning av djur2,50,52. Samtidigt, kan in vitro- modeller inte fullt sammanfatta alla aspekter av mutagenes på grund av skillnader i farmakokinetiska och farmakodynamiska egenskaperna av kemikalier mellan odlade celler in vitro- och djurförsök i vivo 2 , 3. exempelvis kemikalier vars exponeringsväg är inhalation (t.ex., cigarett rök eller elektronisk cigarett vapor) kan endast göras mottagliga för in vitro- tester i cellodlingar efter att de konverteras från gasformiga eller ånga formulär till vätska eller kondensat, vilket försvårar deras farmakokinetik. Också, en ofullständig eller frånvarande metaboliska kapacitet av odlade celler in vitro- att omvandla vissa kemikalier till DNA-reaktivt arter kan inte representera DNA-skada driven mutagenicitet i djur som exponerats i vivo genotoxiska kemikalier2 ,3. Även om denna nackdel kan kompenseras, i varierande utsträckning, genom tillägg av en extern metabolisk aktivering systemet (dvs, S9 mix) i in vitro- cell kultur modeller22.

Replikering av verkliga människors exponering för genotoxiska kemikalier/agenter är dessutom mer begränsat med in vitro- cell kultur modeller än med försöksdjur i vivo3. Generellt utsätts människor för kronisk doser av genotoxiska ämnen över en spännvidd på flera år till några årtionden76,77,78. Celler i kultur, jämfört med den relativt längre livslängden av gnagare (dvs, dagar/veckor jämfört med några år) ändliga livslängd gör modellering av människors exponering för genotoxins mer utmanande i tidigare modeller2, 3. Ändå, mutagenicitet analys med in vitro- cell kultur modeller kan ge en första indikation av en viss kemikalie genotoxisk potential medel, och resultaten kan användas som en guide för att utforma 'raffinerade' i vivo experiment som har en 'minskat' antal djur2,3.

Sammanfattningsvis, λ väljer cII analysen i odlade celler av transgena gnagare behandlas med ett test som är sammansatta, eller de motsvarande djur som behandlats med den testa kemisk/agenten, är en värdefull strategi för mutagenicitet testning. Vi har framgångsrikt använt metoden, som har andra forskargrupper över hela världen4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24,34,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67,68,69, 70,71,72,73,74,75. Mer nyligen, har vi utökat tillämpningar av denna strategi genom att utveckla en ny teknik som möjliggör en modifiering av λ väljer cII analysen tillsammans med nästa generations sekvensering hög genomströmning analys av mutationer i en tid-, kostnads-, och labor-effektiva sätt23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författarna förklarar någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi skulle vilja erkänna bidrag från alla kollegor och medarbetare till vår ursprungliga studierna, vars resultat har nämnts i detta manuskript (för illustrativa syften). Författarnas arbete stöds av bidrag från det nationella institutet för Dental- och kraniofaciala forskning av National Institutes of Health (1R01DE026043) till AB och från University of California Tobacco-Related sjukdom forskningsprogram till AB ( TRDRP-26IR-0015) och ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorerna av studien hade ingen roll i studiedesign, datainsamling, dataanalys, tolkning av data, skrivandet av rapporten eller i beslutet att publicera.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828 (2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116 (2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Tags

Infektion fråga 134 Bacteriophage cII transgenens Mutation transfer vektor embryonala mus fibroblaster immunologi och EMF
Den Lambda Välj <em>cII</em> Mutation Detection System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Besaratinia, A., Tommasi, S. The… More

Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter