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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Die Lambda wählen Sie cII Mutation-Detection-System

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für Lambda wählen Sie cII Mutation Assay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetiere oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Dieser Ansatz hat verbreitet zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen.

Abstract

Eine Reihe von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse und Lambda (λ) Select cII Mutation Detection System für Mutagenität Experimente von vielen Forschergruppen weltweit eingesetzt worden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Lambda wählen Sie cII Mutation Assay, die kultivierten Zellen von transgenen Mäusen/Ratten angewendet werden können oder die entsprechenden Tiere behandelt mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse. Das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: (1) Isolierung genomischer DNA aus den Zellen oder Organe/Gewebe von transgenen Tieren behandelt in Vitro oder in Vivo, jeweils mit einer Testverbindung; (2) Wiederherstellung des Lambda-Shuttle Vektors mit mutagenen Reportergen (d.h. cII Transgen) aus genomischer DNA; (3) Verpackung der geretteten Vektoren in infektiösen Bakteriophagen; (4) ein Host-Bakterium infizieren und Kultivierung unter selektiven Bedingungen zur Vermehrung der induzierten cII Mutationen erlauben; und (5) Bewertung der cII-Mutanten und DNA-Sequenz-Analyse zur Ermittlung der Mutantenhäufigkeit cII und Mutation Spektrum bzw..

Introduction

Eine Vielzahl von transgene Tiermodelle und Mutation-Detection-Systeme wurden zu Testzwecken Mutagenität von Karzinogenen in Säugetierzellen entwickelt. Von diesen sind Transgene Mäuse Big Blue (im folgenden als BB bezeichnet) und λ Select cII Mutation Detection System von dieser Gruppe und viele andere Forschung Gruppen weltweit1,2für Mutagenität Experimente eingesetzt worden, 3,4,5,6,7,8,9. Für den vergangenen 16 Jahren haben wir die mutagenen Wirkungen von verschiedenen chemischen und/oder physikalischen Agents verwenden diese transgenen Tieren untersucht oder ihre entsprechenden embryonalen Fibroblasten Zellkulturen mit einer Testverbindung behandelt und anschließend analysiert die Phänotyp und Genotyp des Transgens cII von λ Select cII Assay und DNA-Sequenzierung, bzw.10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. das Genom dieser transgenen Tiere enthält einen Bakteriophagen λ Shuttle Vektor (λLIZ) auf Chromosom 4 als ein Multi-Kopie Head-to-Tail Concatemer1,2,25integriert. ΛLIZ Shuttle Vektor enthält zwei mutagenen Reporter Gene, nämlich der LacI und cII transgene1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Select cII Assay basiert auf der Wiederherstellung der λLIZ Shuttle-Vektoren aus genomischer DNA von Zellen aus Organe/Gewebe von transgenen Tieren1,2,25 . Die wiederhergestellten λLIZ Shuttle-Vektoren werden dann in λ-Phagen-Köpfe in der Lage, einen Indikator Host Escherichia coliInfektion verpackt. Anschließend werden die infizierten Bakterien unter selektiven Bedingungen zu ermöglichen, Bewertung und Analyse von Mutationen in der cII Transgen1,3angebaut.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für λ Select cII Assay, bestehend aus der Isolierung der genomischen DNA von den Zellen/Organen der transgenen Tiere behandelt in Vitro/in Vivo mit einem Test Verbindung, Abruf von der λLIZ shuttle-Vektoren aus der genomischen DNA Verpacken der Vektoren in infektiösen λ-Phagen, Infektion des Wirts E. Coli mit Bakteriophagen, Identifikation von cII-Mutanten unter selektiven Bedingungen der cII Mutantenhäufigkeit bestimmen und DNA-Sequenzanalysen, die cII -Mutation-Spektrum zu etablieren. Das Protokoll kann auch auf transgenen Maus/Ratte Zelle Kulturen behandelt in Vitro mit einem chemisch/physikalische Mittel von Interesse oder Gewebe/Organe der entsprechenden Tiere behandelt in Vivo mit dem Test chemische/Agent1, 2,4,48,49,50,51,52. Eine schematische Darstellung des λ-Select cII -Assays ist in Abbildung 1dargestellt.

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Protocol

1. genomischer DNA-Isolierung aus embryonalen Fibroblasten der Maus

Hinweis: Primäre Maustaste embryonalen Fibroblasten sind nach den veröffentlichten Protokoll53von Embryonen abgeleitet von BB transgenen Mäusen C57BL/6 genetischen hintergrund isoliert. Das Ausgangsmaterial für dieses Protokoll besteht aus 1 x 106 bis 1 x 107 embryonalen fibroblastenzellen mit einem Test zusammengesetzte versus Kontrolle behandelt. Die Ernte und die Zählung der diese Zellen unter Verwendung von standard-Methoden werden in Referenzen10,54,55beschrieben.

  1. Bereiten Sie eine (0,3 M Saccharose 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,5 mM Spermidine, Spermin 0,15 mM und 2 mM EDTA)-Puffer, Puffer B (150 mM NaCl und 5 mM EDTA, pH 7,8) und C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0-Puffer 20 mM NaCl, 20 mM EDTA und 1 % SDS) im voraus und erhalten bei Raumtemperatur (RT) für bis zu einem Jahr54,55.
  2. Aufschwemmen Sie Zellen in 2 – 4 mL Puffer, die A in einem 15 mL konische Zentrifugenröhrchen durch pipettieren immer wieder nach oben und unten mit einem breiten 1.000 µL PIPETTENSPITZE trug.
  3. Fügen Sie ein Volumen (2 – 4 mL) Puffer A mit 1 % Octylphenoxypolyethoxyethanol (z.B.Nonidet P40) mit einer serologischen Glaspipette.
  4. Inkubieren Sie das Rohr für 5 min auf Eis.
  5. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.000 X g für 5 min bei RT
  6. Den überstand verwerfen und das Pellet mit 10 – 15 mL Puffer A mit einer Glaspipette serologische waschen.
  7. Aufschwemmen Sie das Pellet in 2 – 4 mL Puffer B.
  8. Fügen Sie ein Volumen (2 – 4 mL) Puffer C enthält 600 µg/mL Proteinase K.
  9. Inkubieren Sie das Rohr für 3 h bei 37 ° c
  10. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 100 µg/mL RNase A.
  11. Inkubieren Sie das Rohr für weitere 1 h bei 37 ° c
  12. Fügen Sie ein Volumen (2 – 4 mL) Phenol (durchtränkt von 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0):chloroform:isoamyl Alkohol (25:24:1 Vol/Vol).
    Hinweis: Phenol kann schwere gesundheitliche Gefahren und muss mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Phenol ist hoch ätzend auf die Haut und durch es bereitwillig aufgenommen und weist andere Effekte. Beim Umgang mit Phenol, immer verwenden Sie doppelte gloving, Schutzbrille aufsetzen, und in einem chemischen Abzug arbeiten.
  13. Mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre für 5 min auf ein Rohr Rotator bei 4 ° c
  14. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.000 X g für 5 min bei 4 ° C.
  15. Die wässrige Phase (oberste Schicht) zu einem neuen Schlauch mit einer Glaspipette serologische zu entfernen.
  16. Wiederholen Sie Phenol: Chloroform: Isoamyl-Alkohol-Extraktion 1 bis 3 Mal, bis die wässrige Phase klar ist und das Interface nicht mehr trüben ist.
  17. Fügen Sie 1/10 Volumen (200 – 400 µL) 3M Natriumacetat, pH 5.2.
  18. Fügen Sie 2,5 Volumen (5 – 10 mL) 100 % Ethanol (gekühlt) und invertieren Sie die Röhre vorsichtig von Hand für 2 – 3 min..
  19. Die DNA mit einem Glas Haken Spool und überträgt es auf ein neues Röhrchen mit 1 – 5 mL 70 % Ethanol und gründlich waschen. Zentrifugieren Sie alternativ das Rohr mit hoher Geschwindigkeit (3.500 X g) bei 4 ° C, pellet-DNA und waschen sie gründlich mit 1 – 5 mL 70 % Ethanol.
  20. Zentrifugieren Sie das Rohr mit hoher Geschwindigkeit (3.500 X g) bei RT, entfernen Sie den überstand zu und trocknen Sie die DNA für 10-15 Minuten an der Luft.
  21. Auflösen der DNS in 10-100 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), und bei 4 ° C (für kurze Lagerung von bis zu einem Monat) oder bei-20 ° C (für längere Lagerzeit) zu speichern. Die optimale Konzentration für DNA für die λ-Select cII -Assay ist 0,5-1,0 µg/µL (in TE-Puffer)56.

2. in-vitro- Verpackung-Reaktion

  1. Pro eine Verpackung Reaktion hinzufügen ~ 5 µg genomische DNA (Endvolumen: 8 – 12 µL, genomische DNA wurde in Abschnitt 1 von Maus embryonalen Fibroblasten behandelt in Vitro mit einer Testverbindung oder Steuerelement isoliert) zu einem Microcentrifuge Schlauch, enthält das erste Reaktion Mischung (~ 10 µL).
    Hinweis: Im Haus vorbereitet oder handelsüblichen λ Verpackung Extrakte werden in verschiedenen Labors verwendet. In der kommerziellen Verpackung Extrakt Kit verwendet hier56 (siehe die Tabelle der Materialien), Rote Rohre enthalten die erste Reaktion Mischung (~ 10 µL) und blaue Rohre enthalten die zweite Reaktion Mischung (~ 70 µL für mindestens 5 Reaktionen).
  2. Inkubieren Sie das Rohr für 90 min. bei 30 ° c
  3. Das Rohr das erforderliche Volumen (~ 12 µL) der zweite Reaktion Mischung hinzufügen.
  4. Inkubieren Sie das Rohr für eine zusätzliche 90 min. bei 30 ° c
  5. Das Rohr 1,1 mL SM-Puffer hinzufügen.
    Hinweis: 1 mL dieser Lösung (z.B. Verpackung Reaktionsgemisch) wird verwendet, für das screening von λ cII-Mutanten. Der Rest wird für verschoben verwendet werden.
    1. Vorbereitung SM-Puffer durch das Mischen von 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) und 5 mL 2 % (w/V) Gelatine. DH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter, Autoklaven für 30 min. bei Raumtemperatur bis zu 1 Jahr Store hinzufügen.
  6. Wirbel der Röhre mit der verpackte DNA-Probe für 10 s bei RT (kräftig aufschütteln).
  7. Pulse spin das Rohr in eine Microcentrifuge und speichern auf Eis bis zum Gebrauch. Wenn die Probe nicht am selben Tag der Verpackung verwendet werden soll, fügen Sie 50 µL Chloroform pro mL verpackte DNA-Probe, Wirbel sanft, und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.

3. Vorbereitung der E. Coli G1250 Bakterienkultur

  1. Machen Sie mindestens zwei Tage vor der Beschichtung, ein paar bakterielle Streifen Teller von Escherichia coli (E. Coli) G1250 auf Agarplatten TB1-Kanamycin.
    1. TB1-Kanamycin Agarplatten wie folgt vorbereiten. Mischen Sie 5,0 g NaCl, 10,0 g Casein Pepton und 12,0 g Agar. 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid hinzufügen. Stellen Sie pH 7.0 mit NaOH oder HCl. Add dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter.
    2. Mischen Sie gut und Autoklaven für 30 min. zulassen auf 55 ° c abkühlen 50,0 mg Kanamycin und verrühren. Gießen Sie in sterile Petrischalen 100 mm (20 – 25 mL pro Gericht). Shop-Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen.
  2. Inkubieren Sie die bakterielle Streifen Platten in einem stationären 30 ° C Inkubator für mindestens 24 h.
  3. Kombinieren Sie einen Tag vor der Beschichtung, 10 mL des flüssigen Mediums TB1 mit 100 µL 20 % (w/V) Maltose-1 M MgSO4 Lösung in einem sterilen 50 mL Schraubverschluss konische Rohr.
    1. TB1 flüssiges Medium wie folgt vorbereiten. Mix-5,0 g NaCl und 10,0 g Casein Pepton, dann 800 mL dH2O, 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid, hinzufügen und anpassen den pH-Wert 7,0 mit NaOH oder HCl. Dann dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter hinzufügen, gut mischen und Autoklaven für 30 min. speichern das Medium bei RT für bis zu drei Monaten.
    2. 20 % (w/V) Maltose-1 M MgSO4 wie folgt vorbereiten. Mischen Sie 20,0 g Maltose und 24,6 g MgSO4. 7H2O, dann fügen Sie dH2O zu einem Endvolumen von 100 mL. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C für bis zu 6 Monate zu speichern.
  4. Das flüssige Medium mit mehrere Kolonien von der bakteriellen Streifen-Platte mit einem sterilen Impfkeimen Schleife56zu impfen.
  5. Inkubieren Sie die Flüssigkultur über Nacht in einem 30 ° C schütteln Inkubator mit kräftig schütteln (250 – 300 u/min).
  6. Am Tag der Beschichtung Zentrifugieren der konischen Röhrchen mit der G1250 Flüssigkultur 1.500 x g für 10 min bei RT zu die Bakterienzellen Pellets.
  7. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL 10 mM MgSO4.
  8. Messen Sie die Absorption von einem 01:10 Verdünnung der Zellsuspension bei Wellenlänge 600 nm mit einem UV-Vis Spektralphotometer (z.B., 100 µL Zellsuspension + 900 µL 10 mM MgSO4)56.
  9. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine endgültige OD600 von 0,5 mit 10 mM MgSO4. Die vorbereiteten Aussetzung der G1250 E. Coli mit OD600 = 0,5 wird als "G1250 Beschichtung Kultur" bezeichnet.
  10. Speichern der G1250 Beschichtung Kultur auf Eis und innerhalb von 1-2 h verwenden.

(4) Beschichtung die verpackte DNA-Proben

  1. Je eine verpackte DNA-Probe bereiten Sie sechzehn steril 14 x 100 mm2 Rundboden Röhrchen und sechzehn TB1 Agarplatten vor. Zehn aus jedem Satz wird für Screening und sechs für verschoben (drei für Titer 20) und drei für Titer 100 verwendet werden.
    1. TB1 Agarplatten wie folgt vorbereiten. Mix-5,0 g NaCl, 10,0 g Casein Pepton und 12,0 g Agar, fügen dann 800 mL dH2O und 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit NaOH oder HCl, und fügen Sie dH2O zu einem Endvolumen von 1 L.
    2. Gut mischen und Autoklaven für 30 min. lassen Sie die Mischung auf 55 ° C abkühlen lassen, dann Gießen sie in sterile 100 mm Petrischalen (20 – 25 mL pro Gericht). Speichern Sie die Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen.
      Hinweis: TB1 Agarplatten sollte mindestens 24 Stunden vor Gebrauch vorbereitet werden.
  2. Aliquoten 200 µL der G1250 Beschichtung Kultur in jedem Rundboden Röhrchen.
  3. Für verschoben, machen eine 1: 100 Verdünnung der verpackten DNA Probe und mischen Sie gut durch Vortexen (d.h., 10 µL verpackt DNA-Probe + 990 µL SM-Puffer).
  4. 20 µL der 1: 100 Verdünnung hinzu kommt jedes der drei Titer 20 Rohre.
  5. Fügen Sie jedes der drei Titer 100 Rohre 100 µL der Verdünnung 1: 100 hinzu.
  6. Für das Screening, fügen 100 µL der "unverdünnt" verpackte DNA-Probe zu jedem der zehn Screening-Röhren.
  7. Verarbeiten alle verschoben und Screening-Röhren (2 x 3 + 10 = 16 Rohre), wie folgt: Mischen Sie gut durch Vortexen für ca. 10 s, und dann bei Raumtemperatur für 30 min zu den Host E. Coli zu adsorbieren, die Phagen ermöglichen inkubieren.
  8. 2,5 mL Mikrowelle geschmolzenen TB1 top Agar (abgekühlt auf 55 ° C) zu jeder Titer oder screening-Rohr, mischen sofort durch Vortexen (sanft), hinzufügen und Gießen in die entsprechenden Titer oder screening TB1 Agarplatten.
    1. TB1 obere Agar wie folgt vorbereiten. Mix-5,0 g NaCl, 10,0 g Casein Pepton und 7,0 g Agar, dann 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1 % Thiamin Hydrochlorid, dann stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit NaOH oder HCl. Zu guter Letzt fügen Sie dH2O zu einem Endvolumen von 1 Liter.
    2. Mischen Sie gut und Autoklaven für 20 – 25 min. Store bei Raumtemperatur für bis zu drei Monaten.
    3. Vor dem Einsatz bereite TB1 obere Agar in der Mikrowelle schmelzen, gut mischen und auf 55 ° C im Wasserbad abkühlen lassen.
      Hinweis: Die geschmolzene und abgekühlte TB1-Spitze wird hinzugefügt, um den Inhalt der einzelnen Titer oder Screening-Rohr und nach dem Mischen, in die entsprechenden Titer oder Screening TB1 Agarplatten gegossen wird.
  9. Lassen Sie die Platten stehen für 15-30 min bei Raumtemperatur, bei geschlossenem Deckel einen Spalt offen, um Kondensation zu verhindern.
  10. Invertieren die Platten und die zehn Screening-Platten in einem Inkubator stationäre 24 ° C und 46 – 48 h (d.h., selektiven Bedingungen) und die sechs Titer-Platten in einem Inkubator stationäre 37 ° C inkubieren und inkubieren 24 h/Übernachtung (d. h., nicht-selektiven Bedingungen).
    Hinweis: Für Qualitätssicherung und Standardisierung der Ergebnisse, sind handelsübliche Phagen Steuerungslösungen mit einer Mischung aus Wildtyp und Mutanten cII mit bekannten Mutantenhäufigkeit vernickelt neben die verpackten DNA-Proben und in allen Zimmern Test läuft56.

5. Prüfung der Titer und Screening-Platten um die cII Mutant Frequenz zu bestimmen

  1. Im Anschluss an die 24 h/Übernachtung Inkubation bei 37 ° C Count die Anzahl der Plaketten in jeder der drei Titer 20 Platten und Titer 100 Platten gebildet. Um die Plaketten leichter identifizieren zu können, halten Sie die Platte neben einem weißen Lichtkasten und vor einem dunklen Hintergrund mit Deckel entfernen (siehe Abbildung 2).
  2. Stellen ein Durchschnitt (Mittelwert) der Zahl der Plaketten in jedem Satz der Titer 20 und Titer 100 Platten gezählt (dreifacher, jeweils).
  3. Wählen Sie die durchschnittliche Zahl aus der Menge der Titer-Platten, die am nächsten an die Reichweite von 50 – 200 Plaques pro Platte Satz fällt.
  4. Die Gesamtzahl der Plaketten gezeigt in den zehn Screening-Platten wie folgt zu berechnen:
    Total abgeschirmte Plaketten (mittlere Anzahl von Plaques in den gewählten Titer Platten ÷ Anzahl der µL Verdünnung pro gewählten Titer Platte verwendet) = x Verdünnungsfaktor x Anzahl der µL verpackte DNA-Probe pro Platte [100 µL/Platte] screening x Anzahl der screening-Platten [10].
    Hinweis: zum Beispiel wird wenn die mittlere Anzahl von Plaques pro Platte in den Titer 20 Platten 128 ist und die entsprechende Zahl in der Menge der Titer 100 Platten 478, die Zahl 128 für die Berechnung der Gesamtzahl von Plaques gezeigt verwendet werden , wie folgt:
    (128 ÷ 20) X 100 [Verdünnungsfaktor] x 100 [µL/Platte] X 10 [Platten] = 640.000
    Dies entspricht die mittlere Anzahl von Plaques mit 5.000 oder 1.000, multiplizieren, wenn die durchschnittliche Anzahl bzw. auf Grafen aus Titer 20 Platten oder Titer 100 Platten, basiert.
  5. Nach 46 – 48 h Inkubation bei 24 ° C die insgesamt Anzahl von Plaques in den zehn Screening-Platten (folgen Sie den Anweisungen in Abschnitt 5.1) gebildet.
    Hinweis: Die cII Mutantenhäufigkeit errechnet sich durch Division der Gesamtzahl von Plaques in den Screening-Platten gebildet durch die Gesamtzahl der Plaques gezeigt. Mit dem obigen Beispiel, wenn die Gesamtzahl von Plaques in den zehn Screening-Platten gezählt ist die 112, die cII Mutantenhäufigkeit für diese DNA-Probe wäre 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5.

6. Überprüfung der Putative λ cII Mutanten, PCR-Amplifikation und DNA-Sequenzierung

  1. Die Plakette in Frage mit einer sterilen, weite Bohrung pipettieren Spitze entkernen und in einen sterilen Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL steriler SM-Puffer (durch pipettieren rauf und runter) zu vertreiben.
  2. Mindestens 2 h bei Raumtemperatur inkubieren Sie, oder stecken Sie bei 4 ° C über Nacht, erlauben die Phagen-Teilchen aus dem Agar eluieren.
  3. In einem sterilen 14 x 100 mm2 Rundboden Röhrchen 200 µL der G1250 Beschichtung Kultur mit 1 µL der entkernt Phagen-Lösung mischen und 30 min bei RT inkubieren
  4. Die Probe mit 2,5 mL 55 ° C geschmolzene TB1 obere Agar-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 24 ° C 46 – 48 h (selektiven Bedingungen), wie in Abschnitte 4.8 – 4.10 beschrieben.
  5. Nach den sekundären Plaques gebildet haben, mithilfe eine PIPETTENSPITZE wählen Sie sorgfältig einen einzigen gut isolierten verifizierten λ cII-mutierten Plaque (berühren der unteren Agar).
    Hinweis: Die vermeintliche cII mutierten Plaques Replating dient zwei Zwecken: (i) Beschichtung Artefakte kann manchmal kleine Plaketten; verwechselt werden und (Ii) eine Agarose-Kern entnommen einer Screening-Platte kann nicht mutierte Phage(s) zusammen mit einem mutierten Phagen enthalten. Sekundäre Plaketten von geringer Dichte replating bieten eine unberührte mutierte Vorlage für PCR und anschließende DNA-Sequenzanalyse.
  6. Übertragen Sie die Plakette zu einem Microcentrifuge Schlauch mit 25 µL bidestilliertem Wasser von oben und unten pipettieren.
  7. Platzieren Sie das Rohr in kochendem Wasser für 5 Minuten.
  8. Zentrifugieren Sie mit maximaler Geschwindigkeit (18.000 X g) für 3 Minuten bei RT
  9. Übertragen Sie 10 µL des Überstands sofort zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch mit 40 µL einer PCR Mastermix, in denen die Endkonzentrationen der Reagenzien sind 1 X Taq PCR Puffer, 10 Pmol jedes der vorwärts- und Primer, 12,5 Nmol jedes dNTP, , und 2.5 U der Taq-DNA-Polymerase.
    Hinweis: Die Forward- und reverse Primer sind wie folgt: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3 "(-68 bis-50 relativ cII start Codon Positionen) und 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3" (Positionen +345 zu +365 im Verhältnis zu der cII -Start-Codon), beziehungsweise.
  10. Verstärken Sie die Vorlage mit den folgenden Parametern Radsport: ein 3 min Denaturierung bei 95 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C und 1 min bei 72 ° C, mit der letzten Erweiterung von 10 min bei 72 ° C.
  11. Reinigen Sie das 432 bp PCR-Produkt der cII -gen enthalten und flankierenden Regionen mit handelsüblichen PCR-Reinigung-Kits, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  12. DNA-Sequenzierung mit einem entsprechenden Sequenzierung Plattform durchführen und analysieren die resultierenden DNA-Sequenzen zur Erkennung von Mutationen in der cII -Transgen (siehe Hinweis unten).
    Hinweis: Dies wird am besten durch Ausrichtung mit der Referenz- cII -Sequenz mit einer Software, wie die Web-basierte T-Coffee Reihenfolge Ausrichtung Server erreicht. Anweisungen zur Verwendung des Programms finden Sie auf: http://tcoffee.crg.cat/

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Representative Results

Je nach Verteilung der Daten werden parametrische oder nicht-parametrische Tests verwendet, um die Bedeutung der Unterschied in der Mutantenhäufigkeit cII zwischen Behandlung und Kontrollgruppen (d. h.im Vergleich zu spontanen mutierten Frequenzen induziert) bestimmen . Vergleich der induzierten cII mutierten Frequenzen in ganz verschiedenen Behandlungsgruppen erfolgt durch verschiedene (paarweise) statistische Tests, soweit anwendbar. Hypergeometrische Test von Adams und Skopek ist allgemein verwendet, die gesamte induzierte und spontane Mutation Spektren57, vergleichen, obwohl andere Tests, wie der χ2 -Test oder Varianzanalyse (ANOVA), auch verwendet werden, können um die Frequenz zu vergleichen der jeweiligen spezifischen Mutation (z.B., Übergang, Transversion, einfügen oder Löschen von) zwischen den induzierten und Mutation Spektren oder verschiedenen Mutation Spektren induziert durch verschiedene Chemikalien/Agenten oder unterschiedlichen Dosen des gleichen chemische/Agent.

Abbildung 3 ist eine Zusammenstellung der Mutantenhäufigkeit Daten aus veröffentlichten Studien, in denen wir gezeigt haben, dass das Ausmaß der Erhöhung der relativen cII Mutantenhäufigkeit in Maus embryonalen Fibroblasten mit verschiedenen Chemikalien behandelt, und/oder Physicalagents variieren von ein paar-bis mehrere hundertfach, je nach der mutagenen "Potenz" der Testsubstanz. Statistisch signifikante Falte-Anstieg der Mutantenhäufigkeit cII sind Maus embryonalen Fibroblasten behandelt mit Acrylamid12, glycidamid14, aflatoxinB1(AFB1)22, Tamoxifen18gezeigt, Δ-Aminolävulinsäure (δ-ALA) sowie niedrige Dosis UV-A Licht (UVA: λ > 320−400 nm)15, Benzo (a) pyren Diol epoxide(B(a)PDE)19und Equilethal Dosen von UVA, UVB (λ = 2 80−320 nm), und simuliert Sonnenlicht UV (SSL) 21 (siehe Abbildung 3).

Abbildung 4 ist ein Beweis für die Sequenz-Spezifität von Mutationen in denen wir die Induktion bestimmter Arten der Mutation in der cII -Transgen in Mouseembryonicfibroblasts mit UVBrelativetocontrol23bestrahlt gezeigt haben. Das Spektrum der UVB-induzierte Mutation zeichnet sich durch deutliche Steigerungen in relative Häufigkeit der Einzel- oder Tandem C→T Übergänge an Pyrimidine dinucleotid.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des λ-Select cII -Assays. Der Test basiert auf den Abruf der λLIZ Shuttle-Vektoren, die die cII -Transgen als ein mutagenen Reportergen aus genomischer DNA des kultivierten Zellen aus transgenen Nagetiere behandelt in Vitro mit einer Testverbindung enthalten oder Gewebe/Organe der entsprechenden Tiere behandelt in Vivo mit dem getesteten chemischen/Agenten (A und B). Die geretteten Vektoren sind in λ-Phagen-Köpfe gepackt, die einen entsprechenden Host E. Coli (C und D) infizieren können. Die infizierten Bakterien wachsen dann unter selektiven Bedingungen zu ermöglichen, Bewertung und Analyse von Mutationen in der cII Transgen1,2,3,25, 52 (E). Bestimmung der Mutantenhäufigkeit induzierte cII und Etablierung des Spektrums Mutation durch DNA-Sequenzierung in F und Gbeschrieben werden. Die induzierte und spontane Mutation Spektren werden in verschiedenen Formaten visualisiert. Zur Veranschaulichung haben wir eine Format, in der die induzierte cII Mutationen oberhalb der referenzsequenz eingegeben werden, hervorgehoben, während die spontane Mutationen (Kontrolle) unterhalb der referenzsequenz (H) eingegeben werden. Die Höhe einer mutierten Basis darstellt von der Häufigkeit der Mutationen (d. h., je höher die Basis, die häufiger mutierte). Zahlen über eine mutierte Basis zeigen die prozentuale Häufigkeit von Mutationen in dieser Basis. Gelöschte Basen sind unterstrichen. Eingefügte Basen werden mit einem Pfeil angezeigt. Zahlen unten die Grundlagen sind Verweis Nukleotid-Positionen. Die Daten stammen aus einer veröffentlichten Studie23. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: zählen Plaques im Titer Platten. Um die Plaketten leichter zu identifizieren, sind Platten mit Deckel entfernt neben einem weißen Lichtkasten und vor einem dunklen Hintergrund statt. Titer 20 Platte (A) und Titer 100 Platte (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Mutant Frequenzen des Transgens cII in Maus embryonalen Fibroblasten mit verschiedenen Chemikalien und/oder physikalische Einwirkungen im Vergleich zu Kontrollen behandelt. Die Daten stammen aus veröffentlichten Studien über Acrylamid12, glycidamid14, aflatoxinB1(AFB1)22, Tamoxifen18, δ-Aminolävulinsäure (δ-ALA) sowie niedrige Dosis UV-Licht A (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo(a) Pyrenediol-Epoxid (B(a)PDE)19und Equilethal Dosen von UVA, UVB (λ = 280−320 nm), und simuliert Sonnenlicht UV (SSL)21. Um effizient verstoffwechseln Tamoxifen in Mauszellen embryonalen Fibroblasten, verwendeten wir die S9-Aktivierungs-System (S9-Mix) bestehend aus einzelsträngiger 1.254-induzierte Ratte Leber Vorbereitungen und Cofaktor Reagenzien22. Alle Unterschiede zwischen behandelt- und Kontrollproben sind statistisch signifikant bei p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Mutation Spektren des Transgens cII in Maus embryonalen Fibroblasten relativ zum Steuerelement mit UVB bestrahlt. Die Daten stammen aus einer veröffentlichten Studie23. Strang-Spiegel-Kollegen aller Übergänge (z. B.G→A und C→T) und Transversions (z.B., G→T und C→A oder G→C und C→G) werden kombiniert. Ins: Einfügung; Del: löschen. Das Spektrum der UVB-induzierte Mutation zeichnet sich durch deutliche Steigerungen in relative Häufigkeit der Einzel- oder Tandem C→T Übergänge an Pyrimidine dinucleotid. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Der λ-Select cII -Test dient zum Nachweis von Mutationen in der cII -Transgen erholt aus genomischer DNA von Zellen aus Organe/Gewebe von BB Nagetiere3. Das Genom dieser transgenen Tiere enthält mehrere Tandem Kopien der chromosomal integrierte λLIZ Shuttle-Vektor, der die cII trägt (294 bp) und LacI (1.080 bp) transgene, als die Mutationszucht Reporter Gene1, 2 , 25. λ Select cII Assay basiert auf den Abruf der λLIZ Shuttle-Vektoren aus genomischer DNA von Zellen/Gewebe von transgenen Tieren, gefolgt von Verpackungen der geretteten Vektoren in λ-Phagen-Köpfe, die einen geeigneten Wirt zu infizieren E. Coli. Anschließend werden die infizierten Bakterien unter selektiven Bedingungen zu ermöglichen, Bewertung und Analyse von Mutationen in der cII -Transgen gezüchtet (siehe Abbildung 1)1,3. Die λ-Select cII -Assay wurde ausgiebig zu Testzwecken Mutagenität einer breiten Palette von Chemikalien und/oder physikalische Einwirkungen (rezensiert in Referenzen2,49) verwendet. Der Test wurde erfolgreich angewandt transgenen Maus/Ratte Zelle Kulturen behandelt in Vitro mit verschiedenen Chemikalien und/oder physikalische Einwirkungen und Gewebe/Organe der entsprechenden Tiere behandelt in Vivo mit verschiedenen test Chemikalien/Agenten4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

Λ Select cII Assay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetiere behandelt mit einem Test Verbindung stellt in vielerlei Hinsicht eine echte Alternative zu in-Vivo Mutagenität Experimente in den entsprechenden Tieren mit der getesteten chemischen/Agent behandelt 3. als Faustregel, die in-vitro- Modelle bieten erhebliche Vorteile gegenüber ihrem Pendant in Vivo Tiermodellen, da sie viel weniger arbeitsintensiv und teuer sind, erfordern viel weniger Zeit abgeschlossen werden, und vor allem nicht beinhalten Sie die direkte Verwendung der Tiere2,50,52. Zur gleichen Zeit können die in-vitro- Modelle nicht vollständig alle Aspekte der Mutagenese durch Unterschiede in den pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften von Chemikalien der kultivierten Zellen in Vitro und Versuchstieren rekapitulieren in vivo 2 , 3. Z. B. Chemikalien, deren Expositionspfad Inhalation (z.B. Zigaretten Rauch oder elektronische Zigarette Dampf) können nur vorgenommen werden offen für in-vitro- Tests in Zellkulturen, nachdem sie von gasförmigen umgewandelt werden oder Dampf Formen, Flüssigkeit oder Kondensat, wodurch ihre Pharmakokinetik erschwert. Auch eine unvollständige oder abwesend metabolische Kapazität von kultivierten Zellen in Vitro , bestimmte Chemikalien in DNA-reaktiven Spezies umzuwandeln entsprechen möglicherweise nicht DNA-Schäden getrieben Mutagenität in Tieren in Vivo genotoxische chemische2 ,3. Obwohl dieser Nachteil ausgeglichen werden kann, in unterschiedlichem Ausmaß durch die Zugabe von einem externen Stoffwechselaktivierung System (d.h. S9-Mix), die in-vitro- Zell-Kultur Modelle22.

Darüber hinaus beschränkt sich die Replikation der realen menschlichen Exposition gegenüber genotoxischen Chemikalien/Agenten mehr mit in-vitro- Kultur zellmodelle als Versuchstiere in Vivo3. Im Allgemeinen sind Menschen über einen Zeitraum von mehreren Jahren auf wenige Jahrzehnte76,77,78chronische Dosen von genotoxischen Agenzien ausgesetzt. Die endliche Lebensdauer der Zellen in der Kultur, im Vergleich zu den relativ längere Lebensdauer von Nagetieren (d.h. Tage/Wochen im Vergleich zu ein paar Jahren) macht Modellierung der menschlichen Exposition gegenüber Genotoxins anspruchsvoller in der früheren Modelle2, 3. Dennoch, Mutagenität Analyse mit in-vitro- Kultur zellmodelle bieten einen ersten Hinweis auf das genotoxisches Potenzial einer bestimmten Chemikalie / Bevollmächtigten und die Ergebnisse können als Leitfaden verwendet werden, "verfeinert" in Vivo Experimente entwerfen welche Funktion eine "reduzierte" Anzahl der Tiere2,3.

Zusammenfassend, λ Select cII Assay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetieren mit einer Testverbindung behandelt, oder die entsprechenden Tiere behandelt der getesteten chemischen/Agent, ist ein wertvoller Ansatz zu Testzwecken Mutagenität. Wir haben das Konzept erfolgreich eingesetzt, wie andere Forschergruppen in der gesamten Welt4,5,6,7,8,9,10haben, 11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24,34,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67,68,69, 70,71,72,73,74,75. Vor kurzem haben wir die Anwendungen dieses Ansatzes erweitert, durch die Entwicklung einer neuen Technik eine Änderung des λ Select cII Assays zusammen mit Next Generation Sequencing Hochdurchsatz-Analyse der Mutationen in einer Zeit, Kosten ermöglicht, und Arbeit-wirksame Weise23.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Acknowledgments

Wir würden gerne die Beiträge aller Kollegen und Mitarbeiter zu unserer ursprünglichen Studien, deren Ergebnisse in diesem Manuskript (zur Veranschaulichung) erwähnten anerkennen. Arbeit der Autoren wird unterstützt durch Zuschüsse aus dem nationalen Institut für zahnärztliche und Craniofacial Forschung von den National Institutes of Health (1R01DE026043), AB und an der University of California Tobacco-Related Krankheit Forschungsprogramm, das AB ( TRDRP-26IR-0015) und ST (TRDRP-25IP-0001). Die Sponsoren der Studie hatte keine Rolle im Studiendesign, Datenerhebung, Datenanalyse, Datenauswertung, Schreiben des Berichts oder in der Entscheidung zur Veröffentlichung einreichen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

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