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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

La Lambda seleccione cII sistema de detección de mutación

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Se describe un protocolo detallado para el ensayo de mutación Lambda seleccione cII en cultivos de células de roedores transgénicos o los correspondientes animales tratados con un agente químico físico de interés. Este enfoque ha sido ampliamente utilizado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos.

Abstract

Un número de modelos animales transgénicos y sistemas de detección de mutación ha sido desarrollado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos. De estos ratones transgénicos y el Lambda (λ) Seleccione cII sistema de detección de mutación han sido utilizados para experimentos de mutagenesis por muchos grupos de investigación en todo el mundo. Aquí, describimos un protocolo detallado para el ensayo de mutación de cII en seleccionar Lambda, que se puede aplicar a cultivos de células de ratones/ratas transgénicas o los correspondientes animales tratados con un agente químico físico de interés. El protocolo consta de los siguientes pasos: (1) aislamiento de ADN genómico de las células o los órganos/tejidos de los animales transgénicos trataron en vitro o en vivo, respectivamente, con un compuesto de prueba; (2) recuperación del vector lanzadera lambda lleva un gen reportero mutacional (es decir, transgén cII ) de la DNA genómico; (3) envases de los vectores rescatados en bacteriófagos infecciosos; (4) que infecta a una bacteria huésped y cultivo selectivo condiciones para permitir la propagación de las mutaciones inducidas cII ; y (5) anotar la cII-mutantes y ADN la secuencia de análisis para determinar la frecuencia de mutantes cII y el espectro de la mutación, respectivamente.

Introduction

Una amplia gama de modelos de animales transgénicos y sistemas de detección de mutación se han desarrollado para las pruebas de mutagenicidad de agentes carcinógenos en células de mamíferos. De estos ratones transgénicos Big Blue (denominado en adelante BB) y λ Select cII sistema de detección de mutación han sido empleados para experimentos de mutagenesis por este grupo y muchos otros investigación grupos en todo el mundo1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Durante los últimos 16 años, hemos investigado los efectos mutagénicos de diversos agentes químicos o físicos con estos animales transgénicos o sus correspondientes cultivos celulares de fibroblastos embrionarios trataron con un compuesto de prueba y posteriormente analizaron el fenotipo y genotipo del transgén cII por el λ Select cII análisis y secuenciación de ADN, respectivamente10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. el genoma de estos animales transgénicos contiene bacteriófago λ transporte vector (λLIZ) integrado en el cromosoma 4 como un concatemer de cabeza a la cola de copia múltiple1,2,25. El vector de la lanzadera λLIZ lleva dos genes del reportero mutacional, es decir, el lacI y cII los transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. el ensayo Select cII λ se basa en la recuperación de los vectores de transporte λLIZ de ADN genómico de células derivadas de órganos/tejidos de animales transgénicos1,2,25 . Los vectores de transporte λLIZ recuperado luego se empaquetan en cabezas de fago λ capaces de infectar a un huésped indicador Escherichia coli. Posteriormente, se cultivan las bacterias infectadas bajo condiciones selectivo para permitir puntuación y análisis de mutaciones en el cII transgen1,3.

Aquí, describimos un protocolo detallado para el ensayo de selección cII λ, que consiste en el aislamiento de ADN genómico de células/órganos de animales transgénicos tratados en vitro/en vivo con una prueba compuesta, recuperación de la λLIZ traslados de vectores de la DNA genomic, empaquetado de los vectores en fagos λ infecciosa, infección del huésped e. coli con los bacteriófagos, identificación de la cII-mutantes en condiciones selectivas para determinar la frecuencia de mutantes de cII , y Análisis de la secuencia de ADN para establecer el espectro de mutación de la cII . El protocolo se puede aplicar a rata Ratón transgénico de la célula las culturas tratados en vitro con un agente químico físico de interés, o tratado de los tejidos/órganos de los animales correspondientes en vivo con el test químico/agente1, 2,4,48,49,50,51,52. Una presentación esquemática de la prueba de selección cII λ se muestra en la figura 1.

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Protocol

1. genómica ADN aislado de fibroblastos embrionarios de ratón

Nota: Los fibroblastos embrionarios de ratón primario son aislados de embriones derivados de ratones transgénicos de BB con fondo genético C57BL/6, según el protocolo publicado53. El material de partida de este protocolo consiste en 1 x 106 a 1 x 107 células de fibroblasto embrionario tratadas con un test compuesto versus control. La recolección y recuento de estas células mediante métodos estándar se describen en referencias10,54,55.

  1. Preparación de buffer una (0,3 M sacarosa, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM espermidina, espermina de 0,15 mM y 2 mM EDTA), tampón B (150 mM de NaCl y 5 mM EDTA, pH 7.8) y el tampón C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 NaCl de 20 mM, 20 mM EDTA y 1% SDS) anticipación y reserva a temperatura ambiente (RT) por hasta un año54,55.
  2. Resuspender las células en 2 – 4 mL de tampón en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL por pipetear repetidamente arriba y abajo utilizando una amplia llevaba 1.000 μl Punta de pipeta.
  3. Añadir un volumen (2-4 mL) buffer A contiene 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (p. ej., Nonidet P40) usando una pipeta serológica de vidrio.
  4. Incubar el tubo en hielo durante 5 minutos.
  5. Centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 5 min a TA.
  6. Deseche el sobrenadante y lavar el sedimento con 10-15 mL de tampón de un utilizando una pipeta serológica de vidrio.
  7. Resuspender el precipitado en 2 – 4 mL de tampón B.
  8. Añadir un volumen (2-4 mL) buffer C contiene 600 μg/mL proteinasa K.
  9. Incubar el tubo durante 3 h a 37 ° C.
  10. Añadir Rnasa A para una concentración final de 100 μg/mL.
  11. Incubar el tubo por un adicional 1 h a 37 ° C.
  12. Añadir un fenol de volumen (2-4 mL) (saturado en 0.1 M Tris-HCl, pH 8,0) alcohol:chloroform:isoamyl (25:24:1 vol/vol).
    Nota: Fenol puede suponer un peligro para la salud graves y debe manipularse con extrema precaución. Fenol es altamente corrosivo a la piel y fácilmente absorbido a través de él y exhibe otros efectos. Cuando manejo fenol, utiliza siempre guantes dobles, usar gafas protectoras y trabajar en una campana de humos químicos.
  13. Mezclar bien invirtiendo el tubo por 5 min en un agitador de tubo a 4 ° C.
  14. Centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C.
  15. Retirar la fase acuosa (capa superior) a un nuevo tubo con una pipeta serológica de vidrio.
  16. Repita la extracción de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico 1 a 3 veces hasta que la fase acuosa es claro y la interfaz no es turbia.
  17. Agregar acetato de sodio 1/10 volumen (200-400 μL) de 3 M pH 5.2.
  18. Agregue 2.5 volumen (5-10 mL) 100% de etanol (frío) e invertir el tubo suavemente a mano durante 2-3 minutos.
  19. Carrete el ADN con un gancho de vidrio y transferir a un tubo nuevo con 1 – 5 mL 70% etanol y lave bien. Por otra parte, centrifugar el tubo a alta velocidad (3.500 x g) a 4 ° C de la pelotilla de la DNA y lavar completamente con 1 – 5 mL 70% etanol.
  20. Centrifugar el tubo a alta velocidad (3.500 x g) a temperatura ambiente, retirar el sobrenadante y secar el ADN durante 10-15 minutos.
  21. Disolver el ADN en 10 – 100 μl de tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) y almacenar a 4 ° C (para el almacenaje corto de un mes) o a-20 ° C (para el período de almacenamiento de información). La concentración óptima de ADN para el análisis de selección cII λ es 0,5 – 1,0 μg/μl (en tampón TE)56.

2. la reacción in Vitro envases

  1. Por una reacción de empaquetado, añadir ~ 5 μg de ADN genómico (volumen final: 8 – 12 μl de ADN genómico fue aislado en la sección 1 del ratón embrionario fibroblastos tratados en vitro con una sustancia de ensayo o control) a un tubo de microcentrífuga con el primero mezcla de reacción (~ 10 μl).
    Nota: Preparado en casa o comercialmente disponible λ empaquetado extractos se usan en diferentes laboratorios. En el embalaje comercial kit de extracto utilizado aquí56 (véase la Tabla de materiales), tubos rojo figuran la primera mezcla de reacción (~ 10 μl) y tubos de azul la segunda mezcla de reacción (~ 70 μl para las reacciones de al menos 5).
  2. Incubar el tubo durante 90 minutos a 30 ° C.
  3. Añadir el volumen requerido (~ 12 μL) de la segunda mezcla de reacción en el tubo.
  4. Incubar el tubo durante un adicional 90 minutos a 30 ° C.
  5. Añadir 1,1 mL de tampón SM al tubo.
    Nota: 1 mL de esta solución (es decir, mezcla de la reacción de empaquetado) se utilizará para la detección del λ cII-mutantes. El resto se utilizará para titering.
    1. Preparar el tampón SM mezclando 5,8 g de NaCl, 2,0 g de MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) y 5 mL 2% (w/v) de gelatina. Añadir dH2O a un volumen final de 1 litro, autoclave por 30 min tienda a temperatura ambiente hasta por 1 año.
  6. Vórtice el tubo que contiene la muestra de ADN empaquetada para 10 s en RT (Vortex vigoroso).
  7. Pulso girar el tubo en una microcentrífuga y tienda en hielo hasta que esté listo para usar. Si la muestra no va a ser usado el mismo día de envasado, añada 50 μl de cloroformo de ADN empaquetado por mL de la muestra, vortex y almacenar a 4 ° C hasta por 2 semanas.

3. preparación del cultivo bacteriano de e. coli G1250

  1. Por lo menos dos días antes de la galjanoplastia, hacer unas placas de raya bacteriana de Escherichia coli (e. coli) G1250 en placas de agar kanamicina TB1.
    1. Preparar placas de agar kanamicina TB1 como sigue. Mezclar el agar NaCl 10,0 g peptona de caseína y 12,0 g 5,0 g. Agregar clorhidrato de tiamina de 800 mL dH2O. Añadir 1 mL de 0,1%. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH o HCl. agregar dH2O hasta un volumen final de 1 litro.
    2. Mezclar bien y autoclave durante 30 minutos dejar enfriar a 55 ° C. Añadir 50,0 mg kanamicina y mezclar. Vierta en platos de petri de 100 mm estériles (20 – 25 mL por caja). Almacenar las placas a 4 ° C hasta por dos semanas.
  2. Incubar las placas bacterianas racha en una incubadora estacionaria 30 ° C durante al menos 24 h.
  3. Un día antes de la galjanoplastia, combinar 10 mL de medio líquido TB1 con 100 μl de solución al 20% (w/v) maltosa 1 M MgSO4 en un tubo cónico estéril 50 mL tapa a rosca.
    1. Preparación de medio líquido TB1 como sigue. Mezcla 5.0g NaCl peptona de caseína 10,0 g, añadir 800 mL dH2O, clorhidrato de tiamina de 0.1% 1 mL y ajustar el pH a 7.0 con NaOH o HCl. DH2O agregar a un volumen final de 1 litro, mezcla bien y autoclave por 30 min almacenan el medio a temperatura ambiente hasta por tres meses.
    2. Preparar como sigue 20% (p/v) de maltosa 1 M MgSO4 . Mezcla de 20,0 g maltosa y 24,6 g de MgSO4. 7H2O, luego añadir dH2O a un volumen final de 100 mL. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C hasta por 6 meses.
  4. Inocular el medio líquido con varias colonias de la placa bacteriana racha utilizando un bucle inoculación estéril56.
  5. Incubar el cultivo líquido durante la noche en a 30 ° C agitando la incubadora con agitación vigorosa (250 – 300 rpm).
  6. En el día de la galjanoplastia, centrifugar el tubo cónico que contiene el cultivo líquido G1250 a 1.500 x g por 10 min a temperatura ambiente para que sedimenten las células bacterianas.
  7. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 10 mL de 10 mM de MgSO4.
  8. Medir la absorbancia de un 1:10 dilución de la suspensión celular en longitud de onda 600 nm utilizando un UV-Vis espectrofotómetro (p. ej., 100 μl célula suspensión + 900 μl 10 mM MgSO4)56.
  9. Diluir la suspensión celular a un final de OD600 0.5 con 10 mM MgSO4. La suspensión preparada de G1250 e. coli con OD600 = 0.5 se conoce como 'la cultura de la galjanoplastia de G1250'.
  10. Almacene la cultura de la galjanoplastia G1250 en hielo y use dentro de 1-2 h.

4. las muestras de ADN empaquetada de la galjanoplastia

  1. Por una muestra de ADN empaquetada, preparar dieciséis tubos de fondo redondo de2 estériles 14 x 100 mm y dieciséis placas de agar TB1. Diez de cada sistema se utilizará para investigación y seis para titering (tres por título 20) y tres de título 100.
    1. Preparar placas de agar TB1 como sigue. Mezcla 5.0g NaCl y peptona de caseína 10,0 g 12,0 g Agar, añaden 800 mL dH2O y el clorhidrato de tiamina de 0.1% 1 mL. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH o HCl y añadir dH2O a un volumen final de 1 L.
    2. Mezclar bien y autoclave durante 30 minutos deje que la mezcla se enfríe a 55 ° C, luego verter en placas de Petri estériles de 100 mm (20 – 25 mL por caja). Almacenar las placas a 4 ° C hasta por dos semanas.
      Nota: Las placas de agar TB1 deben estar preparadas por lo menos 24 horas antes de su uso.
  2. Alícuotas de 200 μL de la cultura de la galjanoplastia G1250 en cada tubo de fondo redondo.
  3. Para titering, hacer una dilución 1: 100 de la muestra de ADN empaquetada y mezclar bien todo con un vórtex (es decir, 10 μl empacados muestra de ADN + 990 μl de tampón de SM).
  4. Añadir 20 μl de la dilución 1: 100 a cada uno de los tres tubos del título 20.
  5. Añadir 100 μl de la dilución 1: 100 a cada uno de los tres tubos de título 100.
  6. Para la detección, añada 100 μl de la 'sin diluir ' empacada muestra de ADN a cada uno de los tubos de la proyección de diez.
  7. Procesar todos los titering y proyección de tubos (tubos de 2 x 3 + 10 = 16), como sigue: mezclar bien todo con un vórtex para aproximadamente 10 s y luego incubar a temperatura ambiente durante 30 min permitir que el host de e. coli para los phages.
  8. Añadir 2,5 mL microondas TB1 fundido top agar (enfriado a 55 ° C) para cada título o proyección tubo, mezclar inmediatamente con un vórtex (suavemente), y verter en el título correspondiente o proyección de las placas de agar TB1.
    1. Preparar el agar superior TB1 como sigue. Mezcla 5.0g NaCl y peptona de caseína 10,0 g 7,0 g Agar, agregar clorhidrato de tiamina de 800 mL dH2O. Añadir 1 mL de 0,1% continuación, ajustan el pH a 7.0 con NaOH o HCl. Por último, añadir dH2O a un volumen final de 1 litro.
    2. Mezclar bien y autoclave durante 20 – 25 minutos tienda a temperatura ambiente hasta por tres meses.
    3. Antes de usar, fundir el agar superior preparado de TB1 en el microondas, mezclar bien y dejar para enfriar a 55 ° C en un baño de agua.
      Nota: La tapa de TB1 fundida y enfriada se agrega a los contenidos de cada título o tubo de proyección y después de la mezcla, se vierte en el título correspondiente o las placas de agar screening TB1.
  9. Dejar las placas reposar 15-30 min a temperatura ambiente, con la tapa entreabierta para evitar la condensación.
  10. Invertir las placas y las placas de diez cribado en una incubadora estacionaria 24 ° C e incube durante 46 – 48 h (es decir, condiciones selectivas) y las seis placas de título en una incubadora estacionaria 37 ° C e incubar durante 24 h/durante la noche (es decir, condiciones no selectivo).
    Nota: Para aseguramiento de la calidad y estandarización de resultados, soluciones de control disponibles en el mercado de fago que contiene una mezcla de tipo salvaje y mutante cII con frecuencia de mutantes conocido son plateadas junto a las muestras de ADN empaquetadas e incluye en todos los ensayo funciona56.

5. examinar el título y las placas de cribado para determinar la cII frecuencia mutante

  1. Después de las 24 h/noche incubación a 37 ° C, cuenta el número de placas formadas en cada una de las tres placas de 20 título y título 100 placas. Para identificar más fácilmente las placas, sujetan la placa al lado de una caja de luz blanca y sobre un fondo oscuro con la tapa quitada (ver figura 2).
  2. Haga un promedio (media) del número de placas contado en cada juego de placas de 20 título y título 100 placas (triplicadas, cada uno).
  3. Seleccione el número promedio en el conjunto de placas título que cae más cercano al rango de 50 – 200 placas por placa.
  4. Calcular el número total de placas proyectadas en las placas de diez cribado como sigue:
    Total placas proyectadas = (media del número de placas en el conjunto elegido de título placas ÷ número de μl de la dilución utilizada por placa título elegido) x factor de dilución x número de μl de la muestra de ADN empaquetado por detección placa [100 μl/placa] x número de detección placas [10].
    Nota: por ejemplo, si el número de placas por placa en el conjunto de placas de 20 título es 128 y el número correspondiente en el conjunto de título 100 placas 478, el número 128 se utilizará para el cálculo del número total de placas proyectadas , como sigue:
    (128 ÷ 20) x 100 [factor de dilución] x 100 [μl/placa] x 10 [placas] = 640.000
    Esto es equivalente a multiplicar al número de placas por 5.000 o 1000, si el promedio se basa en recuentos de placas de 20 título o título 100 placas, respectivamente.
  5. Después de 46 – 48 h de incubación a 24 ° C, contar el número total de placas formadas en las placas de diez cribado (siga las instrucciones en la sección 5.1).
    Nota: La frecuencia de mutantes cII se calcula dividiendo el número total de placas formadas en las placas de cribado por el número total de placas proyectadas. Utilizando el ejemplo anterior, si el número total de placas contadas en las placas de diez cribado es 112, la frecuencia de mutantes de cII para esta muestra de ADN sería 112 ÷ 640.000 = 17.5 x 10-5.

6. verificación de la Putative λ cII mutantes, amplificación por PCR y secuenciación de ADN

  1. La placa en cuestión con una punta de la pipeta estéril, ancha de base y expulsar (transfiriendo hacia arriba y hacia abajo) en un tubo de microcentrífuga estéril que contiene 500 μl de tampón estéril de SM.
  2. Incubar durante al menos 2 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche, para permitir que las partículas de fago a eluir del agar enchufe.
  3. En un tubo de fondo redondo de2 mm de 14 x 100 estéril, mezclar 200 μL de la cultura de la galjanoplastia G1250 con 1 μl de la solución núcleo de fago e incubar por 30 min a TA.
  4. Placa de la muestra con 2,5 mL de agar superior de 55 ° C fundido de TB1 e incubar la placa a 24 ° C 46 – 48 h (condiciones selectivas), como se describe en las secciones 4.8, 4.10.
  5. Una vez que han formado las placas secundarias, utilice una punta de pipeta para escoger cuidadosamente un solo λ verificado bien aislada cII-placa mutante (evitar tocar el agar inferior).
    Nota: Replating las placas mutante putativo cII sirve dos propósitos: (i) artefactos de la galjanoplastia puede a veces confundirse con pequeñas placas; y (ii) un núcleo de la agarosa de una placa de proyección puede contener no-mutante phage(s) junto con un mutante fago. Placas secundarias de una baja densidad replating proporcionará una plantilla mutante incontaminada por PCR y posterior análisis de la secuencia del ADN.
  6. Transferir la placa a un tubo de microcentrífuga con 25 μl de agua destilada doble mediante pipeteo arriba y abajo.
  7. Coloque el tubo en agua hirviendo durante 5 minutos.
  8. Centrifugar a velocidad máxima (18.000 x g) durante 3 minutos a TA.
  9. Transferir inmediatamente el 10 μl del sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga con 40 μl de una mastermix PCR en la que las concentraciones finales de los reactivos son 1 x Taq PCR buffer, 10 pmol cada uno de los iniciadores de avance y retroceso, 12.5 nmol de cada dNTP y 2.5 U de Taq ADN polimerasa.
    Nota: Los iniciadores e inversas son las siguientes: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (posiciones -68 a -50 en relación con la cII comienzo codon) y 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (posiciones +345 a +365 en relación con el codón de inicio del cII ), respectivamente.
  10. Ampliar la plantilla utilizando los siguientes parámetros de ciclismo: una 3 min de desnaturalización a 95 ° C, seguido de 30 ciclos de 30 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C y 1 min a 72 ° C, con una extensión final de 10 min a 72 ° C.
  11. Purificar el producto PCR bp 432 que contiene el gen de la cII y flanqueando las regiones usando kits de purificación de PCR disponibles en el mercado, según las instrucciones del fabricante.
  12. Realizar la secuencia de la DNA usando una plataforma de secuenciación adecuados y analizar las secuencias de ADN resultantes para detectar mutaciones en el transgén de la cII (véase la nota de abajo).
    Nota: Esto es mejor logra alineación con la secuencia de la cII de referencia utilizando el software, como el servidor de alineamiento de secuencia T-café basada en web. Para obtener instrucciones sobre cómo utilizar el programa, visite: http://tcoffee.crg.cat/

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Representative Results

Dependiendo de la distribución de los datos, se utilizan pruebas paramétricas o no paramétricas para determinar la significancia de la diferencia en la frecuencia de mutantes cII entre los grupos tratamiento y control (es decir, inducido versus frecuencias de mutante espontáneas) . Comparación de las frecuencias de mutante inducida por cII en los grupos de tratamiento diferentes es hecha por varios (pares) pruebas estadísticas, según sea el caso. La prueba hipergeométrica de Adams y Skopek comúnmente se utiliza para comparar los espectros mutación inducida y espontánea total57, aunque otras pruebas, como la prueba χ2 o análisis de varianza (ANOVA), también pueden utilizarse para comparar la frecuencia de de cada tipo específico de mutación (p. ej., transición, transversión, inserción o eliminación) entre los espectros de mutación inducida - y control, o entre varios espectros de mutación inducidos por agentes de productos químicos diferentes o diferentes dosis del mismo químico/agente.

Figura 3 es una recopilación de los datos de frecuencia de mutantes de estudios publicados que hemos demostrado que el grado de aumento en la frecuencia de mutantes de relativa cII en fibroblastos embrionarios de ratón tratados con diversos productos químicos o physicalagents puede variar desde unos pocos-a varios centuplicado, los mutágenos 'potencia' de la sustancia de ensayo. Doblez-aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia de mutantes cII se demuestran para los fibroblastos embrionarios de ratón tratados con acrilamida12glycidamide14aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifeno18, Ácido δ-aminolevulínico (δ-ALA) y ultravioletas de baja dosis A la luz (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo (a) pireno diol epoxide(B(a)PDE)19y equilethal dosis de rayos UVA, UVB (λ = 2 nm de 80−320) y simula la luz solar ultravioleta (SSL) 21 (véase Figura 3).

Figura 4 es una demostración de la secuencia de especificidad de las mutaciones en las que hemos demostrado la inducción de determinados tipos de mutación en el transgen de la cII en mouseembryonicfibroblasts irradiado con UVBrelativetocontrol23. El espectro de la mutación inducida por UVB se caracteriza por un aumento significativo en la frecuencia relativa de simple o tándem transiciones C→T en dinucleótidos de pirimidina.

Figure 1
Figura 1: Presentación esquemática de la prueba de selección cII λ. El análisis se basa en la recuperación de los vectores de transporte λLIZ, que contiene el transgén cII como un gen reportero mutacional, desde el ADN genómico de células cultivadas de roedores transgénicos tratados en vitro con un compuesto de prueba o tejidos/órganos de los animales correspondientes tratado en vivo con el agente químico prueba (A y B). Los vectores rescatados se empaquetan en cabezas de fago λ que pueden infectar a un huésped apropiado e. coli (C y D). Las bacterias infectadas luego se cultivan en condiciones selectivas para permitir puntuación y análisis de mutaciones en el cII transgen1,2,3,25, 52 (E). Determinación de la frecuencia de mutantes inducida por cII y el establecimiento del espectro de mutación por secuenciación de ADN se contornean en F y G. Los espectros de mutación inducida y espontánea se visualizan en diferentes formatos. Para fines de Ilustración, hemos destacado un formato en el cual las mutaciones inducida por cII se escriben encima de la secuencia de referencia, mientras que las mutaciones espontáneas (control) se escriben a continuación de la secuencia de la referencia (H). La altura de una base transformada representa su frecuencia de mutaciones (es decir, cuanto mayor sea la base, el más frecuentemente mutadas). Números sobre una base mutada indican el porcentaje de frecuencia de mutaciones en esa base. Bases eliminados están subrayados. Bases insertadas aparecen con una flecha. Números a continuación están las bases de referencia las posiciones del nucleótido. Los datos proceden de un estudio publicado23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: recuento de placas en las placas título. Para identificar más fácilmente las placas, las placas se llevan a cabo junto a una caja de luz blanca y sobre un fondo oscuro con tapas de quita. Título 20 (A) y título 100 placa (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Frecuencias de mutante del transgén cII en fibroblastos embrionarios de ratón trataron con diferentes sustancias químicas o agentes físicos en comparación con controles. Los datos proceden de estudios publicados sobre acrilamida12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifeno18, ácido δ-aminolevulínico (δ-ALA) y bajas dosis ultravioleta A luz (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo(a) pyrenediol epoxi (B(a)PDE)19y equilethal dosis de rayos UVA, UVB (λ = 280−320 nm) y simula la luz solar ultravioleta (SSL)21. Para metabolizar eficientemente el tamoxifeno en células de fibroblastos embrionarios de ratón, hemos utilizado el sistema de la S9-activación (mezcla S9) consisten en preparaciones de hígado de rata inducida por Aroclor 1.254 y cofactor reactivos22. Todas las diferencias entre trataron- y muestras de control son estadísticamente significativas a p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Espectro de mutación del transgén cII en fibroblastos embrionarios de ratón irradiado con UVB en relación con el control de. Los datos proceden de un estudio publicado23. Las contrapartes de espejo de filamento de todas las transiciones (por ejemplo, G→A y C→T) y transversions (p. ej., G→T y C→A o G→C y C→G) se combinan. Ins: inserción; Del: deleción. El espectro de la mutación inducida por UVB se caracteriza por un aumento significativo en la frecuencia relativa de simple o tándem transiciones C→T en dinucleótidos de pirimidina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El ensayo Select cII λ se utiliza para la detección de mutaciones en el transgén de la cII de ADN genómico de células derivadas de órganos/tejidos de roedores de BB3. El genoma de estos animales transgénicos contiene múltiples copias de tándem del vector lanzadera λLIZ cromosómico integrado, que lleva la cII (294 bp) y lacI (1.080 bp) los transgenes, como el reportero mutacional de genes1, 2 , 25. el ensayo Select cII λ se basa en la recuperación de los vectores de transporte λLIZ de ADN genómico de células/tejidos de los animales transgénicos, seguidos por el envasado de los vectores rescatados en cabezas de fago λ que pueden infectar a un huésped apropiado E. coli. Posteriormente, se cultivan las bacterias infectadas bajo condiciones selectivo para permitir puntuación y análisis de mutaciones en el transgén de la cII (ver figura 1)1,3. El ensayo Select cII λ se ha utilizado ampliamente para las pruebas de mutagenicidad de una amplia gama de productos químicos o agentes físicos (revisados en las referencias2,49). El ensayo se ha aplicado con éxito a rata Ratón transgénico celular culturas tratadas en vitro con diversos productos químicos o agentes físicos, y los tejidos/órganos de los animales correspondientes tratados en vivo con diferentes productos químicos o agentes4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

El ensayo Select cII λ en cultivos de células de roedores transgénicos tratados con un test compuesto representa, en muchos sentidos, una alternativa viable para experimentos en vivo de mutagenicidad en los correspondientes animales tratados con el producto químico/agente probado 3. como regla general, los modelos en vitro ofrecen importantes ventajas sobre sus contrapartes en vivo modelos animales, ya que son mucho menos mano de obra intensiva y costosa, requiere mucho menos tiempo para ser completado y lo más importante, no implican el uso directo de los animales2,50,52. Al mismo tiempo, los modelos en vitro totalmente no pueden recapitular todos los aspectos de mutagénesis debido a diferencias en las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de las sustancias químicas entre las células cultivadas en vitro y animales de experimentación en vivo 2 , 3. por ejemplo, productos químicos, cuya vía de exposición es la inhalación (por ejemplo, vapor cigarrillo electrónico o humo de cigarrillo) sólo se pueden hacer susceptibles en vitro en cultivos celulares de prueba después de que se convierten de gaseosa o de vapor formularios para líquido o condensación, que complica su farmacocinética. También, un incompleto o ausente capacidad metabólica de las células cultivadas en vitro para convertir ciertos productos químicos en especies reactivas con el ADN no puede representar daño de la DNA conducido mutagenicidad en animales expuestos en vivo a los productos químicos genotóxicos2 ,3. Aunque este inconveniente puede compensarse, a los diferentes grados, por la adición de una activación metabólica externa sistema (es decir, mezcla S9) a la en vitro de la célula cultura modelos22.

Además, la replicación de exposición humana de vida real a los agentes químicos genotóxicos es más limitada en vitro de la célula cultura modelos que con animales de experimentación en vivo3. Generalmente, los seres humanos están expuestos a una dosis crónica de agentes genotóxicos en un lapso de varios años en unas pocas décadas76,77,78. La vida finita de las células en cultivo, en comparación con el relativamente mayor duración de los roedores (es decir, días o semanas frente a un par de años) hace de modelado de exposición humana a los genotoxins más desafiante en los modelos ex2, 3. Sin embargo, análisis de mutagenicidad en vitro modelos de cultura de célula puede proporcionar una indicación inicial del potencial genotóxico de un determinado producto químico y agente y los resultados pueden usarse como guía para el diseño de experimentos 'refinado' en vivo que cuentan con un número 'reducido' de animales2,3.

En conclusión, el ensayo Select cII λ en cultivos de células de roedores transgénicos tratados con una sustancia de ensayo, o los correspondientes animales tratados con el agente químico probado, es un enfoque valioso para las pruebas de mutagenicidad. Con éxito hemos utilizado el enfoque, ya que tienen otros grupos de investigación en todo el mundo4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24,34,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67,68,69, 70,71,72,73,74,75. Más recientemente, hemos ampliado las aplicaciones de este enfoque mediante el desarrollo de una nueva técnica en la que una modificación del ensayo Select cII λ junto con secuenciación de próxima generación permite alto rendimiento análisis de mutaciones en un tiempo-, coste-, y forma de trabajo eficaz23.

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Disclosures

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Acknowledgments

Nos gustaría reconocer la contribución de todos los colegas y colaboradores para nuestros estudios originales, cuyos resultados se han descrito en este manuscrito (con fines ilustrativos). Trabajo de los autores es apoyado por becas del Instituto Nacional de odontología e investigación craneofacial de los institutos nacionales de salud (1R01DE026043) AB y de la Universidad de California Tobacco-Related programa de investigación de la enfermedad para () AB TRDRP-26IR-0015) y ST (TRDRP-25IP-0001). Los patrocinadores del estudio no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos, análisis de datos, interpretación de datos, escritura del informe, o en la decisión de enviar para su publicación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

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