Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Lambda Velg cII mutasjon Detection System

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Vi beskriver en detaljert protokoll for Lambda Velg cII mutasjon analysen i kulturperler celler av transgene gnagere eller tilsvarende dyr behandlet med en kjemisk/fysisk agent av interesse. Denne tilnærmingen har vært mye brukt for genetisk virkning testing av kreftfremkallende faktorer i pattedyrceller.

Abstract

Transgene dyremodeller og mutasjon detection system har blitt utviklet for genetisk virkning testing av kreftfremkallende faktorer i pattedyrceller. Av disse har transgene mus og den Lambda (λ) Velg cII mutasjon Detection System vært ansatt for genetisk virkning eksperimenter av mange forskningsgrupper over hele verden. Her beskriver vi en detaljert protokoll for Lambda Velg cII mutasjon analysen, som kan brukes til kulturperler celler av transgene mus/rotter eller tilsvarende dyr behandlet med en kjemisk/fysisk agent av interesse. Protokollen består av følgende: (1) isolering av genomisk DNA fra cellene eller organer/vev av transgene dyr behandlet i vitro eller i vivo, henholdsvis med en test sammensatt; (2) gjenoppretting av lambda shuttle vektoren bærer et mutational reporter gen (dvs., cII transgene) fra genomisk DNA; (3) emballasje av reddet vektorer i smittsomme bacteriophages; (4) infisere en vert bakterier og dyrking under selektiv forhold som tillater overføring av indusert cII mutasjoner; og (5) scoring cII-mutanter og DNA sekvens analyser for å avgjøre cII mutant frekvens og mutasjon spektrum, henholdsvis.

Introduction

Et bredt spekter av transgene dyremodeller og mutasjon detection system har blitt utviklet for genetisk virkning testing av kreftfremkallende faktorer i pattedyrceller. Av disse har transgene Big Blue (referert til heretter som BB) mus og den λ Velg cII mutasjon Detection System vært ansatt for genetisk virkning eksperimenter av denne gruppen og mange andre forskning grupper over hele verden1,2, 3,4,5,6,7,8,9. For de siste 16 årene, vi har undersøkt mutagene effekten av ulike kjemiske og/eller fysiske midler å bruke disse transgene dyr eller deres tilsvarende embryonale fibroblast cellekulturer behandlet med en test sammensatt, og deretter analysert de fenotypen og genotype av cII transgene λ Velg cII analysen og DNA sekvensering, henholdsvis10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. genomet av disse transgene dyrene inneholder en bacteriophage λ transport vektor (λLIZ) integrert på Kromosom 4 som en multi kopi hode til hale concatemer1,2,25. ΛLIZ transport vektoren bærer to mutational reporter gener, nemlig de lacI og cII effekter av transgener1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Velg cII analysen er basert på utvinning av λLIZ transport vektorer fra genomisk DNA av cellene stammer fra organer/vev av transgene dyr1,2,25 . Gjenopprettede λLIZ transport vektorer er deretter pakket inn i λ phage hoder kan infisere en indikator vert Escherichia coli. Deretter er infiserte bakterier dyrket under selektiv forhold for scoring og analyse av mutasjoner i cII transgene1,3.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for λ Velg cII analysen, som består av isolering av genomisk DNA fra celler/organer av transgene dyr behandlet i vitro/i vivo med en test sammensatte, henting av λLIZ flybuss vektorer fra genomisk DNA, pakking av vektorer i smittsomme λ phages, infeksjon av verten E. coli med bacteriophages, identifikasjon av cII-mutanter under selektiv forhold å bestemme cII mutant frekvensen, og DNA sekvens analyse å etablere cII mutasjon spekteret. Protokollen kan brukes på transgene mus/rotte celle kulturer behandlet i vitro med en kjemisk/fysisk agent av interesse, eller vev/organer av tilsvarende dyrene behandles i vivo med test kjemiske/agent1, 2,4,48,49,50,51,52. En skjematisk fremstilling av λ Velg cII analysen er vist i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. genomisk DNA isolert fra mus embryonale fibroblaster

Merk: Primære mus embryonale fibroblaster er isolert fra embryo avledet fra BB transgene mus med C57BL/6 genetisk bakgrunn, ifølge publiserte protokollen53. Den starte materialet for denne protokollen består av 1 x 106 til 1 x 107 embryonale fibroblast cellene behandlet med en test sammensatte versus kontroll. Høsting og telling av disse cellene med standard metoder er beskrevet i referanser10,54,55.

  1. Forberede buffer en (0,3 M sukrose, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,5 mM spermidine, 0.15 mM spermine og 2 mM EDTA), buffer B (150 mM NaCl og 5 mM EDTA, pH 7,8) og buffer C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 20 mM NaCl 20 mM EDTA og 1% SDS) i forveien og bevare ved romtemperatur (RT) for opptil ett år54,55.
  2. Resuspend celler i 2-4 mL buffer A i en 15 mL konisk sentrifuge tube av gjentatte ganger pipettering opp og ned ved hjelp av en bar 1000 µL pipette tips.
  3. Legge ett volum (2-4 mL) buffer A inneholder 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (f.eksNonidet P40) ved hjelp av en glass serologisk pipette.
  4. Inkuber røret på is 5 min.
  5. Sentrifuge røret på 1000 x g i 5 min på RT.
  6. Forkaste nedbryting og vask pellets med 10-15 mL buffer en ved hjelp av en glass serologisk pipette.
  7. Resuspend pellet i 2-4 mL buffer B.
  8. Legge ett volum (2-4 mL) buffer C inneholder 600 µg/mL proteinasen K.
  9. Inkuber røret for 3t på 37 ° C.
  10. Legge til RNase A en siste konsentrasjon 100 µg/ml.
  11. Inkuber røret for en ekstra 1 h på 37 ° C.
  12. Legge ett volum (2-4 mL) fenol (mettet i 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl alkohol (25:24:1 vol/vol).
    Merk: Fenol kan utgjøre en alvorlig helsefare og må behandles med ekstrem forsiktighet. Fenol er svært skadelig for huden og lett absorberes gjennom det, og viser andre effekter. Når håndtere fenol, alltid bruke doble gloving, ha beskyttende eyewear og innarbeide kjemiske avtrekksvifte.
  13. Bland godt invertere røret i 5 min på et rør rotator på 4 ° C.
  14. Sentrifuge røret på 1000 x g i 5 min på 4 ° C.
  15. Fjern den vandige fasen (øverste laget) til en ny tube ved hjelp av en glass serologisk pipette.
  16. Gjenta fenol: kloroform: isoamyl alkohol utvinning 1 til 3 ganger før den vandige fasen er klart og grensesnittet er ikke lenger grumset.
  17. Legg til 1/10 volum (200-400 µL) 3M natrium acetate, pH 5.2.
  18. Legg til 2,5 volum (5-10 mL) 100% etanol (kjølt) og invertere røret forsiktig hånd for 2-3 minutter.
  19. Spole DNA med et glass krok og overføre den til en ny tube som inneholder 1 – 5 mL 70% etanol og vaske det grundig. Alternativt sentrifuge røret i høy hastighet (3500 x g) på 4 ° C pellets DNA og vaske det godt med 1 – 5 mL 70% etanol.
  20. Sentrifuge røret i høy hastighet (3500 x g) på RT, fjerne nedbryting og air-dry DNA for 10-15 min.
  21. Oppløse DNA i 10-100 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), og lagre på 4 ° C (for kort lagring på opptil en måned) eller på 20 ° C (for lengre lagringsperiode). Optimal konsentrasjon for DNA for λ Velg cII analysen er 0,5-1.0 µg/µL (i TE buffer)56.

2. i Vitro emballasje reaksjon

  1. Per en emballasje reaksjon, legge ~ 5 µg genomisk DNA (siste volum: 8-12 µL, genomisk DNA ble isolert i del 1 fra mus embryonale fibroblaster behandlet i vitro med en test sammensatte eller kontroll) slik microcentrifuge som inneholder først Reaksjonen blanding (~ 10 µL).
    Merk: Forberedt internt eller kommersielt tilgjengelig λ emballasje ekstrakter brukes i ulike laboratorier. I kommersielle emballasjen ekstrakt kit brukes her56 (se Tabell for materiale), røde rør inneholdt første reaksjonen blanding (~ 10 µL) og blå rør finnes andre reaksjonen blanding (~ 70 µL for minst 5 reaksjoner).
  2. Inkuber røret for 90 min på 30 ° C.
  3. Legge til et bestemt volum (~ 12 µL) av andre reaksjonen blanding til røret.
  4. Inkuber røret for en ekstra 90 minutter på 30 ° C.
  5. Legge til 1.1 mL SM bufferen røret.
    Merk: 1 mL av denne løsningen (dvs., emballasje reaksjonsblandingen) vil bli brukt for screening λ cII-mutanter. Resten skal brukes for titering.
    1. Forberede SM bufferen ved å blande 5,8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7.5) og 5 mL 2% (w/v) gelatin. Legg dH2O til en endelig mengde 1 liter, autoklav for 30 min. butikken ved romtemperatur for inntil 1 år.
  6. Vortex tube som inneholder den pakkede DNA-prøven for 10 s på RT (energisk vortexing).
  7. Puls spinne røret i en microcentrifuge og lager på is inntil klar til bruk. Hvis prøven ikke skal brukes på samme dag av emballasje, legge til 50 µL av kloroform per mL pakket DNA prøver, vortex forsiktig, og lagre på 4 ° C 2 uker.

3. forberedelser E. coli G1250 bakteriell kultur

  1. Minst to dager før plating, gjør noen bakteriell strek plater fra Escherichia coli (E. coli) G1250 på TB1-kanamycin agar plater.
    1. Forberede TB1-kanamycin agar plater som følger. Bland 5.0 g NaCl, 10,0 g kasein pepton og 12,0 g agar. Legge til 800 mL dH2O. legge 1 mL 0,1% Thiamin hydrochloride. Justere pH 7.0 med NaOH eller HCl. Legg dH2O til en endelig mengde 1 liter.
    2. Bland godt og autoklav for 30 min. Tillat avkjøles til 55 ° C. Legg 50.0 mg Kanamycin og bland. Hell i sterilt 100 mm petri retter (20-25 mL per fat). Lagre plater på 4 ° C i opptil to uker.
  2. Inkuber bakteriell strek platene i en stillestående 30 ° C inkubator for minst 24 timer.
  3. En dag før plating, Kombiner 10 mL TB1 flytende medium med 100 µL av 20% (w/v) maltose-1 M MgSO4 løsning i et sterilt 50 mL skruen-cap konisk rør.
    1. Forberede TB1 flytende medium som følger. Mix 5.0 g NaCl 10,0 g kasein pepton legge til 800 mL dH2O, 1 mL 0,1% Thiamin hydrochloride, og justere pH 7.0 med NaOH eller HCl. Deretter legge dH2O til en endelig mengde 1 liter, bland godt og autoklav for 30 min. lagre middels på RT i opptil tre måneder.
    2. Forberede 20% (w/v) Maltose-1 M MgSO4 som følger. Bland 20.0 g Maltose og 24,6 g MgSO4. 7H2O, deretter legge dH2O til en endelig volum 100 mL. Filteret sterilisere og lagre på 4 ° C for inntil 6 måneder.
  4. Vaksinere flytende medium med flere kolonier fra bakteriell strek platen bruker et sterilt inoculating loop56.
  5. Inkuber flytende kulturen overnatter i en 30 ° C risting inkubator med kraftig risting (250-300 rpm).
  6. Ved plating, sentrifuge konisk røret som inneholder G1250 flytende kulturen 1500 x g i 10 min på RT til pellets bakterieceller.
  7. Forkast nedbryting og resuspend celle pellet i 10 mL 10 mm MgSO4.
  8. Måle absorbansen av en 1:10 fortynning av cellen suspensjon på bølgelengde 600 nm ved hjelp av en UV-Vis spektrofotometer (f.eks, 100 µL celle suspensjon + 900 µL 10 mM MgSO4)56.
  9. Fortynne celle suspensjon en siste OD600 på 0,5 med 10 mM MgSO4. Forberedt suspensjon av G1250 E. coli med OD600 = 0,5 kalles "G1250 plating kultur".
  10. Lagre G1250 plating kulturen på is og bruk innen 1-2 timer.

4. plating pakket DNA-prøvene

  1. Per en pakket DNA-prøve, forberede seksten sterilt 14 x 100 mm2 runde bunn rør og seksten TB1 agar plater. Ti fra hvert sett brukes for screening og seks for titering (tre for Titer 20) og tre Titer 100.
    1. Forberede TB1 agar plater som følger. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kasein pepton og 12,0 g Agar, deretter legge til 800 mL dH2O og 1 mL 0,1% Thiamin hydrochloride. Justere pH 7.0 med NaOH eller HCl, og legge dH2O til en endelig mengde 1 L.
    2. Bland godt og autoklav for 30 min. la blandingen avkjøle til 55 ° C, og hell den i sterilt 100 mm Petri retter (20-25 mL per fat). Lagre platene på 4 ° C i opptil to uker.
      Merk: TB1 agar plater bør være forberedt minst 24 timer før bruk.
  2. Aliquot 200 µL av G1250 plating kultur i hver runde bunn rør.
  3. For titering, lage en 1: 100 fortynning av den pakkede DNA-prøven og bland godt vortexing (dvs., 10 µL pakket DNA-prøve + 990 µL SM buffer).
  4. Legge til 20 µL av 1: 100 fortynning i hver av de tre Titer 20 rørene.
  5. Legge til 100 µL av 1: 100 fortynning i hver av de tre Titer 100 rørene.
  6. For screening, legge 100 µL av det 'ufortynnet ' pakket DNA-prøve hver av de ti screening rørene.
  7. Behandle alle titering og screening rør (2 x 3 + 10 = 16 rør), som følger: Bland godt vortexing for ca 10 s, og deretter Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter til lar verten E. coli til adsorberes i phages.
  8. Legge til 2,5 mL mikrobølgeovn smeltet TB1 topp agar (kjølt ned til 55 ° C) til hver titer eller screening tube, bland umiddelbart ved vortexing (forsiktig), og helle i den aktuelle titer eller screening TB1 agar plater.
    1. Forberede TB1 topp agar som følger. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kasein pepton og 7.0 g Agar, deretter legge 800 mL dH2O. legge 1 mL 0,1% Thiamin hydrochloride, så justere pH 7.0 med NaOH eller HCl. Til slutt Legg dH2O til en endelig mengde 1 liter.
    2. Bland godt og autoklav i 20-25 min. butikken ved romtemperatur for inntil tre måneder.
    3. Før bruk, smelte forberedt TB1 topp agar i mikrobølgeovn, bland godt og la den avkjøles til 55 ° C i et vannbad.
      Merk: De smeltet og avkjølt TB1 legges innholdet i hver titer eller screening tube, og etter blanding, helles i den aktuelle titer eller screening TB1 agar plater.
  9. La platene står for 15-30 min ved romtemperatur, med lokk gløtt å hindre kondensering.
  10. Inverter platene og plasser ti screening platene i en stillestående 24 ° C inkubator og ruge for 46 – 48 h (dvs., selektiv forhold) og seks titer platene i en stillestående 37 ° C inkubator og ruge 24 h/natten (dvs. ikke-selektive betingelser).
    Merk: For kvalitetssikring og standardisering av resultater, kommersielt tilgjengelig kontroll phage løsninger som inneholder en blanding av wildtype og mutant cII med kjente mutant frekvens er belagt sammen med pakket DNA-prøvene og inkludert i alle analysen kjører56.

5. å undersøke Titer og Screening plater for å fastslå cII Mutant frekvens

  1. Etter den 24 h/overnatting inkubering på 37 ° C, antallet plaketter dannet i hver av de tre Titer 20 og Titer 100 plater. For å lettere identifisere plaketter, holde platen ved siden av et hvitt lys og en mørk bakgrunn med lokk (se figur 2).
  2. Lag en gjennomsnittet av antall plaketter telles i hvert Titer 20 og Titer 100 plater (triplicate, hver).
  3. Velg gjennomsnittlig antall fra settet med titer plater som faller nærmest dataområdet 50-200 plaketter per sett.
  4. Beregn antall plaketter vist i ti screening platene som følger:
    Totalt plaketter vist (gjennomsnittlig antall plaketter i valgte settet med titer plater ÷ antall µL av fortynning brukes per valgte titer plate) x fortynningsfaktoren for x antall µL av pakket DNA-prøve per screening plate [100 µL/plate] x antall screening plater [10].
    Merk: For eksempel hvis gjennomsnittlig antall plaketter per plate i settet med Titer 20 plater er 128 og det tilhørende nummeret i settet med Titer 100 plater er 478, hvor 128 brukes for beregning av antall plaketter vist , som følger:
    (128 ÷ 20) x 100 [fortynningsfaktoren] x 100 [µL/plate] x 10 [plater] = 640,000
    Dette tilsvarer multiplisere gjennomsnittlig antall plaketter av 5000 eller 1000, hvis gjennomsnittlig antall er basert på teller fra Titer 20 plater eller Titer 100 plater, henholdsvis.
  5. Etter 46 – 48 h inkubasjon på 24 ° C, teller antall plaketter dannet i ti screening plater (Følg instruksjonene i delen 5.1).
    Merk: CII mutant frekvensen beregnes ved å dividere det totale antallet plaketter dannet i screening platene av antall plaketter vist. I eksempelet over, hvis antall plaketter telles i ti screening platene er 112, cII mutant frekvensen for denne DNA-prøve ville være 112 ÷ 640,000 = 17,5 x 10-5.

6. verifisering av Putative λ cII mutanter, PCR forsterkning og DNA sekvensering

  1. Core plakk i spørsmålet med et sterilt, wide-fødte Pipetter tips og utvise dem (ved pipettering opp og ned) inn i et sterilt microcentrifuge rør som inneholder 500 µL sterilt SM-bufferen.
  2. Inkuber for minst 2 timer ved romtemperatur eller på 4 ° C over natten, slik at phage partikler til elute fra agar plugg.
  3. I et sterilt 14 x 100 mm2 runde bunn rør, bland 200 µL av G1250 plating kultur med 1 µL av cored phage løsningen og ruge i 30 min på RT.
  4. Plate utvalget med 2,5 mL av 55 ° C smeltet TB1 topp agar og ruge platen på 24 ° C i 46 – 48 h (selektiv betingelser), som beskrevet i delene 4.8-4.10.
  5. Når sekundære plaketter har dannet, bruke en pipette tips å forsiktig plukke en enkelt godt isolert bekreftet λ cII-mutant plakk (unngå å berøre den lavere agar).
    Merk: Replating antatte cII mutant plaketter tjener to formål: (i) plating gjenstander kan noen ganger forveksles med liten plaketter; og (ii) en agarose core fra en screening plate kan inneholde ikke-mutant phage(s) sammen med en mutant phage. Sekundær plaketter fra en lav replating vil gi en forurenset mutant mal for PCR og påfølgende DNA sekvens analyse.
  6. Overføre en plakett til et microcentrifuge rør som inneholder 25 µL dobbel-destillert vann av pipettering opp og ned.
  7. Sett røret i kokende vann i 5 min.
  8. Sentrifuge med maksimal hastighet (18 000 x g) i 3 minutter på RT.
  9. Overføre 10 µL nedbryting av umiddelbart til en ny microcentrifuge rør som inneholder 40 µL av et PCR-mastermix der de endelige konsentrasjonene av reagensene er 1 x Taq PCR buffer, 10 pmol hver revers primerne, 12.5 nmol av hver dNTP , og 2,5 U av Taq DNA polymerase.
    Merk: Forover og bakover grunning er som følger: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3 "(posisjoner-68 til-50 i forhold til cII starte codon) og 5-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3" (stillinger +345 til +365 i forhold til cII start codon), henholdsvis.
  10. Forsterke malen følgende sykling parametere: en 3 min rødsprit ved 95 ° C, etterfulgt av 30 sykluser av 30 s på 95 ° C, 1 min på 60 ° C og 1 min ved 72 ° C, med filtypen siste 10 min på 72 ° C.
  11. Rense 432 bp PCR produktet inneholder cII genet og flankert områder ved å bruke kommersielt tilgjengelige PCR rensing kits, i henhold til produsentens instruksjoner.
  12. Utføre DNA sekvensering bruker en aktuell sekvensering-plattformen, og analysere de resulterende DNA-sekvensene for å oppdage mutasjoner i cII transgene (se merknaden nedenfor).
    Merk: Dette er best oppnås ved oppstilling med referanse cII sekvensen benytter programvare, som web-baserte T-kaffe sekvens justering serveren. For instruksjoner om hvordan du bruker programmet, besøk: http://tcoffee.crg.cat/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Avhengig av data fordeling brukes parametrisk eller ikke-parametriske tester til å avgjøre betydningen av forskjellen i cII mutant frekvens behandling og kontroll grupper (i.e.indusert versus spontan mutant frekvenser) . Sammenligning av indusert cII mutant frekvenser over forskjellige behandlingsgrupper er laget av ulike (parvis) statistiske tester, som er aktuelt. Den hypergeometriske testen av Adams og Skopek brukes vanligvis til å sammenligne generelle indusert- og spontan mutasjon spectra57, selv om andre tester, som χ2 test eller variansanalyse (ANOVA), kan også brukes til å sammenligne frekvensen for hver spesifikke informasjonstype mutasjon (f.eks, overgang, transversion, innsetting eller sletting) mellom til indusert- og kontroll mutasjon spectra, eller blant ulike mutasjon spektra av ulike kjemikalier/agenter eller varierende doser av samme kjemisk/agent.

Figur 3 er en samling av mutant frekvensdata fra publiserte studier der vi har vist at omfanget av økningen i relativ cII mutant frekvens i mus embryonale fibroblaster behandlet med ulike kjemikalier og/eller physicalagents kan variere fra noen-til flere hundred-fold, etter mutagene "styrke" av det test sammensatt. Statistisk signifikant fold-økninger i cII muterte frekvensen vises mus embryonale fibroblaster behandlet med akrylamid12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, Ses-aminolevulinic syre (ses-ALA) pluss lav dose ultrafiolett lys A (UVA: λ > 320−400 nm)15og benzo (a) pyrene diol epoxide(B(a)PDE)19equilethal doser av UVA, UVB (λ = 2 80−320 nm), og simulert sollys UV (SSL) 21 (se Figur 3).

Figur 4 er en demonstrasjon av 'sekvens-spesifisitet' av mutasjoner som vi har vist induksjon av bestemte typer mutasjon i cII transgene i mouseembryonicfibroblasts bestrålt med UVBrelativetocontrol23. UVB-indusert mutasjon spekteret er preget av betydelig økning i relative hyppigheten av enkelt- eller tandem C→T overganger på pyrimidine dinucleotides.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk presentasjon av λ Velg cII analysen. Analysen er basert på henting av λLIZ transport vektorer, som inneholder cII transgene som en mutational reporter genet, fra genomisk DNA av kultivert cellene stammer fra transgene gnagere behandlet i vitro med en test sammensatt eller vev/organer av tilsvarende dyr behandlet i vivo med testet kjemiske/agent (A og B). Reddet vektorer er pakket inn i λ phage hoder som kan infisere en riktig vert E. coli (C og D). Infiserte bakterier dyrkes deretter under selektiv forhold for scoring og analyse av mutasjoner i cII transgene1,2,3,25, 52 (E). Fastsettelse av indusert cII mutant frekvens og etablering av mutasjon spekteret av DNA sekvensering er beskrevet i F og G. Indusert- og spontan mutasjon spectra kan visualiseres i forskjellige formater. Illustrasjon, har vi fremhevet et format der indusert cII mutasjoner er skrevet ovenfor referanse sekvensen, mens den spontane mutasjoner (kontroll) skrives under referanse sekvensen (H). Høyden på en mutert base representerer sin frekvensen av mutasjoner (dvs.jo høyere base, det oftere mutert). Tall over en mutert base angir prosenten frekvensen av mutasjoner i som base. Slettede baser er understreket. Innsatte baser vises med en pil. Artikkelnumre baser er referanse nukleotid posisjoner. Dataene er Hentet fra en publisert studie23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: telle plaketter i titer plater. For å lettere identifisere plaketter, holdes plater ved siden av et hvitt lys og en mørk bakgrunn med lokk fjernet. Titer 20 plate (A) og Titer 100 platen (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Mutant frekvenser av cII transgene i mus embryonale fibroblaster behandlet med ulike kjemikalier og/eller fysiske agenter i forhold til kontroller. Dataene er Hentet fra publiserte studier av akrylamid12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, ses-aminolevulinic syre (ses-ALA) pluss lav dose ultrafiolett lys A (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo(a) pyrenediol epoxide (B(a)PDE)19og equilethal doser av UVA, UVB (λ = 280−320 nm), og simulert sollys UV (SSL)21. For å effektivt metabolismer tamoxifen i mus embryonale fibroblast celler, brukte vi S9-aktivisering systemet (S9 blandingen) består av Aroclor 1,254-indusert rotte leveren forberedelser og kofaktor reagenser22. Alle forskjeller mellom behandlet- og kontroll prøver er statistisk signifikant på p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Mutasjon spektra av cII transgene i mus embryonale fibroblaster bestrålt med UVB forhold til kontrollen. Dataene er Hentet fra en publisert studie23. Strand speil motstykket til alle overganger (f.eksG→A og C→T) og transversions (f.eksG→T og C→A eller G→C og C→G) kombineres. Moduler: innsetting; Del: sletting. UVB-indusert mutasjon spekteret er preget av betydelig økning i relative hyppigheten av enkelt- eller tandem C→T overganger på pyrimidine dinucleotides. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Λ Velg cII analysen brukes for påvisning av mutasjoner i cII transgene utvinnes fra genomisk DNA av cellene stammer fra organer/vev av BB gnagere3. Genomet av disse transgene dyrene inneholder flere tandem kopier av chromosomally integrert λLIZ transport vektor, som bærer cII (294 bp) og lacI (1,080 bp) effekter av transgener, som mutational reporter gener1, 2 , 25. λ Velg cII analysen er basert på henting av λLIZ transport vektorer fra genomisk DNA av celler/vev av transgene dyrene, etterfulgt av pakking av reddet vektorer i λ phage hoder som kan infisere en riktig vert E. coli. Deretter infiserte bakterier dyrkes under selektiv forhold for scoring og analyse av mutasjoner i cII transgene (se figur 1)1,3. Λ Velg cII analysen er mye brukt for genetisk virkning testing av en rekke kjemikalier og/eller fysiske agenter (omtalt i referanser2,49). Analysen har vært anvendt transgene mus/rotte celle kulturer behandlet i vitro med ulike kjemikalier og/eller fysiske agenter, og vev/organer tilsvarende dyrene behandlet i vivo med forskjellige test kjemikalier/agenter4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

Λ Velg cII analysen i kulturperler celler av transgene gnagere behandlet med en test sammensatte representerer, på mange måter et levedyktig alternativ til i vivo genetisk virkning eksperimenter i tilsvarende dyr behandlet med testet kjemiske/agent 3. som regel i vitro -modellene har betydelige fordeler fremfor sin motpart i vivo dyremodeller, som de er mye mindre arbeidskraft intensiv og kostbar, krever mye mindre tid fullføres, og viktigst, ikke innebære direkte bruk av dyr2,50,52. Samtidig, i vitro modellene kan ikke fullt er recapitulate alle aspekter av mutagenese på grunn av forskjeller i egenskapene farmakokinetiske og Farmakodynamiske kjemikalier mellom kulturperler celler i vitro og forsøksdyr i vivo 2 , 3. For eksempel kjemikalier som eksponering er innånding (f.eks, sigarett røyk eller elektronisk sigarettdamp) kan kun gjøres mottakelig for i vitro testing i cellekulturer etter at de er konvertert fra gass eller damp former for væske eller kondensat, kompliserer deres farmakokinetikken. Også en ufullstendig eller fraværende metabolske kapasiteten på kulturperler celler i vitro konvertere visse kjemikalier til DNA-reaktive arter kan ikke representere DNA-skade drevet genetisk virkning i dyr utsatt i vivo gentoksisk kjemikalier2 ,3. Selv om denne ulempen kan bli kompensert for varierende grad med tillegg av en ekstern metabolske Aktivisering system (dvs., S9 blandingen) i vitro celle kultur modeller22.

Videre er replikering av virkelige menneskelig eksponering for gentoksisk kjemikalier/agenter mer begrenset med i vitro celle kultur modeller enn med forsøksdyr i vivo3. Vanligvis, mennesker er utsatt for kroniske doser av gentoksisk agenter over en flere år å få tiår76,77,78. Endelig levetiden til cellene i kultur, i forhold til den relativt lengre levetiden av gnagere (dvs., dager/uker versus årene) gjør modellering for menneskelig eksponering for genotoxins mer utfordrende i tidligere modeller2, 3. Likevel, genetisk virkning analyse med i vitro celle kultur modeller kan gi en første indikasjon på gentoksisk potensialet i en gitt kjemisk / agent (er), og resultatene kan brukes som en guide til å utforme "raffinert" i vivo eksperimenter som har en 'redusert' antall dyr2,3.

Avslutningsvis λ Velg cII analysen i kulturperler celler av transgene gnagere behandlet med en test sammensatte, eller de tilsvarende dyr behandlet med testet kjemiske/agent, er en verdifull tilnærming for testing av genetisk virkning. Vi har brukt tilnærming, som har andre forskningsgrupper hele verden4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24,34,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67,68,69, 70,,71,,72,,73,,74,,75. Flere nylig, har vi utvidet programmene i denne tilnærmingen ved å utvikle en ny teknikk der en endring av λ Velg cII analysen sammen med neste generasjons sekvensering gjør høy gjennomstrømning analyse av mutasjoner i et tid-, kostnad- og arbeidskraft-effektiv måte23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne erklære noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi ønsker å erkjenne bidrag av alle kolleger og samarbeidspartnere til våre opprinnelige studier, som resultatene har blitt referert til i dette manuskriptet (for illustrasjon). Forfatternes arbeid støttes av tilskudd fra National Institute for Dental og Craniofacial forskning av National Institutes of Health (1R01DE026043) til AB og fra Universitetet i California Tobacco-Related sykdom Research Program til AB ( TRDRP-26IR-0015) og ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorene av studien ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling, analyse, dataene tolkning, skriving av rapporten, eller i beslutningen om å sende publikasjonen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828 (2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116 (2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 134 Bacteriophage cII Transgene embryonale musen fibroblaster EMF mutasjon transport Vector
Lambda Velg <em>cII</em> mutasjon Detection System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Besaratinia, A., Tommasi, S. The… More

Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter