Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Lambda Vælg cII Mutation Detection System

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Vi beskriver en detaljeret protokol for Lambda Vælg cII mutation assay i kulturperler celler af transgene gnavere eller de tilsvarende dyr behandlet med et kemisk/fysisk agent af interesse. Denne tilgang har været meget anvendt for mutagenicitet afprøvning af kræftfremkaldende stoffer i pattedyrsceller.

Abstract

En række af transgene dyremodeller og mutation detektionssystemer er blevet udviklet for mutagenicitet afprøvning af kræftfremkaldende stoffer i pattedyrsceller. Af disse, er Transgene mus og Lambda (λ) Vælg cII Mutation Detection System blevet ansat for mutagenicitet eksperimenter af mange forskergrupper verden over. Her, vi beskriver en detaljeret protokol for Lambda Vælg cII mutation analysen, som kan anvendes til kulturperler celler af Transgene mus/rotter eller de tilsvarende dyr behandlet med et kemisk/fysisk agent af interesse. Protokollen består af følgende trin: (1) isolering af genomisk DNA fra celler eller organer/væv af transgene dyr behandles i in vitro eller i vivo, henholdsvis med en test sammensatte; (2) inddrivelse af lambda shuttle vektor bærer mutationsmønstre reporter gen (dvs., cII transgen) fra genomisk DNA; (3) emballage af de reddede vektorer i smitsomme Bakteriofager; (4) inficere en vært bakterier og dyrkning på selektiv betingelser at tillade formering af de inducerede cII mutationer; og (5) scoring cII-mutanter og DNA sekvens analyse for at bestemme cII mutant frekvens og mutation spektrum, henholdsvis.

Introduction

En bred vifte af transgene dyremodeller og mutation detektionssystemer er blevet udviklet for mutagenicitet afprøvning af kræftfremkaldende stoffer i pattedyrsceller. Af disse, har transgene Big Blue (kaldet herefter BB) mus og λ Vælg cII Mutation Detection System været beskæftiget for mutagenicitet eksperimenter i denne gruppe og mange andre forskning grupper verden over1,2, 3,4,5,6,7,8,9. For de sidste 16 år, har vi undersøgt de mutagene virkninger af forskellige kemiske og/eller fysiske agenser ved hjælp af disse transgene dyr eller deres tilsvarende embryonale fibroblast cellekulturer behandles med en test sammensatte, og efterfølgende analyseres de fænotype og genotype af cII transgenet ved λ Vælg cII analyse og DNA-sekventering, henholdsvis10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. genomet af disse transgene dyr indeholder en bacteriophage λ shuttle vektor (λLIZ) integreret på kromosom 4 som en multi kopi hoved-til-hale concatemer1,2,25. ΛLIZ shuttle vektor bærer to mutationsmønstre reporter gener, nemlig Lund og cII transgener1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Vælg cII assay er baseret på genvinding af λLIZ shuttle vektorer fra genomisk DNA af celler, der stammer fra organer/væv af transgene dyr1,2,25 . Gendannede λLIZ shuttle vektorer er derefter pakket ind i λ phage hoveder i stand til at inficere en indikator vært Escherichia coli. Efterfølgende, er de inficerede bakterier vokset selektiv betingelser at tillade scoring og analyse af mutationer i cII transgen1,3.

Her, vi beskriver en detaljeret protokol for λ Vælg cII assay, som består af isolation af genomisk DNA fra celler/organer fra transgene dyr behandlet in vitro-/i vivo med en test sammensatte, hentning af λLIZ shuttle vektorer fra genomisk DNA emballage af vektorerne i smitsomme λ phages, infektion af værten E. coli med Bakteriofager, identifikation af cII-mutanter selektiv betingelser at fastlægge cII mutant frekvens, og DNA Sekvensanalyse at etablere cII mutation spektrum. Protokollen kan anvendes til Transgene mus/rotte celle kulturer behandlet in vitro- med en kemisk/fysisk agent af interesse, eller væv/organer af de tilsvarende dyr behandlet i vivo test kemiske/agent1, 2,4,48,49,50,51,52. En skematisk præsentation af λ Vælg cII assay er vist i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. genomisk DNA isoleret fra mus embryonale fibroblaster

Bemærk: Primære mus embryonale fibroblaster er isoleret fra embryoner stammer fra BB Transgene mus med C57BL/6 genetiske baggrund, ifølge offentliggjorte protokol53. Udgangsmateriale for denne protokol består af 1 x 106 til 1 x 107 embryonale fibroblastceller behandles med en test sammensatte versus kontrol. Høst og optælling af disse celler ved hjælp af standard metoder er beskrevet i referencer10,54,55.

  1. Forberede buffer en (0,3 M saccharose, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM spermidine, 0,15 mM Spermin og 2 mM EDTA), buffer B (150 mM NaCl og 5 mM EDTA, pH 7,8) og buffer C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM NaCl, 20 mM EDTA og 1% SDS) i forvejen, og Bevar ved stuetemperatur (RT) for op til 1 år54,55.
  2. Resuspend celler i 2-4 mL buffer A i en 15 mL konisk centrifugeglas af gentagne gange pipettering op og ned ved hjælp af en bred bore 1.000 µL pipette tip.
  3. Tilføj en diskenhed (2-4 mL) buffer A indeholdende 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (f.eks.Nonidet P40) ved hjælp af et glas serologisk pipette.
  4. Inkuber tube i isbad i 5 min.
  5. Centrifugeres tube på 1.000 x g i 5 min på RT.
  6. Supernatanten og vaske pellet med 10-15 mL buffer en ved hjælp af et glas serologisk pipette.
  7. Resuspenderes i 2-4 mL buffer B.
  8. Tilføj en diskenhed (2-4 mL) buffer C indeholdende 600 µg/mL proteinase K.
  9. Inkuber rør i 3 timer ved 37 ° C.
  10. Tilføje RNase A til en endelig koncentration på 100 µg/mL.
  11. Inkuber røret i en yderligere 1 timer ved 37 ° C.
  12. Tilføj en diskenhed (2-4 mL) phenol (mættet i 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0):chloroform:isoamyl alkohol (25:24:1 vol/vol).
    Bemærk: Phenol kan udgøre en alvorlig sundhedsrisiko og skal håndteres med ekstrem forsigtighed. Phenol er stærkt ætsende og let absorberes gennem det, og udstiller andre effekter. Når håndtering phenol, altid bruge dobbelt gloving, bære beskyttelsesbriller, og arbejde i en kemisk stinkskab.
  13. Bland godt ved at vende røret i 5 min på en tube rotator ved 4 ° C.
  14. Centrifugeres tube på 1.000 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  15. Fjerne den vandige fase (øverste lag) til et nyt rør ved hjælp af et glas serologisk pipette.
  16. Gentag phenol: chloroform: isoamyl alkohol udtræk 1-3 gange indtil den vandige fase er klart og grænsefladen er ikke længere grumset.
  17. Tilføj 1/10-diskenhed (200-400 µL) 3M natriumacetat, pH 5,2.
  18. Tilsættes 2,5 volumen (5-10 mL) 100% ethanol (nedkølede) og vend røret forsigtigt i hånden i 2-3 min.
  19. Spool DNA med glas krog og overføre det til en ny tube, som indeholder 1-5 mL 70% Ethanol og vaske det grundigt. Alternativt, centrifugeres rør med høj hastighed (3.500 x g) ved 4 ° C til pellet DNA og vaske det grundigt med 1-5 mL 70% Ethanol.
  20. Centrifugeres rør med høj hastighed (3.500 x g) ved RT, Fjern supernatanten og lufttørre DNA for 10-15 min.
  21. Opløse DNA i 10-100 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), og opbevar ved 4 ° C (for korte opbevaring af op til en måned) eller ved-20 ° C (for længere opbevaringsperiode). Den optimale koncentration af DNA for λ Vælg cII assay er 0,5-1,0 µg/µL (i TE buffer)56.

2. in Vitro emballage reaktion

  1. Per én emballage reaktion, tilføje ~ 5 µg genomisk DNA (endelige rumfang: 8 – 12 µL, genomisk DNA blev isoleret i afsnit 1 fra mus embryonale fibroblaster behandlet in vitro- test sammensatte eller kontrol) til et microcentrifuge rør, der indeholder først Reaktionen mix (~ 10 µL).
    Bemærk: Tilberedt In-house eller kommercielt tilgængelige λ emballage ekstrakter anvendes i forskellige laboratorier. I den kommercielle emballage ekstrakt kit bruges her56 (Se Tabel af materialer), røde rør indeholdt den første reaktion mix (~ 10 µL) og blå rør indeholdt den anden mastermix (~ 70 µL for mindst 5 reaktioner).
  2. Inkuber tube i 90 min ved 30 ° C.
  3. Tilføje den nødvendige mængde (~ 12 µL) af den anden mastermix til røret.
  4. Inkuber tube for en yderligere 90 min ved 30 ° C.
  5. Tilføje 1,1 mL af SM buffer til glasset.
    Bemærk: 1 mL af denne opløsning (dvs., emballage reaktionsblandingen) vil blive anvendt til screening λ cII-mutanter. Resten vil blive brugt til titering.
    1. Forberede SM buffer ved at blande 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) og 5 mL 2% (w/v) gelatine. Tilføje dH2O til en endelige rumfang på 1 liter, autoklave i 30 min. butik ved stuetemperatur i op til 1 år.
  6. Vortex rør indeholdende emballerede DNA-prøven for 10 s på RT (energisk vortexing).
  7. Puls dreje røret i en microcentrifuge og opbevares på køl indtil klar til brug. Hvis prøven ikke kommer til at blive anvendt inden for den samme dag i emballage, tilføje 50 µL chloroform pr. mL pakkede DNA prøve, vortex forsigtigt, og opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger.

3. forberedelse af E. coli G1250 bakteriekulturen

  1. Mindst to dage før plating, lave et par bakteriel streak plader fra Escherichia coli (E. coli) G1250 på TB1-kanamycin agar plader.
    1. Forberede TB1-kanamycin agar plader som følger. Bland 5.0 g NaCl, 10,0 g kasein pepton og 12,0 g agar. Tilføje 800 mL dH2O. tilføje 1 mL 0,1% thiamin hydrochlorid. Justere pH 7.0 med NaOH eller HCl. Tilføj dH2O til en endelige rumfang på 1 liter.
    2. Bland godt og autoklave i 30 min. lad den afkøle til 55 ° C. Tilføj 50,0 mg Kanamycin og bland. Hæld i sterile petriskåle med 100-mm (20 – 25 mL pr parabol). Gemme plader ved 4 ° C i op til to uger.
  2. Inkuber bakteriel streak pladerne i en stationær 30 ° C inkubator i mindst 24 timer.
  3. En dag før plating, kombinere 10 mL af TB1 flydende medium med 100 µL af 20% (w/v) maltose-1 M MgSO4 løsning i et sterilt 50 mL skruelåg koniske rør.
    1. Forberede TB1 flydende medium som følger. Mix 5,0 g NaCl og 10,0 g kasein pepton, derefter tilføje 800 mL dH2O, 1 mL 0,1% thiamin-hydrochlorid, og ph indstilles til 7.0 med NaOH eller HCl. Derefter tilføje dH2O til en endelige rumfang på 1 liter, bland godt og autoklave i 30 min. butik medium på RT for op til tre måneder.
    2. Forberede 20% (w/v) Maltose-1 M MgSO4 som følger. Bland 20,0 g Maltose og 24.6 g MgSO4. 7H2O, derefter tilføje dH2O til en endelige rumfang på 100 mL. Filter steriliseres og opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder.
  4. Podes Lage med adskillige kolonier fra bakteriel streak pladen ved hjælp af en steril inoculating loop56.
  5. Inkuber den flydende kultur natten over i en 30 ° C ryster kuvøse med kraftig omrystning (250 – 300 rpm).
  6. På dagen for plating, centrifugeres den koniske rør indeholdende G1250 væske kultur ved 1.500 x g i 10 min. ved RT at sammenpresse de bakterieceller.
  7. Supernatanten og celle resuspenderes i 10 mL i 10 mM MgSO4.
  8. Absorbansen måles af en 1:10 fortynding af cellesuspension på bølgelængde 600 nm ved hjælp af en UV-Vis spektrofotometeret (fx, 100 µL cellesuspension + 900 µL 10 mM MgSO4)56.
  9. Fortyndet cellesuspension til en afsluttende OD600 af 0,5 med 10 mM MgSO4. Rede suspensionen af G1250 E. coli med OD600 = 0,5 omtales som 'G1250 plating kultur'.
  10. Opbevares G1250 plating kultur på is og anvendes inden for 1-2 h.

4. plating emballerede DNA-prøver

  1. Per én pakket DNA-prøve, forberede seksten sterile 14 x 100 mm2 runde-nederste rør og seksten TB1 agar plader. Ti fra hvert sæt vil blive brugt til screening og seks for titering (tre for Titer 20) og tre for Titer 100.
    1. Forberede TB1 agar plader som følger. Mix 5,0 g NaCl, 10,0 g kasein pepton og 12,0 g Agar, derefter tilføje 800 mL dH2O og 1 mL 0,1% thiamin-hydrochlorid. Justere pH 7.0 med NaOH eller HCL-listen, og tilføje dH2O til en endelige mængden af 1 L.
    2. Bland godt og autoklave i 30 min. Lad blandingen afkøle til 55 ° C, så hæld det i petriskåle med sterilt 100 mm (20 – 25 mL pr parabol). Gemme plader ved 4 ° C i op til to uger.
      Bemærk: TB1 agar plader skal tilberedes mindst 24 timer før brug.
  2. Alikvot 200 µL af G1250 plating kultur ind i hver runde-nederste rør.
  3. For titering, lave en 1: 100 fortynding af emballerede DNA-prøven og bland godt ved vortexing (dvs., 10 µL pakket DNA prøve + 990 µL SM buffer).
  4. Tilføj 20 µL af fortynding 1: 100 for hver af de tre Titer 20 rør.
  5. Tilføj 100 µL af fortynding 1: 100 for hver af de tre Titer 100 rør.
  6. Til screening, Tilsæt 100 µL af den 'ufortyndet ' pakkede DNA-prøve, at hver af ti screening rør.
  7. Behandle alle titering og screening rør (2 x 3 + 10 = 16 rør), som følger: Bland godt ved vortexing for ca. 10 s, og derefter inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. at tillade vært E. coli til adsorberes på phages.
  8. Tilsættes 2,5 mL microwaved smeltet TB1 top agar (afkøles til 55 ° C) til hver titer eller screening tube, blandes umiddelbart ved vortexing (forsigtigt), og hælde i passende titer eller screening TB1 agar plader.
    1. Forberede TB1 top agar som følger. Mix 5,0 g NaCl, 10,0 g kasein pepton og 7,0 g Agar, derefter tilføje 800 mL dH2O. tilføje 1 mL 0,1% thiamin hydrochlorid, derefter justere pH 7.0 med NaOH eller HCl. Endelig, tilføje dH2O til en endelige rumfang på 1 liter.
    2. Bland godt og autoklave for 20-25 min. butik ved stuetemperatur i op til tre måneder.
    3. Før brug, smelte de forberedte TB1 top agar i en mikroovn, bland godt og afkøles til 55 ° C i et vandbad.
      Bemærk: Smeltet og afkølet TB1 toppen er føjet til indholdet af hver titer eller screening tube, og efter blanding, hældes i passende titer eller screening TB1 agar plader.
  9. Lad pladerne stå i 15-30 min. ved stuetemperatur med låg klem til at forhindre kondensation.
  10. Invertere pladerne og placere ti screening plader i en stationær 24 ° C inkubator og inkuberes i 46-48 h (dvs., selektiv betingelser) og seks titer pladerne i en stationær 37 ° C inkubator og inkuberes i 24 h/natten (dvs., non-selektive betingelser).
    Bemærk: For kvalitetssikring og standardisering af resultater, kommercielt tilgængelig kontrol phage opløsninger indeholdende en blanding af vildtype og mutant cII med kendte mutant frekvens er forgyldt sammen med de pakkede DNA-prøver og inkluderet i alle assay kører56.

5. undersøge Titer og Screening plader for at bestemme cII Mutant frekvens

  1. Efter de 24 h/natten inkubation ved 37 ° C, tælle antallet af plaques dannet i hver af de tre Titer 20 plader og Titer 100 plader. Du kan nemmere identificere plaques, holde pladen ved siden af en hvid lyskasse og en mørk baggrund med låg fjernet (Se figur 2).
  2. Gøre en gennemsnittet (middelværdien) af antallet af plaques tælles i hvert sæt af Titer 20 plader og Titer 100 plader (eksemplarer, hver).
  3. Vælg det gennemsnitlige antal fra det sæt af titer plader der falder tættest på vifte af 50-200 plaques pr. plade sæt.
  4. Beregn det samlede antal plaques screenet i ti screening plader som følger:
    Total plaques screenet = (Gennemsnitlig antal plaques i den valgte række titer plader ÷ antal µL af fortynding anvendes pr. valgte titer plade) x fortyndingsfaktoren x antal µL af emballerede DNA prøve pr. screening plade [100 µL/plade] x antal screening plader [10].
    Bemærk: For eksempel, hvis det gennemsnitlige antal plaques pr. plade i sæt af Titer 20 plader er 128 og det tilsvarende nummer i sættet af Titer 100 plader er 478, nummer 128 vil blive brugt til beregning af det samlede antal plaques screenet , som følger:
    (128 ÷ 20) x 100 [fortyndingsfaktoren] x 100 [µL/plade] x 10 [plader] = 640,000
    Dette svarer til at multiplicere den gennemsnitlige antal plaques med 5.000 eller 1.000, hvis det gennemsnitlige antal er baseret på tæller fra Titer 20 plader eller Titer 100 plader, henholdsvis.
  5. Efter 46 – 48 h inkubation ved 24 ° C dannet tælle det samlede antal plaques i ti screening plader (følg vejledningen i afsnit 5.1).
    Bemærk: CII mutant hyppighed beregnes ved at dividere det samlede antal plaques dannet i screening plader af det samlede antal plaques screenet. Ved hjælp af eksemplet ovenfor, hvis det samlede antal plaques tælles i ti screening plader er 112, cII mutant frekvens for denne DNA-prøve ville være 112 ÷ 640,000 = 17,5 x 10-5.

6. kontrol af formodede λ cII mutanter, PCR-amplifikation og DNA sekventering

  1. Core pladen med en steril, wide-bore afpipetteres tip og udvise det (ved pipettering op og ned) ind i en steril microcentrifuge rør indeholdende 500 µL sterilt SM buffer.
  2. Inkuber i mindst 2 timer ved stuetemperatur eller ved 4 ° C natten over, at tillade phage partikler at eluere fra agaren stik.
  3. I en steril 14 x 100 mm2 runde-nederste rør, bland 200 µL af G1250 plating kultur med 1 µL af frugten uden kernehus phage løsning, og Inkuber i 30 min. ved RT.
  4. Plade eksemplet med 2,5 mL af 55 ° C smeltet TB1 top agar og inkuberes plade på 24 ° C til 46-48 h (selektiv betingelser), som beskrevet i afsnit 4.8-4.10.
  5. Når de sekundære plaques har dannet, bruge en pipette tip til at omhyggeligt vælge et enkelt godt isoleret verificerede λ cII-mutant plaque (undgå at røre den nederste agar).
    Bemærk: Replating formodede cII mutant plaques tjener to formål: (i) plating artefakter kan nogle gange forveksles med lille størrelse plaques; og (ii) en Agarosen core taget fra en screening plade kan indeholde ikke-mutant phage(s) sammen med en mutant phage. Sekundære plaques fra en lav densitet replating vil give en uforurenet mutant skabelon til PCR og efterfølgende DNA Sekvensanalyse.
  6. Overføre plak til et microcentrifuge rør indeholdende 25 µL dobbeltdestilleret vand af pipettering op og ned.
  7. Glasset anbringes i kogende vand i 5 min.
  8. Der centrifugeres ved maksimal hastighed (18.000 x g) i 3 minutter på RT.
  9. Overfør 10 µL af supernatanten straks til en ny microcentrifuge rør indeholdende 40 µL af en PCR-mastermix, hvor de endelige koncentrationer af reagenser er 1 x Taq PCR buffer, 10 pmol hver af forward og reverse primere, 12,5 nmol af hver dNTP , og 2,5 U af Taq DNA polymerase.
    Bemærk: Frem og bak primere er som følger: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (stillinger-68 til -50 i forhold til cII start codon) og 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (positioner +345 til 365 i forhold til cII start codon), henholdsvis.
  10. Forstærke skabelonen ved hjælp af følgende cykling parametre: 3 min denaturering ved 95 ° C, efterfulgt af 30 cyklusser af 30 s ved 95 ° C, 1 min. ved 60 ° C, og 1 min. ved 72 ° C, med en sidste udvidelse af 10 min på 72 ° C.
  11. Rense de 432 bp PCR produkt indeholdende cII -genet og flankerende områder ved hjælp af kommercielt tilgængelige PCR rensning kits, ifølge producentens anvisninger.
  12. Udføre DNA-sekventering ved hjælp af en passende sekventering platform, og analysere de resulterende DNA-sekvenser for at påvise mutationer i cII transgenet (Se bemærkningen nedenfor).
    Bemærk: Dette er bedst opnås ved justering med henvisning cII sekvens benytter programmel, web-baseret T-kaffe sequence alignment server. For instruktioner om hvordan man bruger programmet, besøg: http://tcoffee.crg.cat/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Afhængigt af datadistribution bruges parametrisk eller ikke-parametrisk test til at bestemme betydningen af forskellen i cII mutant frekvens mellem behandling og kontrol grupper (dvs., induceret versus spontane mutant frekvenser) . Sammenligning af de inducerede cII mutant frekvenser på tværs af forskellige behandlingsgrupper er lavet af forskellige (parvis) statistiske test, hvor det er relevant. Hypergeometrisk test af Adams og Skopek er almindeligt anvendt til at sammenligne den samlede inducerede- og spontan mutation spectra57, selv om andre test, såsom χ2 test eller variansanalyse (ANOVA), kan også bruges til at sammenligne hyppigheden for hver specifik type af mutation (f.eks.overgang, transversion, indsættelse eller sletning) mellem de inducerede- og kontrol mutation spektre, eller blandt forskellige mutation spectra induceret af forskellige kemikalier/agenter eller varierende doser af det samme kemiske/agent.

Figur 3 er en samling af mutant frekvens data fra publicerede studier, hvor vi har bevist, at omfanget af stigningen i relative cII mutant frekvens i mus embryonale fibroblaster behandles med forskellige kemikalier og/eller physicalagents kan variere fra et par-til flere hundredfold, afhængigt af de mutagene 'styrke' af testforbindelsen. Statistisk signifikant fold-stigninger i cII mutant frekvens er vist for musen embryonale fibroblaster behandlet med acrylamid12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, Δ-aminolaevulinsyre (δ-ALA) plus lavdosis ultraviolet lys A (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo [a] pyren diol epoxide(B(a)PDE)19og equilethal doser af UVA, UVB (λ = 2 80−320 nm), og simuleret sollys UV (SSL) 21 (Se Figur 3).

Figur 4 er en demonstration af 'sekvens-specificitet' af mutationer i som vi har vist induktion af specifikke typer af mutation i cII transgenet i mouseembryonicfibroblasts bestråles med UVBrelativetocontrol23. UVB-induceret mutation spektrum er præget af betydelige stigninger i relative hyppighed af enkelt- eller tandem C→T overgange på pyrimidin dinucleotides.

Figure 1
Figur 1: Skematisk præsentation af λ Vælg cII assay. Analysen er baseret på hentning af λLIZ shuttle vektorer, som indeholder cII transgenet som et mutationsmønstre reporter gen fra dyrkede celler, der stammer fra genetisk modificerede gnavere behandlet in vitro- med en testforbindelsen genomisk DNA eller væv/organer af de tilsvarende dyr behandlet i vivo med den testet kemikalie/agent (A og B). De reddede vektorer er pakket ind i λ phage hoveder, der kan inficere en passende vært E. coli (C og D). De inficerede bakterier er derefter vokset selektiv betingelser at tillade scoring og analyse af mutationer i cII transgen1,2,3,25, 52 (E). Bestemmelse af inducerede cII mutant frekvens og etablering af mutation spektrum af DNA-sekventering er skitseret i F og G. Induceret- og spontan mutation spectra er visualiseret i forskellige formater. Henblik på illustration, har vi fremhævet et format, som inducerede cII mutationer er skrevet ovenfor reference sekvens, der henviser til, at de spontane mutationer (kontrol) skrives under reference sekvens (H). Højden af en muteret base repræsenterer sin frekvensen af mutationer (dvs.jo højere base, den oftere muterede). Tal over en muteret base angiver procent frekvensen af mutationer i denne base. Slettede baser er understreget. Indsatte baser er vist med en pil. Tallene nedenfor baser er reference nukleotid positioner. Data er fra en offentliggjort undersøgelse23. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: tælle plaques i titer plader. Du kan nemmere identificere plaques, holdes plader ved siden af en hvid lyskasse og en mørk baggrund med låg fjernet. Titer 20 (A) og Titer 100 plader (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Mutant frekvenser af cII transgenet i mus embryonale fibroblaster behandlet med forskellige kemikalier og/eller fysiske agenser i forhold til kontrolelementer. Data er fra offentliggjorte undersøgelser om acrylamid12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, δ-aminolaevulinsyre (δ-ALA) plus lavdosis ultraviolet lys A (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo(a) pyrenediol epoxyharpiks (B(a)PDE)19, og equilethal doser af UVA, UVB (λ = 280−320 nm), og simuleret sollys UV (SSL)21. Hvis du vil effektivt metabolisere tamoxifen i mus embryonale fibroblastceller, brugte vi S9-aktivering system (S9 mix) bestående af Aroclor 1,254-induceret rotte lever præparater og cofaktor reagenser22. Alle forskelle mellem behandlet- og kontrolprøver er statistisk signifikant ved p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Mutation spektre af cII transgenet i mus embryonale fibroblaster bestrålet med UVB i forhold til kontrol. Data er fra en offentliggjort undersøgelse23. Strand spejl kolleger af alle overgange (f.eks.G→A og C→T) og transversions (f.eks.G→T og C→A eller G→C og C→G) er kombineret. Ins: indsættelse; Del: sletning. UVB-induceret mutation spektrum er præget af betydelige stigninger i relative hyppighed af enkelt- eller tandem C→T overgange på pyrimidin dinucleotides. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Λ Vælg cII analysen bruges til påvisning af mutationer i cII transgenet inddrives fra genomisk DNA af celler, der stammer fra organer/væv af BB gnavere3. Genomet af disse transgene dyr indeholder flere tandem kopier af chromosomally integreret λLIZ shuttle vektor, som bærer cII (294 bp) og Lund (1.080 bp) transgener, som mutationsmønstre reporter gener1, 2 , 25. λ Vælg cII assay er baseret på hentning af λLIZ shuttle vektorer fra genomisk DNA af celler/væv af transgene dyr, efterfulgt af emballering af de reddede vektorer i λ phage hoveder, der kan inficere en passende vært E. coli. Efterfølgende, de inficerede bakterier er vokset selektiv betingelser at tillade scoring og analyse af mutationer i cII transgenet (Se figur 1)1,3. Λ Vælg cII assay har været brugt til mutagenicitet test af en lang række kemikalier og/eller fysiske agenser (gennemgik i referencer2,49). Analysen har været anvendt med succes til Transgene mus/rotte celle kulturer behandlet in vitro- med forskellige kemikalier og/eller fysiske agenser, og af de tilsvarende dyr væv/organer behandles i vivo med forskellige test kemikalier/agenter4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

Λ Vælg cII assay i kulturperler celler af transgene rotter behandlet med en test sammensatte repræsenterer på mange måder, et levedygtigt alternativ til i vivo mutagenicitet eksperimenter i de tilsvarende dyr behandlet med den testet kemikalie/agent 3. som en generel regel, in vitro- modeller tilbyder betydelige fordele i forhold til deres modstykke i vivo dyremodeller, da de er meget mindre arbejdskraft, intensiv og bekostelig, kræver langt mindre tid til at være afsluttet, og vigtigst af alt, ikke indebære direkte brug af dyr2,50,52. På samme tid, kan in vitro- modeller ikke fuldt sammenfatte alle aspekter af mutagenese på grund af forskelle i de farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaber af kemikalier i kulturperler celler in vitro- og forsøgsdyr i vivo 2 , 3. For eksempel kemikalier hvis eksponeringsvej er indånding (fx, cigaret røg eller elektronisk cigaret damp) kan kun foretages imødekommenhed over for in vitro- test i cellekulturer, når de er konverteret fra gasser eller dampe formularer til flydende eller kondensat, hvilket komplicerer deres farmakokinetik. Også, en ufuldstændig eller fraværende metaboliske kapacitet af dyrkede celler in vitro- at konvertere visse kemikalier i DNA-reaktiv arter kan ikke repræsentere DNA-skader drevet mutagenicitet i dyr eksponeret i vivo for genotoksiske kemikalier2 ,3. Selv om denne ulempe kan kompenseres for, i varierende omfang, ved tilsætning af en ekstern metabolisk aktivering system (dvs., S9 mix) til i vitro celle kultur modeller22.

Derudover er replikering af virkelige liv menneskers udsættelse for genotoksiske kemikalier/agenter mere begrænset med in vitro- celle kultur modeller end med forsøgsdyr i vivo3. Generelt, mennesker udsættes for kronisk doser af genotoksiske stoffer over en tidsperiode på flere år til et par årtier76,77,78. Det begrænset levetid af celler i kultur, i forhold til de forholdsvis længere levetid af gnavere (dvs., dage/uger versus et par år) gør modellering af menneskers eksponering for genotoxins mere udfordrende i de tidligere modeller2, 3. Ikke desto mindre, mutagenicitet analyse med in vitro- celle kultur modeller kan give en første indikation af genotoksisk potentiale af et givet kemikalie / stof(fer), og resultaterne kan bruges som en guide til at designe «raffineret» i vivo forsøg som har en 'reduceret' antal dyr2,3.

Afslutningsvis λ Vælg cII assay i kulturperler celler af transgene rotter behandlet med en test sammensatte, eller de tilsvarende dyr behandlet med den testet kemikalie/agent, er en værdifuld fremgangsmåde for mutagenicitet test. Vi har med held brugt tilgang, som har andre forskergrupper i hele verden4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24,34,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67,68,69, 70,71,72,73,74,75. Senest har vi udvidet anvendelser af denne tilgang ved at udvikle en ny teknik, hvor en ændring af λ Vælg cII analysen sammen med next generation sequencing giver høj overførselshastighed analyse af mutationer i en tid-, pris-, og labor-effektiv måde23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklære nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende bidragene fra alle kolleger og samarbejdspartnere til vores oprindelige undersøgelser, hvis resultater er blevet henvist til i dette manuskript (til orientering). Forfatternes arbejde støttes af tilskud fra National Institute for Dental og Craniofacial forskning af National Institutes of Health (1R01DE026043) til AB og fra University of California Tobacco-Related sygdom Research Program til AB ( TRDRP-26IR-0015) og ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorer af undersøgelsen havde ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling, analyse af data, data fortolkning, skrivning af rapporten eller i beslutningen om at indsende til offentliggørelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828 (2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116 (2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmål 134 Bacteriophage cII transgen embryonale mus fibroblaster EMF Mutation Shuttle vektor
Lambda Vælg <em>cII</em> Mutation Detection System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Besaratinia, A., Tommasi, S. The… More

Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter