Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

"حدد أمداً" الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات"

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

يصف لنا بروتوكول مفصل للمقايسة الطفرة الاتحاد "حدد أمداً" في الخلايا المستزرعة من القوارض المعدلة وراثيا أو الحيوانات المقابلة تعامل مع عامل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة. وقد استخدمت هذا النهج على نطاق واسع لاختبار المحدثة للطفرات من المواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات.

Abstract

قد وضعت عددا من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا ونظم الكشف عن الطفرات المحدثة للطفرات في اختبار للمواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات. هذه، استخدمت الفئران المعدلة وراثيا و "لامدا" (λ) حدد الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات" للتجارب المحدثة للطفرات بالعديد من المجموعات البحثية في جميع أنحاء العالم. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للمقايسة الطفرة الاتحاد "حدد أمداً"، التي يمكن تطبيقها على الخلايا المزروعة من الفئران المعدلة وراثيا/الفئران أو معاملة الحيوانات المقابلة مع وكيل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة. البروتوكول يتكون من الخطوات التالية: (1) عزل الحمض النووي من الخلايا أو الأجهزة/الأنسجة من الحيوانات المحورة وراثيا تعامل في المختبر أو في الجسم الحي، على التوالي، مع مجمع اختبار؛ (2) استعادة ناقل المكوكية لامدا تحمل جين مراسل حيث (أي، التحوير الاتحاد ) من الحمض النووي الجينوم؛ (3) التعبئة والتغليف لناقلات المرض الذين تم إنقاذهم إلى bacteriophages المعدية؛ (4) إصابة بكتيريا المضيفة واستزراع تحت شروط انتقائية للسماح بنشر الطفرات المستحثة الاتحاد ؛ وسجل (5) الاتحاد-طفرات والحمض النووي تسلسل التحليل لتحديد تواتر متحولة الاتحاد والطيف الطفرة، على التوالي.

Introduction

وضعت مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا ونظم الكشف عن الطفرات المحدثة للطفرات في اختبار للمواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات. من هذه الفئران "الأزرق الكبير" (المشار إليها أدناه ك BB) المعدلة وراثيا و λ حدد الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات" قد استخدمت للتجارب المحدثة للطفرات بهذه المجموعة والعديد من غيرها بحوث المجموعات في جميع أنحاء العالم1،2، 3،4،5،،من67،،من89. لل 16 عاماً الماضية حققت التأثيرات الطفور عوامل كيميائية و/أو جسدية مختلفة باستخدام هذه الحيوانات المحورة وراثيا أو ثقافاتها خلية جنينية تنتجها الخلايا الليفية المقابلة تعامل مع مجمع لاختبار، وتحليلها في وقت لاحق النمط الظاهري والنمط الوراثي للتحوير الاتحاد λ حدد الاتحاد المقايسة وتسلسل الحمض النووي، على التوالي10،،من1112،،من1314 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24-الجينوم من هذه الحيوانات المحورة وراثيا يحتوي على ناقل مكوك λ عاثية (λLIZ) المتكاملة على كروموسوم 4 نسخ متعددة الرأس إلى الذيل كونكاتيمير1،2،25. ناقل المكوك λLIZ يحمل اثنين من الجينات مراسل حيث، إلا وهي ﻻسي و الاتحاد المتسلسلات1،2،25،،من2627، ،من 2829،30،31،32،،من3334،35،36، 37،39،،من3840،42،41،43،،من4445 , 46 , 47-يستند التحليل حدد الاتحاد λ استرداد ناقلات المكوك λLIZ من الحمض النووي من الخلايا المشتقة من الأجهزة/الأنسجة من الحيوانات المحورة وراثيا1،2،25 . ثم يتم حزم ناقلات المكوك λLIZ المستردة في λ بالعاثية رؤساء قادرة على إصابة مضيف مؤشر الإشريكيّة القولونية. وفي وقت لاحق، تزرع البكتيريا المصابة تحت شروط انتقائية للسماح لتسجيل وتحليل الطفرات في الاتحاد التحوير1،3.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للمقايسة حدد الاتحاد λ، الذي يتألف من عزل الحمض النووي من الخلايا/أجهزة للحيوانات المحورة وراثيا التي تعامل في المختبر/في فيفو مع اختبار استرجاع مركبة، λLIZ مكوك ناقلات من الحمض النووي الجينوم، التعبئة وتغليف الناقلات إلى فاجيس λ المعدية، العدوى المضيفة كولاي مع bacteriophages، تحديد هوية الاتحاد-طفرات في ظروف الانتقائي لتحديد تواتر متحولة الاتحاد ، و تحليل تسلسل الحمض النووي إنشاء الاتحاد طفرة الطيف. يمكن تطبيق البروتوكول على الماوس/الفئران المعدلة وراثيا خلية الثقافات تعامل في المختبر مع عامل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة، أو معاملة الأنسجة/أجهزة الحيوانات المقابلة في فيفو مع الاختبارات الكيميائية/عامل1، 2،4،،من4849،50،،من5152. عرض تخطيطي للمقايسة حدد الاتحاد λ يرد في الشكل 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الحمض النووي في معزل عن الخلايا الليفية الجنينية الماوس

ملاحظة: الليفية الجنينية الماوس الأساسي يتم عزل من الأجنة المستمدة من الفئران المحورة وراثيا BB مع الخلفية الوراثية C57BL/6، وفقا للبروتوكول المنشورة53. انطلاق المواد لهذا البروتوكول يتكون من 1 × 106 و 1 × 107 تنتجها الخلايا الليفية الجنينية الخلايا تعامل مع اختبار تحكم مركب مقابل . حصاد والعد من هذه الخلايا باستخدام الأساليب القياسية موصوفة في المراجع10،،من5455.

  1. إعداد المخزن المؤقت (0.3 M السكروز 60 ملم بوكل، 15 ملم كلوريد الصوديوم، 60 ملم تريس-HCl، pH 8.0، سبيرمدين 0.5 مم، سبيرميني 0.15 مم و 2 مم يدتا) والمخزن المؤقت ب (150 مم يدتا كلوريد الصوديوم و 5 مم، الرقم الهيدروجيني 7.8) المخزن المؤقت ج (20 ملم تريس-HCl، pH 8.0 ، 20 مم كلوريد الصوديوم، يدتا 20 مم، والحزب الديمقراطي الصربي 1%) مقدما في، والمحافظة على درجة حرارة الغرفة (RT) لتصل إلى واحد في العام54،55.
  2. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت 2 – 4 مل في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل من بيبيتينج مرارا وتكرارا إلى أعلى وأسفل باستخدام مجموعة واسعة تتحمل 1,000 نصيحة ماصة ميليلتر.
  3. إضافة واحدة حجم (2 – 4 مل) المخزن المؤقت A التي تحتوي على 1% أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول (مثلاً، نونيديت P40) باستخدام ماصة مصلية زجاج.
  4. احتضان الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق في الرايت
  6. تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه مع 10 – 15 مل المخزن المؤقت باستخدام ماصة مصلية زجاج.
  7. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت لمل 2 – 4 ب
  8. إضافة واحدة حجم (2 – 4 مل) المخزن المؤقت ج تحتوي على 600 ميكروغرام/مل بروتيناز ك.
  9. احتضان الأنبوب ح 3 في 37 درجة مئوية.
  10. إضافة رناسي A بتركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل.
  11. احتضان الأنبوب ح 1 إضافية عند 37 درجة مئوية.
  12. إضافة واحدة حجم (2 – 4 مل) الفينول (المشبعة في 0.1 M تريس-HCl، pH 8.0):chloroform:isoamyl الكحول (25:24:1 المجلد/المجلد).
    ملاحظة: يمكن أن تشكل خطرا على صحة شديدة الفينول ويجب التعامل معها بحذر شديد. الفينول هو الغاية أكالة للجلد وسهولة استيعابها من خلال ذلك، ومعارض الآثار الأخرى. عند التعامل مع الفينول، دائماً استخدام قفازات مزدوج، ارتداء النظارات الواقية، والعمل في غطاء الأبخرة كيميائية.
  13. خلط جيدا بعكس أنبوب لمدة 5 دقائق في دوار أنبوب في 4 درجات مئوية.
  14. الطرد المركزي الأنبوب في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  15. إزالة المرحلة المائية (الطبقة العليا) إلى أنبوب جديد باستخدام ماصة مصلية زجاج.
  16. كرر استخراج الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 1 إلى 3 مرات حتى المرحلة المائية واضحة ولم تعد الواجهة عكر.
  17. أضف 1/10 حجم (200 – 400 ميليلتر) م 3 خلات الصوديوم، pH 5.2.
  18. إضافة 2.5 حجم (5 – 10 مل) 100% إيثانول (مبردة) وعكس الأنبوب بلطف باليد لمدة 2 – 3 دقيقة.
  19. التخزين المؤقت للحمض النووي مع ربط زجاج وتحويلها إلى أنبوب جديد يحتوي على 1 – 5 مل 70% إيثانول وغسله جيدا. وبدلاً من ذلك، الطرد المركزي الأنبوب بسرعة عالية (3,500 س ز) عند 4 درجة مئوية بيليه الحمض النووي وغسله جيدا مع 1 – 5 مل 70% إيثانول.
  20. الطرد المركزي الأنبوب بسرعة عالية (3,500 س ز) على RT وإزالة المادة طافية، وأيردري في الحمض النووي لمدة 10-15 دقيقة.
  21. يحل الحمض النووي في 10 – 100 ميليلتر TE من المخزن المؤقت (10 مم تريس-HCl، 1 مم يدتا، درجة الحموضة 7.5)، وتخزين عند 4 درجة مئوية (لتخزين قصيرة تصل إلى شهر واحد) أو في-20 درجة مئوية (لفترة أطول من التخزين). التركيز الأمثل للحمض النووي للمقايسة حدد الاتحاد λ هي 0.5 – 1.0 ميكروغرام/ميليلتر (في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات)56.

2. في المختبر رد فعل التعبئة والتغليف

  1. كل واحد من رد فعل التعبئة والتغليف، إضافة ~ 5 ميكروغرام الحمض النووي (الحجم النهائي: 8 – 12 ميليلتر، الحمض النووي كانت معزولة في القسم 1 من الماوس الليفية الجنينية المعالجة في المختبر باختبار مركب أو عنصر تحكم) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على الأول رد فعل مزيج (~ 10 ميليلتر).
    ملاحظة: أعد داخليا أو λ المتاحة تجارياً مقتطفات التغليف المستخدمة في مختبرات مختلفة. في التعبئة والتغليف التجاري تستخدم أدوات استخراج هنا56 (انظر الجدول للمواد)، أنابيب الحمراء الواردة في أول رد فعل مزيج (~ 10 ميليلتر) وأنابيب الأزرق الواردة في مزيج رد الفعل الثاني (~ 70 ميليلتر لردود الفعل على الأقل 5).
  2. احتضان الأنبوب لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية.
  3. إضافة وحدة التخزين المطلوب (~ 12 ميليلتر) من مزيج الرد الثاني إلى الأنبوب.
  4. احتضان الأنبوب 90 دقيقة إضافية في 30 درجة مئوية.
  5. إضافة 1.1 مل SM المخزن المؤقت للأنبوب.
    ملاحظة: سيتم استخدام 1 مل هذا الحل (أي، خليط رد فعل التعبئة والتغليف) لفحص λ الاتحاد-طفرات. سيتم استخدام ما تبقى تيتيرينج.
    1. إعداد المخزن المؤقت SM بخلط 5.8 غ كلوريد الصوديوم، غ 2.0 مجسو4.7H2س، 50 مل 1 م تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، والجيلاتين 5 مل 2% (w/v). إضافة dH2س إلى وحدة تخزين نهائي من 1 لتر، اﻷوتوكﻻف للحد الأدنى 30 تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  6. دوامة الأنبوبة المحتوية على العينة الحمض النووي تم حزمها 10 s في الرايت (فورتيكسينج قوية).
  7. نبض تدور الأنبوب في ميكروسينتريفوجي ومخزن على الجليد حتى جاهزة للاستخدام. إذا كانت العينة لن تستخدم داخل نفس اليوم من التعبئة والتغليف، إضافة 50 ميليلتر من كلوروفورم الواحد مل من الحمض النووي حزم عينة، دوامة بلطف، وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

3-إعداد ثقافة G1250 كولاي البكتيرية

  1. قبل يومين على الأقل من قبل الطلاء، جعل بعض الانتصارات البكتيرية لوحات من G1250 الإشريكيّة القولونية (كولاي) على ألواح أجار TB1-كاناميسين.
    1. إعداد لوحات أجار TB1-كاناميسين على النحو التالي. مزيج أجار كلوريد الصوديوم و 10.0 g ببتون الكازين و 12.0 ز ز 5.0. إضافة مل 800 dH2سين إضافة 1 مل 0.1% هيدروكلوريد الثيامين. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم أو إضافة HCl. dH2س إلى وحدة تخزين نهائي من 1 لتر.
    2. المزيج جيدا والاوتوكلاف للحد الأدنى 30 السماح لتبرد إلى 55 درجة مئوية. إضافة 50.0 ملغ كاناميسين ومزيج. تصب في أطباق بيتري 100 ملم معقمة (20 – 25 مل في الطبق). تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. احتضان لوحات الانتصارات البكتيرية في حاضنة ثابتة 30 درجة مئوية على الأقل 24 ساعة.
  3. يوم واحد قبل الطلاء، تجمع بين 10 مل TB1 السائلة متوسطة 100 ميليلتر من 20% (w/v) مالتوس-1 "مجسو م"4 الحل في أنبوب مخروطي ملولبة عقيمة 50 مل.
    1. إعداد TB1 السائلة المتوسطة كما يلي. ز 5.0 ميكس كلوريد الصوديوم ببتون الكازين ز 10.0، ثم إضافة مل 800 dH2س، 1 مل هيدروكلوريد الثيامين 0.1%، وضبط درجة الحموضة 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم أو HCl. ثم أضف dH2س إلى وحدة تخزين نهائي من 1 لتر، والمزيج جيدا، والاوتوكلاف للحد الأدنى 30 تخزين المتوسطة في الرايت لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
    2. إعداد 20% (w/v) مالتوس-1 م MgSO4 على النحو التالي. مزيج مالتوس 20.0 ز وز 24.6 مجسو4. 7 ح2س، ثم أضف dH2س إلى وحدة تخزين نهائي من 100 مل. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. تطعيم المتوسطة السائل مع العديد من المستعمرات من لوحة الانتصارات البكتيرية باستخدام إينوكولاتينج عقيمة حلقة56.
  5. احتضان ثقافة السائل بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية تهز الحاضنة مع قوي يهز (250 – 300 لفة في الدقيقة).
  6. في يوم الطلاء، الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على ثقافة السائل G1250 في 1,500 س ز لمدة 10 دقيقة على RT بيليه الخلايا البكتيرية.
  7. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من 10 مم MgSO4.
  8. قياس امتصاص من 01:10 إضعاف تعليق خلية في الطول الموجي 600 نانو متر باستخدام جهاز المطياف الضوئي (مثلاً، 100 تعليق خلية ميليلتر + ميليلتر 900 10 مم MgSO4) تجاه الأشعة فوق البنفسجية56.
  9. تمييع تعليق خلية ل التطوير التنظيمي نهائي600 0.5 مع 10 مم MgSO4. إعداد تعليق G1250 كولاي مع OD600 = 0.5 يشار إلى 'ثقافة الطلاء G1250'.
  10. تخزين ثقافة الطلاء G1250 على الجليد واستخدامها ضمن ح 1-2.

4-طلاء العينات من الحمض النووي تم حزمها

  1. كل واحد عينة الحمض النووي تم حزمها، إعداد ستة عشر العقيمة 14 × 100 مم2 الجولة-أسفل أنابيب وستة عشر لوحات أجار TB1. عشرة أعضاء من كل مجموعة ستستخدم للفحص وستة تيتيرينج (ثلاثة لعيار 20)، وثلاثة لعيار 100.
    1. إعداد لوحات أجار TB1 على النحو التالي. ز 5.0 ميكس كلوريد الصوديوم وز 10.0 الكازين ببتون ز 12.0 أجار، ثم أضف مل 800 dH2س، وهيدروكلوريد الثيامين 0.1% 1 مل. ضبط درجة الحموضة 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم أو HCl، وإضافة dH2س إلى وحدة تخزين نهائي للأم 1
    2. المزيج جيدا وتسمح اﻷوتوكﻻف للحد الأدنى 30 الخليط بارد إلى 55 درجة مئوية، ثم صب عليه في أطباق بيتري معقمة 100 مم (20 – 25 مل في الطبق). تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
      ملاحظة: ينبغي إعداد لوحات أجار TB1 مالا يقل عن 24 ساعة قبل الاستخدام.
  2. اليكووت ميليلتر 200 ثقافة الطلاء G1250 في كل أنبوب أسفل المائدة المستديرة.
  3. تيتيرينج، جعل إضعاف 1: 100 عينة الحمض النووي تم حزمها ومزيج جيد من قبل فورتيكسينج (أي، 10 ميليلتر حزم عينة الحمض النووي + ميليلتر 990 SM المخزن المؤقت).
  4. إضافة 20 ميليلتر لتمييع 1: 100 لكل من ثلاثة أنابيب عيار 20.
  5. إضافة 100 ميليلتر لتمييع 1: 100 لكل من ثلاثة أنابيب عيار 100.
  6. للفرز، إضافة 100 ميليلتر من 'غير مخفف' حزم عينة الحمض النووي لكل من أنابيب الفحص عشرة.
  7. معالجة جميع تيتيرينج وفحص الأنابيب (أنابيب 2 × 3 + 10 = 16)، على النحو التالي: مزيج جيد من قبل فورتيكسينج لما يقرب من 10 s، واحتضان ثم في درجة حرارة الغرفة مدة 30 دقيقة للسماح للمضيف كولاي الجسميات فاجيس.
  8. إضافة 2.5 مل TB1 المنصهر المايكرويف أعلى أجار (تبريد إلى 55 درجة مئوية) لكل عيار أو فرز أنابيب، مزيج فورا قبل فورتيكسينج (بلطف)، وسكب عيار مناسب أو فحص لوحات أجار TB1.
    1. إعداد TB1 أجار أعلى كما يلي. ز 5.0 ميكس كلوريد الصوديوم وز 10.0 الكازين ببتون ز 7.0 أجار، ثم إضافة dH 800 مل2o. أضف 1 مل 0.1% هيدروكلوريد الثيامين، ثم ضبط درجة الحموضة 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم أو HCl. وأخيراً، إضافة dH2س إلى وحدة تخزين نهائي من 1 لتر.
    2. خلط جيدا والاوتوكلاف عن 20 – 25 دقيقة تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
    3. قبل الشروع في الاستخدام، تذوب في أجار TB1 أعلى المعدة في فرن ميكروويف، ومزيج جيد، والسماح لتبرد إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي.
      ملاحظة: أعلى TB1 المنصهر وتبريد إضافة إلى محتويات كل عيار أو أنبوب الفحص، وبعد خلط، يسكب في عيار مناسب أو لوحات أجار الفحص TB1.
  9. واسمحوا لوحات الوقوف لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع غطاء أجار لمنع التكثيف.
  10. عكس اللوحات ووضع لوحات الفحص عشرة في حاضنة ثابتة 24 درجة مئوية واحتضان ح 46-48 (أي، شروط انتقائية) ولوحات عيار ستة في حاضنة ثابتة في 37 درجة مئوية واحتضانها ح 24/بين عشية وضحاها (أي، شروط غير الانتقائي).
    ملاحظة: لضمان الجودة وتوحيد النتائج، التحكم المتاحة تجارياً بالعاثية الحلول التي تحتوي على خليط من wildtype ومتحولة الاتحاد مع التردد متحولة المعروفة مطلي جنبا إلى جنب مع عينات الحمض النووي تم حزمها وإدراجها في جميع يعمل الإنزيم56.

5-دراسة عيار ولوحات الفحص لتحديد الاتحاد "التردد متحولة"

  1. بعد 24 ح/بين عشية وضحاها الحضانة عند 37 درجة مئوية، شكلت العد عدد اللوحات في كل من الثلاثة عيار 20 لوحات ولوحات عيار 100. للتعرف أكثر بسهولة لويحات، عقد اللوحة بجوار مربع ضوء أبيض وعلى خلفية داكنة مع غطاء إزالتها (انظر الشكل 2).
  2. جعل حساب متوسط (الوسط) عدد من اللوحات في كل مجموعة من لوحات عيار 20 ولوحات عيار 100 (تريبليكاتي، كل منهما).
  3. اختر عدد متوسط من مجموعة لوحات عيار الذي يقع أقرب إلى المجموعة من 50 – 200 لويحات كل مجموعة لوحة.
  4. حساب إجمالي عدد لويحات فرزهم في لوحات الفحص عشرة على النحو التالي:
    مجموع لويحات فحص = (متوسط عدد من اللوحات في المجموعة المختارة من عيار لوحات ÷ عدد ميليلتر لتمييع تستخدم كل لوح عيار المختار) × معامل تمييع x عدد ميليلتر من حزم عينة الحمض النووي كل فحص لوحة [100 ميليلتر في لوحة] x عدد فحص لوحات [10].
    ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان متوسط عدد لويحات كل لوح في مجموعة لوحات عيار 20 128 وهو الرقم المقابل في مجموعة لوحات عيار 100 478، عدد 128 ستستخدم لحساب العدد الإجمالي لفحص اللوحات ، على النحو التالي:
    (128 ÷ 20) x 100 [عامل إضعاف] × 100 [ميليلتر/لوحة] x 10 [اللوحات] = 640,000
    هذا المكافئ لضرب عدد متوسط من لويحات 5,000 أو 1000، إذا كان يستند متوسط عدد التهم الموجهة إليه من عيار 20 لوحات أو لوحات عيار 100، على التوالي.
  5. بعد حضانة ح 46-48 في 24 درجة مئوية، شكلت العد العدد من اللوحات في لوحات الفحص عشرة (اتبع التعليمات الواردة في القسم 5-1).
    ملاحظة: يتم حساب التردد متحولة الاتحاد بقسمة مجموع لويحات تشكيلها في لوحات الفرز حسب العدد الإجمالي من لويحات فرزهم. باستخدام المثال أعلاه، إذا كان حساب مجموع عدد لويحات في لوحات الفحص عشرة 112، تردد الاتحاد متحولة لهذا العينة من الحمض النووي سيكون 112 ÷ 640,000 = 17.5 × 10-5.

6-التحقق من λ Putative الاتحاد طفرات والتضخيم PCR، وتسلسل الحمض النووي

  1. الأساسية على اللوحة المذكورة مع تلميح بيبيت العقيمة، وتحمل على نطاق وطرد (من بيبيتينج إلى الأعلى وإلى الأسفل) في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة التي تحتوي على 500 ميليلتر من المخزن المؤقت SM العقيمة.
  2. احتضانها لمالا يقل عن 2 ح في درجة حرارة الغرفة، أو في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها، للسماح للجسيمات بالعاثية الوت من أجار سد العجز.
  3. في أنبوب أسفل المائدة مستديرة2 عقيمة 14 × 100 ملم، يخلط 200 ميليلتر للثقافة الطلاء G1250 1 ميليلتر من الحل بالعاثية المسحوقية، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
  4. لوحة العينة باستخدام 2.5 مل من 55 درجة مئوية أعلى TB1 المنصهر أجار واحتضان لوحة عند 24 درجة مئوية ح 46-48 (شروط انتقائية)، كما هو موضح في المقاطع 4.8 – 4.10.
  5. مرة واحدة وقد شكلت لويحات الثانوية، استخدام تلميح ماصة لاختيار بعناية مفردة معزولة جيدا λ التحقق من الاتحاد-البلاك المسخ (تجنب لمس أجار أقل).
    ملاحظة: ريبلاتينج لويحات متحولة المفترضة الاتحاد يخدم غرضين: (ط) طلاء المشغولات الحرفية في بعض الأحيان قد يكون مخطئا للوحات الصغيرة الحجم؛ وقد تتضمن (ثانيا) [اغروس] أساسية مأخوذة من لوحة فحص phage(s) غير متحولة إلى جانب بالعاثية المسخ. ستوفر لويحات الثانوية من ريبلاتينج منخفض الكثافة قالب متحولة غير ملوثة لبكر وتحليل تسلسل الحمض النووي اللاحقة.
  6. نقل اللوحة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على الماء المقطر مزدوجة 25 ميليلتر من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  7. ضع الأنبوبة في الماء المغلي لمدة 5 دقائق.
  8. الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة (18,000 س ز) لمدة 3 دقائق في الرايت
  9. نقل 10 ميليلتر من المادة طافية فورا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديد الذي يحتوي على 40 ميليلتر من PCR mastermix التي هي تركيزات النهائي الكواشف PCR المخزن المؤقت بوليميراز x 1، 10 بمول كل من الإشعال إلى الأمام وعكس، نمول 12.5 لكل دنتب ، و 2.5 يو من بوليميراز الدنا بوليميراز.
    ملاحظة: الإشعال إلى الأمام وعكس كما يلي: 5 '-ككاكاككتاتجتجتاتج-3' (المواقف-68 إلى-50 بالنسبة الاتحاد بدء كودون)-ككتكتجككجاجتجاجتات 5 '-3' (المواقف +345 إلى +365 بالنسبة إلى كودون بداية الاتحاد )، على التوالي.
  10. تضخيم القالب باستخدام المعلمات التالية ركوب: تمسخ 3 دقيقة في 95 درجة مئوية، تليها دورات 30 من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية، 1 دقيقة في 60 درجة مئوية، و 1 دقيقة في 72 درجة مئوية، مع تمديد نهائي من 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  11. تنقية المنتج بكر bp 432 المحتوية على الجينات الاتحاد والمرافقة المناطق باستخدام مجموعات تنقية PCR المتاحة تجارياً، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  12. إجراء تسلسل الحمض النووي باستخدام منصة تسلسل ملائم، وتحليل تسلسل الحمض النووي الناتجة للكشف عن الطفرات في التحوير الاتحاد (انظر الملاحظة أدناه).
    ملاحظة: وهذا يتحقق على أفضل وجه بالمحاذاة مع تسلسل الاتحاد مرجع باستخدام البرمجيات، مثل تي-قهوة تسلسل المستندة إلى ويب الملقم المحاذاة. للحصول على إرشادات حول كيفية استخدام البرنامج، قم بزيارة: http://tcoffee.crg.cat/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

اعتماداً على توزيع البيانات، يتم استخدام اختبارات حدودي أو غير حدودي تحديد أهمية الاختلاف في التردد متحولة الاتحاد بين المجموعات المعالجة والمراقبة (أيفعل مقابل الترددات متحولة عفوية) . يتم إجراء مقارنة الترددات متحولة المستحث الاتحاد عبر مجموعات معاملة مختلفة بشتى (العشوائية) الاختبارات الإحصائية، حسب الاقتضاء. اختبار الهندسة الفوقية آدامز وسكوبيك يستخدم عادة لمقارنة أطياف الطفرات المستحثة وعفوية العام57، على الرغم من أن الاختبارات الأخرى، مثل χ2 اختبار أو "تحليل التباين" (ANOVA)، يمكن أيضا استخدامها لمقارنة تواتر لكل نوع محدد من الطفرات (مثلاً، الانتقال، ترانسفيرسيون، والإدراج أو الحذف) بين أطياف الطفرات المستحثة والتحكم، أو بين مختلف الأطياف الطفرات الناجمة عن مختلف المواد الكيميائية/وكلاء أو جرعات مختلفة من نفس الكيميائية/عامل.

الرقم 3 هو تجميع لبيانات التردد متحولة من الدراسات المنشورة فيها وقد أثبتنا أن مدى الزيادة في التردد النسبي الاتحاد المسخ في الخلايا الليفية الجنينية الماوس تعامل مع المواد الكيميائية المختلفة و/أو فيسيكالاجينتس قد تختلف من بضعة-إلى عدة هوندريدفولد، مطفرة 'فاعلية' مجمع الاختبار. تظهر زيادات حظيرة يعتد به إحصائيا في تواتر متحولة الاتحاد للخلايا الليفية الجنينية الماوس تعامل مع الاكريلاميد12، جليسيداميدي14، aflatoxinB1(AFB1)22،18من تاموكسيفن، Δ-aminolevulinic حمض (δ-علاء) بالإضافة إلى جرعة منخفضة من الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة A (يوفا: λ > 320−400 شمال البحر الأبيض المتوسط)15، بنزو (أ) بيرين ديول epoxide(B(a)PDE)19، وجرعة اكويليثال من فوق البنفسجية، الأشعة فوق البنفسجية (λ = 2 80−320 nm)، ومحاكاة أشعة الشمس "الأشعة فوق البنفسجية" (SSL) 21 (انظر 3 الشكل).

الرقم 4 هو تظاهرة 'التسلسل-خصوصية' الطفرات التي قد أظهرنا التعريفي لأنواع محددة من طفرة في التحوير الاتحاد في موسيمبريونيكفيبروبلاستس المشع مع أوفبريلاتيفيتوكونترول23. يتميز الطيف الطفرات المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية بزيادات كبيرة في التواتر النسبي للتحولات C→T واحد-أو جنبا إلى جنب في دينوكليوتيديس بيريميدين.

Figure 1
الشكل 1: العرض التخطيطي للمقايسة حدد الاتحاد λ. التحليل يستند إلى استرداد ناقلات المكوك λLIZ، التي تحتوي على التحوير الاتحاد كجين مراسل حيث، من الحمض النووي الجينومي لاستزراع الخلايا المشتقة من القوارض المعدلة وراثيا التي تعامل في المختبر مع مجمع لاختبار أو معاملة الأنسجة/أجهزة الحيوانات المقابلة في فيفو باختبار المواد الكيميائية/العامل ( و ب). يتم حزم ناقلات الذين تم إنقاذهم إلى رؤساء بالعاثية λ التي يمكن أن تصيب الأجهزة المضيفة مناسبة كولاي (C و D). ثم تزرع البكتيريا المصابة تحت شروط انتقائية للسماح بتسجيل وتحليل الطفرات في الاتحاد التحوير1،2،3،25، 52 (E). ويرد تحديد التردد متحولة المستحث الاتحاد وإنشاء الطيف الطفرة بتسلسل الحمض النووي في F و G. هي تصور الأطياف الطفرات المستحثة وعفوية في تنسيقات مختلفة. لأغراض التوضيح، ابرزنا بتنسيق التي يتم كتابتها الطفرات المستحثة الاتحاد أعلاه تسلسل المرجعية، بينما الطفرات العفوية (التحكم) يتم كتابتها أدناه تسلسل إشارة (H). ويمثل ارتفاع قاعدة تحور ما تردد الطفرات (أي، أعلى قاعدة، تحور أكثر تواترا). تشير الأرقام أعلاه قاعدة تحور إلى تواتر نسبة الطفرات في تلك القاعدة. حذف القواعد تحتها. وترد القواعد المدرجة مع سهم. الأرقام أدناه الأسس مرجعية المواقف النوكليوتيدات. بيانات مأخوذة من دراسة نشرت23. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: عد لويحات في لوحات عيار. بسهولة تحديد لويحات، تعقد لوحات بجوار مربع ضوء أبيض وعلى خلفية داكنة مع إزالة الأغطية. لوحة 100 عيار وعيار 20 لوحة (أ) (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: ترددات المسخ من التحوير الاتحاد في الخلايا الليفية الجنينية الماوس تعامل مع مختلف المواد الكيميائية و/أو العوامل الفيزيائية بالمقارنة مع عناصر التحكم. بيانات مأخوذة من الدراسات المنشورة على الاكريلاميد12، جليسيداميدي14، aflatoxinB1(AFB1)22، تاموكسيفين18، δ-aminolevulinic حمض (δ-علاء) بالإضافة إلى جرعة منخفضة بضوء الأشعة فوق البنفسجية (UVA: λ > 320−400 شمال البحر الأبيض المتوسط)15، benzo(a) إيبوكسيد بيرينيديول (B(a)PDE)19، وجرعة اكويليثال من فوق البنفسجية، الأشعة فوق البنفسجية (λ = 280−320 نيوتن متر)، ومحاكاة أشعة الشمس "الأشعة فوق البنفسجية" (SSL)21. على كفاءة استقلاب تاموكسيفين في الخلايا الجنينية تنتجها الخلايا الليفية الماوس، استخدمنا S9-تفعيل النظام (ميكس S9) تتكون من الاستعدادات التي يسببها 1,254 أروكلور الجرذ الكبد ومساعد الكواشف22. تعامل جميع الخلافات بين--وعينات مراقبة يعتد به إحصائيا في ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الطفرة الأطياف من التحوير الاتحاد في الخلايا الليفية الجنينية الماوس المشع مع الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة لعنصر التحكم- بيانات مأخوذة من دراسة نشرت23. يتم الجمع بين النظراء مرآة حبلا من جميع التحولات (مثلاً، G→A و C→T) وترانسفيرسيونس (مثلاً، G→T و C→A أو G→C و C→G). الأدوات: الإدراج؛ ديل: الحذف. يتميز الطيف الطفرات المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية بزيادات كبيرة في التواتر النسبي للتحولات C→T واحد-أو جنبا إلى جنب في دينوكليوتيديس بيريميدين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم استخدام الفحص حدد الاتحاد λ للكشف عن الطفرات في التحوير الاتحاد ضبطت المجينية الحمض النووي للخلايا المشتقة من الأجهزة/أنسجة القوارض BB3. جينوم هذه الحيوانات المحورة وراثيا يحتوي على نسخ متعددة جنبا إلى جنب ناقل المكوك λLIZ تشروموسومالي المتكاملة، الذي يحمل الاتحاد (294 bp) وﻻسي (1,080 bp) المتسلسلات، ك الجينات مراسل حيث1، 2 , 25-مقايسة حدد الاتحاد λ يستند إلى استرجاع ناقلات المكوك λLIZ من الحمض النووي لخلايا/أنسجة الحيوانات المحورة وراثيا، متبوعاً بالتعبئة والتغليف لناقلات المرض الذين تم إنقاذهم إلى رؤساء بالعاثية λ التي يمكن أن تصيب الأجهزة المضيفة مناسبة كولاي. وفي وقت لاحق، تزرع البكتيريا المصابة تحت شروط انتقائية للسماح بتسجيل وتحليل الطفرات في التحوير الاتحاد (انظر الشكل 1)1،3. وقد استخدمت على نطاق واسع المقايسة حدد الاتحاد λ المحدثة للطفرات في اختبار لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية و/أو العوامل الفيزيائية (إعادة النظر في الإشارات2،49). المقايسة طبقت بنجاح للماوس/الفئران المعدلة وراثيا خلية الثقافات تعامل في المختبر مع مختلف المواد الكيميائية و/أو العوامل الفيزيائية، والأنسجة/أجهزة الحيوانات المقابلة التي عولجت في فيفو اختبار مختلفة المواد الكيميائية/وكلاء4،5،،من67،،من89،10،11،12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

مقايسة حدد الاتحاد λ في الخلايا المستزرعة من القوارض المعدلة وراثيا تعامل مع اختبار مجمع يمثل، من نواح عديدة، بديل قابل للتطبيق في فيفو التجارب المحدثة للطفرات في المقابل الحيوانات تعامل مع المواد الكيميائية/عامل اختبار 3-كقاعدة عامة، تقدم النماذج في المختبر مزايا هامة أكثر من نظيرتها في فيفو نماذج حيوانية، كما أنها أقل بكثير من عمالة مكثفة ومكلفة، تتطلب أقل بكثير من الوقت لإكمال، والأهم من ذلك، لا تنطوي على الاستخدام المباشر للحيوانات2،،من5052. في الوقت نفسه، النماذج في المختبر قد لا تماما الخص جميع جوانب الطفرات بسبب الاختلافات في خصائص الحرائك الدوائية وميكروبيولوجية للمواد الكيميائية بين الخلايا المزروعة في المختبر والحيوانات التجريبية في فيفو 2 , 3. على سبيل المثال، المواد الكيميائية التي مسار التعرض استنشاق (مثلاً، بخار السجائر الإلكترونية أو دخان السجائر) يمكن فقط إجراء قابلة في المختبر التجارب في الثقافات الخلية بعد يتم تحويلها من غاز أو بخار أشكال للسائل أو المكثفات، التي يعقد بها الدوائية. أيضا، عدم اكتمال أو غياب القدرات الأيضية للخلايا المزروعة في المختبر لتحويل بعض المواد الكيميائية في الأنواع المتفاعلة الحمض النووي قد لا تمثل الحمض النووي-الأضرار مدفوعة المحدثة للطفرات في الحيوانات المعرضة في فيفو لمواد كيميائية سمية جينية2 ،3. على الرغم من ذلك، يجوز التعويض عن هذا العيب، بدرجات متفاوتة، خلية النظام (أي، مزيج S9) في المختبر بإضافة التنشيط الأيضي الخارجية نماذج الثقافة22.

وعلاوة على ذلك، النسخ المتماثل من واقع الحياة تعرض الإنسان للمواد الكيميائية السمية الجينية/وكلاء أكثر محدودية في المختبر خلية الثقافة نماذج من الحيوانات التجريبية في فيفو3. وبصفة عامة، التي يتعرض لها البشر لجرعات مزمنة من عوامل سمية جينية على مدى عدة سنوات لبضع عقود76،،من7778. يجعل عمر محدود من الخلايا في الثقافة، بالمقارنة مع عمر أطول نسبيا من القوارض (أي، أيام/أسابيع مقابل بضع سنوات) نمذجة التعرض البشري جينوتوكسينس أكثر تحديا في النماذج السابقة2، 3. ومع ذلك، يمكن أن توفر التحليل المحدثة للطفرات في المختبر خلية ثقافة نماذج مؤشرا أولياً لإمكانات سمية جينية لمادة كيميائية معينة/(المحليون)، والنتائج التي يمكن استخدامها كدليل لتصميم التجارب 'الصافية' في فيفو تتميز 'خفض' عدد الحيوانات2،3.

وفي الختام، مقايسة حدد الاتحاد λ في الخلايا المستزرعة من القوارض المعدلة وراثيا تعامل مع اختبار مركبة، أو الحيوانات المقابلة تعامل مع اختبار المواد الكيميائية/العامل، نهجاً قيماً لاختبار المحدثة للطفرات. ونحن قد استخدمت بنجاح النهج، كما أن المجموعات البحثية الأخرى في جميع أنحاء العالم4،5،6،،من78،9،10، 11،،من1213،14،15،16،17،،من1819، 20،21،،من2223،24،34،،من5859،60، 61،62،63،،من6465،66،،من6768،69، 70،71،،من7273،،من7475. في الآونة الأخيرة، قمنا بتوسيع تطبيقات هذا النهج بتطوير تقنية جديدة التي تمكن تعديل المقايسة حدد الاتحاد λ جنبا إلى جنب مع الجيل التالي تسلسل تحليل الإنتاجية العالية من الطفرات في وقت-، التكلفة، وطريقة العمل-اعتبارا من23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

كافة الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نعترف بالمساهمات من جميع الزملاء والمتعاونين لدراساتنا الأصلي، أحيلت نتائجه في هذه المخطوطة (لأغراض توضيحية). دعم عمل المؤلفين من المنح المقدمة من المعهد الوطني لطب الأسنان والبحوث إحضارهما "المعاهد الوطنية للصحة" (1R01DE026043) على أساسها، ومن جامعة California Tobacco-Related برنامج بحوث الأمراض إلى AB ( TRDRP-26IR-0015) وشارع (تردرب-25IP-0001). وكان مقدمو الدراسة أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليل البيانات، وتفسير البيانات وكتابة التقرير، أو في قرار يقدم للنشر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828 (2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116 (2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 134، عاثية، الاتحاد التحوير، الجنينية الماوس الليفية، EMF، والطفرات، "ناقل المكوك"
"حدد أمداً" <em>الاتحاد</em> "نظام الكشف عن الطفرات"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Besaratinia, A., Tommasi, S. The… More

Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter