Summary
Ионы калия способствует покоя мембранного потенциала клеток и внеклеточной концентрации K+ является регулятором важнейших клеточных возбудимости. Мы опишем, как сделать, калибровки и использовать монополярной K+-селективный микроэлектродов. Использование таких электродов позволяет измерение электрически вызвала динамика концентрации K+ в взрослых срезах гиппокампа.
Abstract
Ионы калия значительный вклад покоя мембранного потенциала клеток и, таким образом, внеклеточной концентрации K+ является важным регулятором возбудимость клеток. Изменены концентрации внеклеточного K+ влияют покоя возбудимости потенциал и клеточные мембраны, сдвигая равновесие между закрытые, открытые и инактивированных государствами для напряжени тока зависимых ионных каналов, которые лежат в основе потенциал действия инициирование и проведение. Следовательно это ценный непосредственно измерить внеклеточного K+ динамика в области здравоохранения и государства в больными. Здесь мы опишем, как сделать, калибровки и использовать монополярной K+-селективный микроэлектродов. Мы развернули их ломтиками взрослого мозга гиппокампа для измерения электрически вызвала динамика концентрации K+ . Разумное использование таких электродов является важной частью инструментария, необходимых для оценки сотовой и биофизические механизмы, которые управляют внеклеточной концентрации K+ в нервной системе.
Introduction
Концентрации ионов калия жестко регулируется в головном мозге, и их колебания оказывают мощное влияние на мембранного потенциала покоя всех клеток. С учетом этих критических взносов важная цель биологии является определить сотовой и биофизические механизмы, которые используются жестко регулировать концентрацию K+ в внеклеточного пространства в различных органах тела1 , 2. важным требованием в этих исследованиях является способность точно измерить концентрации K+ . Хотя многие компоненты, которые способствуют калия гомеостаза в мозге в здоровых и больных государства были определены3,4,5, далее прогресс замедлился ввиду специализированного характера подготовка выборочной микроэлектродов иона калия измерения. Микроэлектродные датчики представляют собой золотой стандарт для измерения K+ концентрации в пробирке, фрагменты тканей и в естественных условиях.
Новые подходы для K+ мониторинга находятся в стадии разработки, с помощью оптических датчиков, однако они не обнаружить концентрации биологически соответствующий диапазон K+ или у не были проверены полностью в биологических системах, хотя первоначальные результаты появляются многообещающие6,,78. По сравнению с оптическими датчиками, микроэлектродов принципиально ограничены для измерения точки источника ионов, хотя массивы электродов может улучшить пространственное разрешение9. Эта статья сфокусирована на сингл бочковая микроэлектродные датчики для мониторинга динамики K+ .
В этой работе, мы докладе подробные ступенчатой процедуры сделать K+ селективный микроэлектродов, используя ionophore на основе valinomycin калия, который позволяет весьма избирательно (104 раза K+ к избирательности Na+ ) K+ движение через мембраны10. Естественно-происходя полипептид, valinomycin действует как K+ проницаемых поры и облегчает стекают K+ электрохимических градиента. Мы также описывают, как для калибровки электродов, как хранить и использовать их и, наконец, как развернуть их для измерения K+ динамика концентрации в кусочки острый гиппокампа мозга от взрослых мышей. Использование таких электродов вместе с генетически измененных мышей, которые не имеют конкретных ионных каналов, предлагается регулировать внеклеточного K+ динамика должна выявить клеточных механизмов, используемых нервной системой для управления окружающего концентрация K + в внеклеточной окружение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Национальный институт здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных и были утверждены Комитетом исследований животных канцлера университета Калифорнии, Лос-Анджелес. Все мыши были размещены с продуктов питания и воды доступны ad libitum в среде свето тени 12 h. Все животные были здоровыми без очевидных поведенческих изменений, не участвовали в предыдущих исследованиях и были принесены в жертву во время свет цикла. Данные для экспериментов были собраны от взрослых мышей (6-8 недель для всех экспериментов).
1. Подготовка выборочного микроэлектродов K+
- Silanization боросиликатное стекло
- Извлеките достаточно стеклянные капилляры из упаковки и положите в 50 мл Конические трубки. Заполните Конические трубки к началу 1 М HCl. мыть электродов с нежным агитации в одночасье HCl или как минимум 6 часов.
- Кратко промыть капилляров с 70% этанола и затем высушить полностью на 100-120 ° C для 6-8 часов. Храните промывают капилляров в контейнерах с осушителем сульфат безводный кальций на срок до 4 недель до дальнейшего использования.
- До silanization натягивают капилляров штрафа отзыв с помощью съемника микроэлектродные. Микроэлектродов, которые мы используем, примерно 2-5 микрон в диаметре. Всегда обрабатывайте промывают капилляров с перчатки, как масла из кожи может мешать silanization.
- Место микроэлектродов в стеклянной посуде, таким образом, чтобы электроды повышаются снизу для предотвращения поломки подсказка. Исправьте микроэлектродов к контейнеру с помощью автоклавируемый ленты или аналогичных клейкой лентой.
- Удаление приблизительно 0,5 мл раствора silanization 5% dichlorodimethylsilane (DDS) из его контейнера, с помощью метода замены азота (см. Рисунок 2). Заполнить баллон с газом азота и присоединить шприц или трубки и иглы в шар. Вставьте иглу в контейнер DDS при оформлении DDS в отдельном шприц через больше иглы.
- Применять раствор silanization каплям советы пипетки и немедленно покрытия. Поместите контейнер, содержащий микроэлектродов раствором silanization в подогретым Печи лабораторные (170-180 ° C) для 10-12 часов, или на 200-220 ° C за 30 минут
- После инкубации Выключите духовку и затем удалить пластину из духовки. Будьте осторожны при удалении пластину из инкубатора, как это очень жарко. Место пластину на скамейке при комнатной температуре за 10-15 минут, чтобы позволить посуда для охлаждения.
- Удаление микроэлектродов от пластины (с помощью лезвия или лезвия скальпеля для перерезал ленту) и поместите их в осушитель заполненные герметичном контейнере. Silanized микроэлектродов оставить свободной влаги может использоваться до 1 недели после silanization.
- Грунтовка электродов
- Подготовить Стоковый раствор K+ ionophore коктейль: 5% w/v valinomycin, 93% v/v 1,2-диметил-3-нитробензола, 2% w/v калия tetrakis(4-chlorophenyl) Борат11. Это решение является слабый желтый цвет. Храните в герметичном, непрозрачный контейнер при комнатной температуре. Если правильно хранить это решение может длиться несколько месяцев.
- Подготовьте раствор 10 мм HEPES 300 мм NaCl при рН 7,4 в буфер. Исправьте электрода в зажим и обратной засыпки с буферизованного NaCl, используя кончик Микрофилл 28G, подключенных к шприцу. Отмечают, что физиологический раствор, достиг конца кончик микроэлектродные. Убедитесь, что микроэлектродные бесплатно большие пузыри, которые могли бы препятствовать ток.
- Разорвать наконечник электрода для приблизительно 10-20 мкм, используя тупой стороной скальпелем или лезвием бритвы.
- С помощью микропипеткой, применять небольшие капельки (~0.1 мкл) K+ ionophore возле кончик микроэлектродные. Если электрод был должным образом silanized капли будет поглощена в сломанной кончик. Заполнения электрода для 1-2 мм с ionophore K+ и удалить излишки с помощью папиросной бумаги.
2. Калибровка селективного микроэлектродов K+
- Приготовление калибровочных растворов
- Подготовка решений различных концентраций KCl в равных осмолярности, искусственные спинномозговой жидкости (ФАГО), заменив NaCl с KCl. Мы использовали 0.1, 1, 4.5, 10 и 100 мм K+ фаго, для калибровки электродов. Рецепты для решения этих калибровки, перечислены в таблице 1.
| Химическая | МВТ | Окончательный мм | 0,1 мм [K +] | 1 мм [K +] | 4.5 мм [K +] | 10 мм [K +] | 100 мм [K +] |
| (г / моль) | |||||||
| NaCl | 58,44 | варьируется | 1.51 g | 1.50 g | 1,44 г | 1.4 g | 0,345 г |
| ДКК | 1 М складе | варьируется | 20 мкл | 200 мкл | 900 мкл | 2 мл | 20 мл |
| CaCl2 | 1 М складе | 2 | 400 мкл | ||||
| 2 MgCl | 1 М складе | 1 | 200 мкл | ||||
| NaH2PO4 | 119.98 | 1.2 | 0.29 g | ||||
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 0,437 g | ||||
| D-глюкоза | 180.16 | 10 | 0,360 g | ||||
| Воды | q.s. 200 мл | ||||||
Таблица 1. Решения для калибровки калия
- Микроэлектродные калибровка
- Пузырь все решения с 95% O2/5% CO2 по крайней мере 20 минут до начала эксперимента. Начать perfusing Ванна с 4,5 мм [K+] фаго со скоростью 3 мл в минуту. Поместите K+ селективный электрод в держатель электрода, придает headstage электрода на манипулятор. Этот headstage подключен к соответствующей усилителя. Вставьте наконечник электрода в perfusate баня.
- Обеспечение Ag/AgCl электродов земли купается в том же решении и что устойчивый поток. Применить калибровочные растворы на основе поэтапного и запишите потенциальные изменения в mV через электрода. Подождите потенциал на электрода для достижения стабильного значения перед переходом к следующему решению
- Измерьте изменение напряжения устойчивое состояние в ответ на применение калибровочные растворы электрода. Убедитесь, что наклон электрода ответ по крайней мере 52 и не более чем 58 МВ в журнал изменений в [K+].
3. Подготовка фрагментов острых гиппокампа мозга
- Подготовка решений ломтик
- Подготовка 500 мл сахарозы резка решение состоит из: сахароза 194 мм, 30 мм NaCl, 4,5 мм KCl, 10 мм D-глюкоза, 1 мм MgCl2, 1,2 мм NaH2PO4и 26 мм NaHCO3, 290-300 мОсм, насыщенных с 95% O2 и 5% CO2.
- Подготовка 1-2 литра раствора (ФАГО) запись состоит из: 124 мм NaCl, 4,5 мм KCl, 1 мм MgCl2, 10 мм D-глюкоза, 2 мм CaCl2, 1,2 мм NaH2PO4и 26 мм NaHCO3; pH 7,3-7.4 (после восходящей), 290-300 мОсм, насыщенных с 95% O2 и 5% CO2. Заполнить стакан, содержащий мозга ломтик держатель камеры с записью решение и держать его на 32-34 ° C. Заполните vibratome камеры с ледяной воды слякоть.
- Подготовка острый срез
- Глубоко анестезировать мыши, поместив его в колпаке, заряжен с 2-3 мл изофлюрановая. Проверьте для ног щепотку рефлекс и если не отвечают, быстро обезглавить его с помощью пару острых ножниц или гильотинные как животных протокол требует.
- Сделайте 2-3 см разрез, используя ножницы из хвостовой части черепа отрезать головы вдоль средней линии. Хотя вручную втягивать кожу головы, сделайте два горизонтальных разрезов 1 см от затылочного по бокам черепа. Затем, с помощью тонкой ножницы, разрез длина реза черепа, вдоль средней линии от задней части черепа в нос.
- С помощью тонкой щипцы, вставлены рядом срединной, отозвать резаная черепа в двух частях. Извлечь мозга мыши из черепа и использовать лезвие для удаления мозжечка и обонятельные луковицы, которые соответственно расположены в хвостовой и ростральной части мозга. Это может быть идентифицирован большие трещины, которые отделяют их от коры.
- Смонтируйте блок мозга на vibratome лоток с помощью супер клей. Заполните vibratome лоток с ледяной резки решения.
- Вырежьте из разделов ткани на корональных плоскости на 300 µm толщиной. Обычно 6 корональных гиппокампа фрагменты могут быть собраны.
- После каждого раздела режется, немедленно передать ломтики срез, холдинг стакан, нагретой до 32-34° C. Сохранить разделы при этой температуре 20 мин перед удалением стакан, содержащий разделы и место это при комнатной температуре для по крайней мере 20-30 минут до начала записи.
4. Измерение динамики электрически вызвала K+
- Настройка подготовки фрагмента
- Осторожно поместите Ломтик мозга в ванне с помощью пипетки Пастера и осторожно удерживать его на месте с платиновым арфы с нейлоновой струны.
- Обеспечьте советы биполярного электрода стимулирования параллельны друг другу и уровне с плоскостью среза. Медленно в течение 6-7 секунд, вставьте электроды CA3 пласт radiatum около 40-50 мкм глубоко, чтобы стимулировать Шаффер коллатералей. В корональных секций CA3 примерно определяться как части гиппокампа надлежащего сбоку слоя клеток гранул в гиппокампе genu, с radiatum пласта, падение медиальной и брюшной слоя пирамидальных клеток.
- Осторожно вставьте K+-селективный электрод в СА1 пласт radiatum около 50 мкм глубокие, снижая электрод медленно над примерно 3-4 секунды. Разрешить потенциал стабилизации через электрод перед применением стимуляцию на срез: обычно это занимает 5-10 минут. Если фрагмент экспонатов спонтанного изменения внеклеточного K+ затем отменить и повторить этот процесс с новым фрагментом.
- Мера вызвала релиз K+
- Примените поезда электростимуляции (8 импульсов), вручную удручает триггер стимулятор при цифровой записи ответов. Примените стимуляции на 10 Гц и 1 мс импульса, начиная 10 µA стимул амплитуды.
- Применить увеличение амплитуды стимуляции, 2 раза, до обнаружения максимальная амплитуда ответа K+ . Если вы не видите никакого ответа, переместите позицию K+ электрода ближе к месту стимуляции в 100 мкм с шагом
- Определите амплитуды стимул, который производит половину максимального реагирования. По нашему опыту это между 40-160 МКА, в зависимости от качества подготовки, возраст животного, и расстояние между электроды стимуляции и селективный электрод K+ .
- В же фрагмента, используя амплитуда стимул на один шаг меньше амплитуды, которая производит половину максимального реагирования (например если 80 МКА производит половину максимальные ответ, используйте 40 МКА) применять поезда стимулом увеличения числа импульсов. Первоначально мы использовали поезда 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 и 128 импульсов.
- Чтобы подтвердить, что K+ сигналы являются посредничестве потенциал действия стрельбы электрически стимулировали ванны коллатералей Шаффер, применяют 0,5 мкм TTX в фаго 10 минут и повторите протокола стимуляции. Не вызвала ответы должны соблюдаться.
- После окончания эксперимента срез, подтверждают электрода сохранил свою чувствительность путем повторной калибровке электрод в калибровочные растворы и обеспечение ответ не отошел на более чем 10% от первоначальных калибровки
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для селективного измерения внеклеточного K+мы подготовили ионоселективного микроэлектродов, покрытые гидрофобные слоя через silanization чистой боросиликатного стекла пипеток (рис. 1A). Это покрытие позволяет ionophore K+ , содержащих valinomycin отдых на кончике электрода и разрешить только K+ потока через узкое отверстие в электрода (рис. 1B). После грунтования электродов с засыпана физиологический раствор и ionophore K+ , электроды могут быть проверены для их быстрого и линейные ответ поэтапного изменения концентрации K+ ванна (Рисунок 3А) и их реакции на Ванна K+ изменяется в диапазоне калибровки (рис. 3B) в соленой или фаго образом предсказанные с помощью уравнения Нернста2. Изменения в стационарном состоянии потенциальных можно заговор против Ванна концентрации K+ для того чтобы определить наклон линии, которая приблизительно должна 58,2 МВ в журнал [K+], по словам Уравнение Нернста и не менее 52 МВ на вход [K+] (рис. 3 c). Мы дополнительно проверили реакции селективного электрода K+ и обнаружил, что они ответили на 5,5 мм изменение K+ с подъем и упадок константы времени приблизительно 85 мс (Рисунок 3D,E).
Электрофизиологические запись состоит из стандартных вертикальном микроскопа, подключенных к ЖК-дисплей для определения размещения стимулирования и записи электродов. Нет специальной оптики необходимы для размещения визуальных K+ и электроды стимуляции; Мы используем 5 x или 10 x объектив и белый свет от Лампы галогенные, но вместо него может использоваться белый светодиод. Стимулирования электрода подключен к выходу изолятора стимул, который поставляет расшатывания текущей через приурочен доставку импульсов от стимулятором или другие такие устройства. Другими словами стимулятор поставляет поезда 2 V, 10-20 Гц импульсов времени стимул изолятор. После получения эти импульсы, изолятор стимул затем обеспечивает требуемый ток к электродам стимуляции. Запись электрода подключен к держатель электрода, подключен к headstage, усилитель и A/D Совета, которым интерфейс для ПК с электрофизиологических записи программного обеспечения (рис. 4A). После того, как успешно откалиброван электрода и острых фрагментов были подготовлены, срез могут быть размещены в фаго perfusate. Чтобы стимулировать Шаффер коллатералей, K+-селективный электрод помещается в пласт radiatum СА1 и электрод стимуляции поле помещается внутри CA3 (рис. 4В).
После того, как были размещены электроды и запись K+ достиг стабильной базовой линии, затем импульсы повышения амплитуда тока могут быть применены к ломтик (рис. 5, сверху). Волны этой деятельности появляется как быстрый рост в K+ с скорость экспоненциального распада, который отменяется с применением TTX (рис. 5, внизу).
Рисунок 1 : Схема silanization реакции и архитектуры селективного микроэлектродные K+ . A. схематическое представление silanization реакции, которая происходит между подвергаются полярных гидроксильных групп боросиликатного стекла и silanization реагент dichlorodimethylsilane (DDS). Эта реакция оказывает на поверхности стекла гидрофобной, который позволяет ionophore K+ для формирования тонкой мембраны. B. схема селективного микроэлектродные K+ . Электрод является заполнены раствором и выборочного решения K+ место в слое толщиной 1-2 мм на кончике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схема добычи DDS. Схематическое представление процедуры замены азота для DDS извлечения из контейнера. DDS летучих и легковоспламеняющихся и может реагировать яростно с атмосферными газами, когда это в высоких концентрациях, поэтому это необходимо заменить DDS, удалены с инертной азот. Воздушный шар, заполненный азотом подключен к иглой через шприц или соответствующие трубы. Эта игла вводится через герметика на контейнере, позволяя потока газа (N2) азота в контейнер. Отдельно иглы длиной (3-10 см) подключен к 1 мл шприц и вставить в контейнер. Затем этот шприц используется для извлечения DDS, в то время как только газ азот можно ввести контейнера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Калибровка микроэлектродов. A. Ванна перфузии применение различных концентраций K+ в солевой раствор может быстро и обратимо производят Nernstian изменения в потенциал через электрода. B. поэтапного применения K+ фаго вызывает характерный и стабильные изменения в потенциале наконечник электрода. C. участок изменения mV селективного электрода K+ в ответ на повышение концентрации K+ в четырех электродов; R2 -0.9995 для этих четырех электродов. D. Быстро перфузии применение системы баня 10 мм K+ вызывает ответ шаг в напряжения через селективного электрода K+ . E. график измеренных ответа раз (Тау в мс); было обнаружено никакой разницы между время подъем и упадок (означает ± SEM, p = 0.939, два образца t-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Аппарат для измерения внеклеточного K+ . A. состоит из микроскопом фиксированной антивибрационные таблицу с подключенной камеры и ЖК-дисплей для ломтик визуализации электрофизиологии. K+ электродами крепится к headstage, усилитель и аналого-цифровой Совет, который выводит сигнал прилагаемый ПК с электрофизиологических записи программного обеспечения. Электрическая стимуляция электроды подключены к изолятор стимул, который зависит от амплитуды стимуляции и стимулятором для сроков доставки стимула. B. схема подготовки фрагмента и места размещения различных электродов на срез. CA3 примерно определяться как части гиппокампа надлежащего сбоку слоя клеток гранул в гиппокампе genu, с radiatum пласта, падение ростральной слоя пирамидальных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Измерение электрически вызвала релиз K+ . Представитель следы K+ освобождение от записи электрода в базальных условиях (вверху) и их потери по заявлению Тетродотоксин (0,25 мкм) за 5 минут до записи (внизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, который мы здесь описывать позволила нам оценить динамику K+ в ответ на электрической стимуляции Шаффер залогов в острой срезах гиппокампа от взрослых мышей. Наш метод подготовки K+ Ион селективного микроэлектродов похож на ранее описанные процедуры12,13,14,15. Однако этот метод имеет преимущества по сравнению с альтернативными электрод конфигурации в том, что это быстрый и несложный подготовить выборочный микроэлектродов K+ . После соответствующей калибровки эти электроды были найдены надежно измерить K+ динамика в ломтики во время электрической стимуляции, и такие ответы были заблокированы TTX. В этих экспериментах использовались стимуляцию 80-160 uA на 10 Гц; Однако потребуется оптимизация условий стимуляции для конкретного эксперимента и мозг области интереса. Эти значения перечислены в качестве руководства.
Наклон реакции электродов должны быть 58,2 МВ в журнал [K+]. Такое значение предсказывается из уравнения Нернста и Nicolsky-Айзенмана для селективного полупроницаемой мембраной K+ ; последний лучше счетов для взаимодействия между ионами16. Если электрод не отвечает прогнозируемым образом, это может быть одной из двух основных причин. Сначала silanization могут быть неадекватными, вызывая мембраны быть потеряны или соли мосты к форме. Подтвердите что мембраны неповрежденными наблюдения через микроскоп, должны существовать четкие взаимосвязи между пипетки решений и мембраны. Другой причиной может быть наличие пузырьков в пипетку, которые препятствуют потока текущего из хлорида серебра проволоки. Если наблюдаются пузырьки, затем удалите пипетки и проведите энергично, чтобы удалить их. Если эти решения не, повторно сделать другой селективный электрод K+ или повторить silanization для больше или при более высоких температурах. Однако важно повторить эти ключевые элементы управления, каждый раз, когда учился в новый регион мозга или испытания нового микроэлектродные.
В этих экспериментах использовались две конкретные усилители, но другие усилители могут быть использованы до тех пор, как входной импеданс больше или равна 500 MΩ. Калибровки электродов с 500 MΩ и 5 GΩ входного сопротивления, мы обнаружили, не было разницы в склоне напряжения ответ с либо параметр над диапазон K+ концентрации (56,9 МВ ± 0,7 и 56,5 ± 0,9 за десятикратное изменение в [K+ < / C1 >] для 500 MΩ и 5 GΩ входных сопротивлений, соответственно; P = 0,759, паре t-теста, n = 4 электродов).
Мы также использовали выключатели быстрое решение оценить время отклика электродов к известным прыжок в [K+] от 4.5 до 10 мм (Рисунок 3D). Электроды ответил с подъем и упадок раз (Тау) 85 ± 12 и 85 ± 15 мс, соответственно. В связи с этим, кинетика обмен решение для наших пользовательских быстрое решение свитчер был 85 ± 27 г-жа следовательно, селективного электрода K+ с кинетики так же быстро, как переключатель решения, которые мы использовали и реагировать гораздо быстрее, чем динамика K+ в Внеклеточные окружение в результате Шаффер залога стимуляции (рис. 5). Эти данные позволяют предположить, что селективного электрода K+ может использоваться для оценки кинетики накопления K+ и оформления в ткани мозга. Однако, в будущем работа надлежащего контроля и калибровки необходимо будет на-на индивидуальной основе. Мы предлагаем, что это ценный тратить время понимание кинетики обмен решение в вашей записи камеры.
Мы нашли три критически важных факторов, которые влияют на качество и надежность измерений K+ ломтиками. Во-первых, качество подготовки, ткани здоровья и возраста животных, используемых, как представляется, быть соответствующим. Для этого исследования мы использовали мышей C57/Bl6N, которые являются ~ 12 недель. В редких случаях мы нашли фрагменты с спонтанное K+ колебания в размере ~0.1 мм и продолжительностью 5-10 секунд; Эти фрагменты были удалены. Во-вторых, качество записи микроэлектродные. Основная проблема-это время и температуру, которая используется для silanization вытащил стеклянный капилляр. Мы рекомендуем > 170 ° C для по крайней мере 6 часов (до ночлега приемлемо) или 200 ° c за 30 минут. Недостаточное Отопление электродов с silanization реагент может привести к электродов, которые не поддерживают стабильного состояния потенциал из-за постепенной потери ionophore K+ . Кроме того при подготовке электродов, мы рекомендуем размещение тонким слоем (1-2 мм) ionophore K+ в наконечник диаметром 10-20 мкм, т.е. на приблизительно размер средний клеток тела (рис. 1B). Не нарушают чрезмерно широкий кончик или селективного мембраны K+ теряет целостность и электрода завершится ошибкой. Этот шаг может потребовать некоторой практики для достижения советы правильного размера. K+ селективный электроды с наконечником, слишком тонкой или слишком толстого слоя может иметь вялые реакции, по сравнению с правильно построенный электродов. Третьим фактором является расстояние между электрод стимуляции и селективный электрод K+ . Мы использовали межэлектродный расстояние приблизительно 500 мкм, однако оптимальное расстояние может значительно изменяться с области отдельных мозга и необходимо будет тщательно рассмотреть для конкретного эксперимента под рукой.
В дополнение к конфигурации одного барреля, в настоящее время существует несколько методов для изготовления K+-селективный микроэлектродов биполярного и концентрические форматов17. По сравнению с опубликованной описания этих методов, одноканальный электроды имеют два основных недостатка: 1) чуть больше диаметра кончика (~ 10 против 4 мкм), который может привести к большей срыв внеклеточного пространства comparted биполярного и концентрические Электроды и 2) несовместимость с одновременное измерение нескольких видов Ион как биполярного электрода. Однако один канал электроды имеют ряд преимуществ. В частности, эти электроды могут быть изготовлены в менее чем пяти минут и поэтому являются более одноразовые и могут быть сделаны и калиброванные быстро до экспериментов. Таким образом риск поломки электрода в ходе экспериментов курс меньше беспокойства. Кроме того потому что земли электрода и электродом записи физически разделенных объем ванны, нет никаких шансов для формирования мостов соли на кончике электродом, который может привести к недостаточности электрода в концентрические и биполярный электроды. Время отклика электродов один канал работает быстрее, чем биполярных электродов и вероятно, сопоставимые с концентрической электродов (~ 20 мс), хотя наш быстрый перфузии системы разрешается только измерение времени отклика порядка 80 мс (Рисунок 3E ). Кроме того эти электроды предлагают более низкий уровень шума по сравнению с биполярных электродов, которые имеют большее сопротивление наконечник и требуют использования усилителей с выше входного сопротивления. Наконец эти электроды не требуют использования специализированных микроманипулятор или headstage, как это требуется для концентрических электродов. На балансе преимущества строительства и простота использования одного канала электродов перевешивают недостатки.
Подход, который мы здесь используется для измерения K+ динамика в ломтики может использоваться во многих регионах мозга для изучения правил K+ . Хотя этот протокол показывает использование K+-селективный электроды для измерения динамики ионов калия электрически вызвала в мозг тканей, этот протокол может широко использоваться во многих различных тканях где желательно Измеряйте динамику K+ . Такие ситуации могут включать спонтанное динамика и изменения в ответ на фармакологические, optogenetic, или chemogenetic Сотовый активации. Эти микроэлектродов могут быть сделаны с достаточным качеством и надежностью позволяла быстрой интеграции этой техники в любой лаборатории инструментов. Подробный анализ концентрации K+ в области здравоохранения и государства в больными будет возможность дальнейшего выявления и количественной оценки различных молекулярных и клеточных компонентов способствовать отдыха K+ концентрации в мозг3, 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Khakh лаборатории было поддержано MH104069 низ. Mody лаборатории было поддержано NS030549 низ. J.C.O. Спасибо Grant(NS058280) обучения NIH T32 нейронных микросхемы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
