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Neuroscience

बनाने, परीक्षण, और वयस्क मस्तिष्क के ऊतक स्लाइस में पोटेशियम आयन चयनात्मक Microelectrodes का उपयोग

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57511

Summary

पोटेशियम आयनों कोशिकाओं की शेष झिल्ली क्षमता में योगदान और extracellular K+ एकाग्रता सेलुलर उत्तेजितता का एक महत्वपूर्ण नियामक है । हम का वर्णन कैसे बनाने के लिए, जांचना और monopolar K+-चयनात्मक microelectrodes का उपयोग करें । ऐसे इलेक्ट्रोड का उपयोग वयस्क हिप्पोकैम्पस स्लाइस में विद्युत पैदा की+ एकाग्रता गतिशीलता के माप को सक्षम बनाता है.

Abstract

पोटेशियम आयनों काफी कोशिकाओं के आराम झिल्ली क्षमता में योगदान और, इसलिए, extracellular K+ एकाग्रता सेल उत्तेजितता का एक महत्वपूर्ण नियामक है । extracellular K की बदल सांद्रता+ वोल्टेज पर निर्भर आयन चैनलों के लिए बंद, खुला और निष्क्रिय राज्यों के बीच equilibria स्थानांतरण द्वारा आराम झिल्ली क्षमता और सेलुलर उत्तेजितता को प्रभावित करता है कि आबाद कार्रवाई की क्षमता दीक्षा और आचरण । इसलिए, यह सीधे स्वास्थ्य और रोगग्रस्त राज्यों में extracellular K+ गतिशीलता को मापने के लिए मूल्यवान है । यहां, हम का वर्णन कैसे बनाने के लिए, जांचना और उपयोग monopolar K+-चयनात्मक microelectrodes । हम उंहें वयस्क हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस में तैनात को मापने के लिए बिजली पैदा की कश्मीर+ एकाग्रता गतिशीलता । इस तरह के इलेक्ट्रोड के विवेकपूर्ण उपयोग उपकरण के लिए सेलुलर और भौतिक तंत्र का मूल्यांकन है कि तंत्रिका तंत्र में extracellular K+ सांद्रता नियंत्रण की जरूरत किट का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है ।

Introduction

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पोटेशियम आयन सांद्रता कसकर मस्तिष्क में विनियमित रहे हैं, और उनके उतार चढ़ाव सभी कोशिकाओं के आराम झिल्ली क्षमता पर एक शक्तिशाली प्रभाव डालती. इन महत्वपूर्ण योगदान के प्रकाश में, जीव विज्ञान का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य के लिए सेलुलर और जैव शारीरिक तंत्र है कि कसकर के लिए उपयोग किया जाता है निर्धारित करने के लिए है K+ शरीर के विभिन्न अंगों में extracellular अंतरिक्ष में1 की एकाग्रता को विनियमित , 2. इन अध्ययनों में एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है K+ सांद्रता को सही तरीके से मापने की क्षमता. हालांकि कई घटक जो स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में मस्तिष्क में पोटेशियम homeostasis के लिए योगदान की पहचान की गई है3,4,5, आगे की प्रगति के विशेष प्रकृति के कारण धीमा कर दिया गया है पोटेशियम माप के लिए आयन चयनात्मक microelectrodes की तैयारी. Microelectrode सेंसर इन विट्रो में+ सांद्रता, ऊतक स्लाइस में और vivo मेंमापने के लिए सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

कश्मीर+ निगरानी के लिए नए दृष्टिकोण विकास ऑप्टिकल सेंसर का उपयोग कर के तहत कर रहे हैं, लेकिन इन k+ सांद्रता के एक जैविक रूप से प्रासंगिक रेंज का पता नहीं है या पूरी तरह से जैव प्रणालियों में संचालित नहीं किया गया है, हालांकि प्रारंभिक परिणाम 6,7,8होनहार दिखाई देते हैं । ऑप्टिकल सेंसर की तुलना में, microelectrodes आयनों के एक बिंदु स्रोत माप करने के लिए मौलिक रूप से सीमित हैं, हालांकि इलेक्ट्रोड arrays स्थानिक संकल्प9सुधार कर सकता है । यह लेख K+ गतिशीलता की निगरानी के लिए एकल-बैरलेड microelectrode सेंसर पर केंद्रित है ।

इस काम में, हम विस्तृत stepwise प्रक्रियाओं की रिपोर्ट k+ चयनात्मक microelectrodes बनाने के लिए, एक valinomycin-आधारित पोटेशियम ionophore का उपयोग कर कि परमिट उच्च चयनात्मक (104 गुना k+ to एनए+ selectivity) k+ 10झिल्ली पर आंदोलन । एक स्वाभाविक रूप से होने वाली पॉलीपेप्टाइड, valinomycin एक k+ पारगंय ताकना के रूप में कार्य करता है और कश्मीर के प्रवाह की सुविधा+ नीचे यह विद्युत ढाल है । हम यह भी वर्णन कैसे इलेक्ट्रोड जांच करने के लिए कैसे, दुकान और उन्हें का उपयोग करने के लिए कैसे और अंत में वयस्क चूहों से तीव्र हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस में K+ एकाग्रता गतिशीलता उपाय करने के लिए उन्हें तैनात करने के लिए कैसे. आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ एक साथ ऐसे इलेक्ट्रोड का उपयोग करें कि extracellular k+ गतिशीलता को विनियमित करने के लिए प्रस्तावित विशिष्ट आयन चैनलों का अभाव सेलुलर तंत्र से पता चलता है कि कश्मीर के परिवेश एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए तंत्रिका तंत्र द्वारा इस्तेमाल किया जाना चाहिए + extracellular वातावरण में ।

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Protocol

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सभी पशु प्रयोगों के अनुसार राष्ट्रीय स्वास्थ्य गाइड के संस्थान की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए आयोजित किया गया और चांसलर के कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में पशु अनुसंधान समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । सभी चूहों एक 12 एच प्रकाश अंधेरे वातावरण में भोजन और पानी उपलब्ध विज्ञापन libitum के साथ घर में थे । सभी जानवरों कोई स्पष्ट व्यवहार परिवर्तन के साथ स्वस्थ थे, पिछले अध्ययन में शामिल नहीं थे, और प्रकाश चक्र के दौरान बलिदान कर रहे थे । प्रयोगों के लिए डेटा वयस्क चूहों से एकत्र किए गए (6-8 सप्ताह सभी प्रयोगों के लिए पुराना).

1. K+ चयनात्मक microelectrodes की तैयारी

  1. borosilicate शीशे की Silanization
    1. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पैकेजिंग और जगह से पर्याप्त कांच केशिकाओं निकालें । 1 मी एचसीएल के साथ टॉप करने के लिए शंकु ट्यूब भरें । एचसीएल में रात भर या 6 घंटे की कम समय के लिए कोमल आंदोलन के साथ इलेक्ट्रोड धोएं ।
    2. ७०% इथेनॉल के साथ संक्षेप में कुल्ला केशिकाओं और फिर 6-8 घंटे के लिए 100-120 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह से सूखी । आगे उपयोग करने से पहले 4 सप्ताह तक के लिए निर्जल कैल्शियम सल्फेट जलशुष्कक के साथ कंटेनरों में स्टोर धोया केशिकाओं ।
    3. silanization करने से पहले, एक microelectrode खींचने का उपयोग कर एक ठीक टिप करने के लिए केशिकाओं खींचो । microelectrodes है कि हम का उपयोग लगभग 2-5 माइक्रोन व्यास में हैं । हमेशा दस्ताने के साथ धोया केशिकाओं संभाल, के रूप में त्वचा से तेलों silanization के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।
    4. एक गिलास कंटेनर में microelectrodes प्लेस ताकि इलेक्ट्रोड टिप टूटना को रोकने के लिए नीचे से ऊपर उठाया जाता है । autoclavable टेप या समान चिपकने वाला टेप का उपयोग कर कंटेनर के लिए microelectrodes को ठीक करें ।
    5. नाइट्रोजन प्रतिस्थापन विधि का उपयोग कर अपने कंटेनर से लगभग ०.५ मिलीलीटर 5% dichlorodimethylsilane (DDS) silanization समाधान निकालें ( चित्र 2देखें) । नाइट्रोजन गैस के साथ एक गुब्बारा भरें और गुब्बारे के लिए एक सिरिंज या ट्यूब और सुई देते हैं । DDS कंटेनर में सुई डालें, जबकि एक अलग सिरिंज में एक लंबी सुई के माध्यम से DDS ड्राइंग.
    6. पिपेट के सुझावों के लिए silanization समाधान dropwise लागू करें और तुरंत कवर । एक पूर्व में silanization समाधान के साथ microelectrodes पकड़े कंटेनर प्लेस (170-180 डिग्री सेल्सियस) 10-12 घंटे के लिए या 30 मिनट के लिए 200-220 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगशाला ओवन
    7. मशीनी होने के बाद ओवन को बंद कर दीजिये और फिर ओवन से प्लेट निकाल लीजिये. मशीन से प्लेट निकालते समय सावधान रहें, क्योंकि यह बेहद गर्म है । 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक बेंच पर प्लेट प्लेस करने के लिए कांच के ऊपर ठंडा करने की अनुमति ।
    8. प्लेट से microelectrodes निकालें (टेप को काटने के लिए एक रेजर ब्लेड या स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके) और उन्हें एक जलशुष्कक भरे वाटरप्रूफ कंटेनर में रखें । Silanized microelectrodes नमी से मुक्त रखा silanization के बाद 1 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. इलेक्ट्रोड भड़काना
    1. K+ ionophore कॉकटेल का स्टॉक समाधान तैयार करें: 5% w/v valinomycin, ९३% v/v 1, 2-dimethyl-3-nitrobenzene, 2% w/v पोटेशियम tetrakis (4-chlorophenyl) बोराटे11. यह समाधान एक बेहोश पीले रंग है । कमरे के तापमान पर एक वाटरप्रूफ, अपारदर्शी कंटेनर में रखें । यदि ठीक से संग्रहीत इस समाधान पिछले कई महीनों कर सकते हैं ।
    2. 10 मिमी HEPES की एक शेयर समाधान तैयार ७.४ पीएच में ३०० mm NaCl buffered । इलेक्ट्रोड को एक क्लैंप में ठीक करें और एक सिरिंज से कनेक्ट किए गए 28G microfil टिप का उपयोग करते हुए NaCl बफ़र्ड के साथ backfill. निरीक्षण है कि खारा समाधान microelectrode टिप के अंत तक पहुंच गया है । पुष्टि करें कि microelectrode बड़े बुलबुले कि वर्तमान के प्रवाह के साथ हस्तक्षेप कर सकता से मुक्त है ।
    3. लगभग 10-20 µm व्यापक करने के लिए इलेक्ट्रोड के टिप तोड़, एक स्केलपेल या उस्तरा ब्लेड के कुंद पक्ष का उपयोग कर.
    4. एक micropipette का उपयोग कर, microelectrode की नोक के पास K+ ionophore की एक छोटी सी छोटी बूंद (~ ०.१ µ l) लागू करें । इलेक्ट्रोड ठीक से किया गया है silanized छोटी बूंद टूटी हुई टिप में अवशोषित हो जाएगा । इलेक्ट्रोड को K+ ionophore के साथ 1-2 mm में भरें, और टिशू पेपर का उपयोग कर अतिरिक्त निकालें ।

2. K+ चुनिंदा Microelectrodes के अंशांकन

  1. अंशांकन समाधान की तैयारी
    1. NaCl के साथ प्रतिस्थापित करके समान osmolarity कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) में KCl की विभिन्न सांद्रता का समाधान तैयार करें. हमने इलेक्ट्रोड्स के अंशांकन के लिए ०.१, 1, ४.५, 10 और १०० mM K+ ACSF का उपयोग किया है । इन अंशांकन समाधानों के लिए व्यंजन विधि तालिका 1में सूचीबद्ध हैं ।
रासायनिक मेगावाट फाइनल एमएम ०.१ mM [K +] 1 मिमी [K +] ४.५ mM [K +] 10 मिमी [K +] १०० mM [K +]
(g/मोल)
Nacl ५८.४४ बदलता १.५१ छ १.५० छ १.४४ छ १.४ छ ०.३४५ छ
KCl 1 मीटर स्टॉक बदलता 20 µ l २०० µ l ९०० µ l 2 मिलीलीटर 20 मिलीलीटर
CaCl2 1 मीटर स्टॉक 2 ४०० µ l
MgCl2 1 मीटर स्टॉक 1 २०० µ l
णः2पो4 ११९.९८ १.२ ०.२९ छ
NaHCO3 ८४.०१ 26 ०.४३७ छ
D-ग्लूकोज १८०.१६ 10 ०.३६० छ
पानी q.s. २०० एमएल

तालिका 1. पोटेशियम अंशांकन समाधान

  1. Microelectrode अंशांकन
    1. प्रयोग आरंभ करने से पहले ९५% O2/5% कं2 के साथ बबल सभी समाधान । ४.५ mM [K+] के साथ स्नान perfusing शुरू करें 3 मिलीलीटर प्रति मिनट की दर से ACSF । इलेक्ट्रोड धारक पर इलेक्ट्रोड headstage से अनुलग्न में K+ चयनित इलेक्ट्रोड को रखें । यह headstage एक उपयुक्त एम्पलीफायर से जुड़ा हुआ है. स्नान perfusate में इलेक्ट्रोड की नोक डालें.
    2. सुनिश्चित करें कि एजी/AgCl जमीन इलेक्ट्रोड एक ही समाधान में नहाया है और यह है कि प्रवाह स्थिर है । एक stepwise फैशन में अंशांकन समाधान लागू करें और इलेक्ट्रोड टिप भर में एमवी में संभावित परिवर्तन रिकॉर्ड. अगले समाधान पर स्विच करने से पहले एक स्थिर मान तक पहुँचने के लिए इलेक्ट्रोड टिप पर संभावित के लिए प्रतीक्षा करें
    3. इलेक्ट्रोड टिप करने के लिए अंशांकन समाधान के आवेदन के जवाब में स्थिर राज्य वोल्टेज परिवर्तन को मापने. पुष्टि करें कि इलेक्ट्रोड प्रतिसाद की ढलान कम से ५२ है और कोई अधिक से अधिक ५८ एमवी प्रति लॉग परिवर्तन में [K] ।

3. एक्यूट हिप्पोकैम्पस ब्रेन स्लाइस की तैयारी

  1. स्लाइस समाधान की तैयारी
    1. तैयार ५०० मिलीलीटर सुक्रोज काटने समाधान से बना: १९४ मिमी सुक्रोज, 30 मिमी NaCl, ४.५ मिमी KCl, 10 मिमी डी-ग्लूकोज, 1 मिमी MgCl2, १.२ मिमी णः2पीओ4, और 26 मिमी NaHCO3, 290-300 mOsm, ९५% ओ2 और 5% सह2के साथ संतृप्त ।
    2. रिकॉर्डिंग समाधान (ACSF) से बना 1-2 लीटर का तैयार: १२४ मिमी NaCl, ४.५ मिमी KCl, 1 मिमी MgCl2, 10 मिमी डी-ग्लूकोज, 2 मिमी CaCl2, १.२ मिमी णः2पीओ4, और 26 मिमी NaHCO3; पीएच ७.३-७.४ (bubbling के बाद), २९०-३०० mOsm, ९५% हे2 और 5% CO2के साथ संतृप्त । रिकॉर्डिंग समाधान के साथ एक मस्तिष्क टुकड़ा धारक चैंबर युक्त एक चोंच भरें और इसे 32-34 डिग्री सेल्सियस पर रखें । बर्फ पानी कीचड़ के साथ vibratome चैंबर भरें ।
  2. तीव्र स्लाईस वडा
    1. गहराई से यह एक घंटी 2-3 मिलीलीटर isoflurane के साथ चार्ज जार में रखकर एक माउस anesthetize । पैर की अंगुली चुटकी पलटा के लिए जाँच करें, और यदि गैर उत्तरदायी, तेजी से decapitate यह तेज कैंची या गिलोटिन की एक जोड़ी का उपयोग कर के रूप में अपने पशु प्रोटोकॉल की आवश्यकता है.
    2. एक 2-3 सेमी खोपड़ी के caudal भाग से कैंची का उपयोग कर चीरा midline साथ खोपड़ी में कटौती करने के लिए बनाओ । जबकि मैन्युअल खोपड़ी वापस लेने, खोपड़ी के पक्षों के साथ फोरमेन मैग्नम से दो 1 सेमी क्षैतिज चीरा बनाते हैं । फिर, ठीक कतरनों का उपयोग, एक चीरा खोपड़ी की लंबाई, खोपड़ी के पीछे से नाक को midline साथ में कटौती ।
    3. midline के पास डाला ठीक संदंश का उपयोग करना, दो भागों में incised खोपड़ी वापस लेना. खोपड़ी से माउस मस्तिष्क निकालें और सेरिबैलम और घ्राण बल्ब, जो क्रमशः caudal और मस्तिष्क के rostral भागों में स्थित है हटाने के लिए एक ब्लेड का उपयोग करें । इन बड़ी दरारें, जो उंहें प्रांतस्था से अलग से पहचाना जा सकता है ।
    4. सुपर गोंद का उपयोग कर vibratome ट्रे पर मस्तिष्क ब्लॉक माउंट । बर्फ ठंड काटने समाधान के साथ vibratome ट्रे भरें ।
    5. ३०० µm मोटाई पर राज्याभिषेक विमान पर ऊतक वर्गों में कटौती । आमतौर पर 6 राज्याभिषेक हिप्पोकैम्पस स्लाइस एकत्र किया जा सकता है ।
    6. प्रत्येक सेक्शन कट जाने के बाद, तुरंत स्लाइस को 32-34 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने वाले यूरिन में ट्रांसफर कर दें । वर्गों से युक्त चोंच हटाने से पहले 20 मिनट के लिए इस तापमान पर वर्गों रखें और रिकॉर्डिंग करने के लिए पहले कम से 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इस जगह ।

4. बिजली पैदा की माप कश्मीर+ गतिशीलता

  1. स्लाइस तैयार करना सेट करना
    1. धीरे स्नान में मस्तिष्क टुकड़ा जगह एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर और धीरे जगह में नायलॉन तार के साथ एक प्लेटिनम वीणा के साथ पकड़ो ।
    2. सुनिश्चित करें कि द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड के सुझाव एक दूसरे के समानांतर हैं और स्लाइस के विमान के साथ स्तर हैं. धीरे, 6-7 सेकंड के पाठ्यक्रम पर, CA3 परत radiatum लगभग 40-50 µm गहरी Schaffer जमानतों को उत्तेजित करने में इलेक्ट्रोड डालें । कोरोनरी वर्गों में, CA3 लगभग हिप्पोकैम्पस के भाग के रूप में पहचाना जा सकता है हिप्पोकैम्पस जीनस में दाना सेल परत करने के लिए पार्श्व सही, परत radiatum गिरने औसत दर्जे का और पिरामिडीय कोशिका परत को ventral के साथ ।
    3. ध्यान से CA1 परत radiatum में K+-चुनिंदा इलेक्ट्रोड डालने लगभग ५० µm गहरी, धीरे से लगभग 3-4 सेकंड से अधिक इलेक्ट्रोड कम करके. अनुमति स्लाइस करने के लिए उत्तेजना लागू करने से पहले इलेक्ट्रोड भर में स्थिर करने के लिए: यह आमतौर पर 5 से 10 मिनट लगते हैं. यदि स्लाइस extracellular K+ में सहज परिवर्तन प्रदर्शित करता है तो छोड़ें और इस प्रक्रिया को एक नए स्लाइस से दोहराएं ।
  2. उपाय पैदा कश्मीर+ रिलीज
    1. विद्युत उत्तेजना की गाड़ियों लागू मैन्युअल रूप से उत्तेजित करने पर ट्रिगर निराशाजनक द्वारा (8 दालों) जबकि डिजिटल रिकॉर्डिंग प्रतिक्रियाओं. 10 हर्ट्ज और 1 एमएस पल्स चौड़ाई पर उत्तेजना लागू करें, 10 µA उत्तेजना आयाम में शुरू.
    2. अधिकतम K+ प्रतिसाद आयाम का पता चलने तक, 2 के गुणक द्वारा उत्तेजना बढ़ाने वाले आयाम लागू करें । यदि आपको कोई प्रतिक्रिया नहीं दिखाई देती है, तो K+ इलेक्ट्रोड की स्थिति को बढ़ाने में १०० µm में उत्तेजना साइट के करीब ले जाएं
    3. उत्तेजना आयाम है कि आधा अधिक से अधिक प्रतिक्रिया पैदा करता है निर्धारित करें । हमारे अनुभव में, यह 40-160 µA के बीच है, तैयारी की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, जानवर की उम्र, और उत्तेजना इलेक्ट्रोड और K+ चुनिंदा इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी.
    4. एक ही स्लाइस में, आयाम है कि आधा अधिक से अधिक प्रतिक्रिया पैदा करता है (उदाहरण के लिए अगर ८० µA एक आधा अधिकतम प्रतिक्रिया का उत्पादन से एक कदम कम पर एक उत्तेजना आयाम का उपयोग कर, ४० µA का उपयोग करें) दालों की बढ़ती संख्या के प्रोत्साहन गाड़ियों लागू होते हैं । शुरू में हमने 1, 2, 4, 8, 16, ३२, ६४ और १२८ दालों की गाड़ियों का इस्तेमाल किया है ।
    5. पुष्टि करने के लिए कि कश्मीर+ सिग्नल कार्रवाई के संभावित फायरिंग से मध्यस्थता कर रहे हैं विद्युत प्रेरित Schaffer जमानतों स्नान, 10 मिनट के लिए ACSF में ०.५ µ मीटर TTX लागू करते हैं और उत्तेजना प्रोटोकॉल दोहराएँ. कोई पैदा प्रतिक्रियाओं मनाया जाना चाहिए ।
    6. टुकड़ा प्रयोग खत्म करने के बाद, की पुष्टि करें इलेक्ट्रोड फिर से अंशांकन समाधान में इलेक्ट्रोड जांच और प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के द्वारा अपने responsivity बनाए रखा है प्रारंभिक अंशांकन से अधिक 10% से विचलित नहीं है

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Representative Results

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extracellular K के चुनिंदा माप के लिए+, हम स्वच्छ borosilicate ग्लास पिपेट के silanization के माध्यम से एक hydrophobic परत के साथ लेपित आयन चयनात्मक microelectrodes तैयार (आंकड़ा 1a). इस कोटिंग k+ ionophore युक्त valinomycin इलेक्ट्रोड की नोक पर आराम करने के लिए और इलेक्ट्रोड टिप (आंकड़ा 1bपर एक संकीर्ण खोलने के माध्यम से केवल कश्मीर+ प्रवाह की अनुमति सक्षम बनाता है. backfilled खारा समाधान और कश्मीर+ ionophore के साथ इलेक्ट्रोड भड़काने के बाद, इलेक्ट्रोड अपने तेजी से और रैखिक प्रतिक्रिया स्नान K+ सांद्रता (चित्रा 3) में stepwise परिवर्तन करने के लिए और उनके जवाब के लिए परीक्षण किया जा सकता स्नान K+ अंशांकन सीमा (चित्रा3) में खारा या ACSF में परिवर्तन ताकि नेर्ंस्ट समीकरण 2 द्वारा भविष्यवाणी की तरीके से । स्थिर राज्य की क्षमता में परिवर्तन के खिलाफ साजिश रची जा सकता है स्नान K+ एकाग्रता के लिए लाइन की ढलान निर्धारित करने के लिए, जो लगभग होना चाहिए ५८.२ एमवी लॉग प्रति [K+], ताकि नेर्ंस्ट समीकरण के अनुसार, और नहीं से कम ५२ एमवी प्रति लॉग [K+] (चित्र 3सी) । हम इसके अलावा k+ चुनिंदा इलेक्ट्रोड की जवाबदेही का परीक्षण किया और पाया कि वे कश्मीर में एक ५.५ मिमी परिवर्तन के लिए जवाब दिया+ वृद्धि और क्षय के साथ लगभग ८५ एमएस (चित्रा 3 डी,) के समय स्थिरांक.

electrophysiological रिकॉर्डिंग रिग उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के स्थान की पहचान करने के लिए एक एलसीडी डिस्प्ले से जुड़े एक मानक ईमानदार माइक्रोस्कोप के होते हैं. कोई विशेष प्रकाशिकी कश्मीर के दृश्य रखने के लिए की जरूरत है+ और उत्तेजना इलेक्ट्रोड; हम एक 5x या 10x उद्देश्य लेंस और एक हैलोजन बल्ब से सफेद प्रकाश का उपयोग करें, लेकिन एक सफेद एलईडी इसके बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । उत्तेजक इलेक्ट्रोड एक प्रेरणा के उत्पादन के लिए जुड़ा हुआ है, जो एक उत्तेजित करता है या अन्य ऐसे समय डिवाइस से दालों की समय पर वितरण के माध्यम से वर्तमान ध्रुवीकरण बचाता है. दूसरे शब्दों में, उत्तेजित करता है 2 V, 10-20 हर्ट्ज समय दालों की उत्तेजना को अलग करने के लिए गाड़ियों बचाता है । इन दालों प्राप्त करने पर, उत्तेजना अलग तो उत्तेजना इलेक्ट्रोड के लिए वांछित वर्तमान उद्धार. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक इलेक्ट्रोड धारक से जुड़ा हुआ है, एक headstage, एम्पलीफायर और एक/डी बोर्ड, जो electrophysiological रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 4a) के साथ एक पीसी के लिए इंटरफेस करने के लिए कनेक्ट. इलेक्ट्रोड सफलतापूर्वक नपेed किया गया है और तीव्र स्लाइसें तैयार किया गया है के बाद, टुकड़ा ACSF perfusate में रखा जा सकता है । Schaffer जमानतों को उत्तेजित करने के लिए, K+-चुनिंदा इलेक्ट्रोड CA1 परत radiatum के भीतर रखा गया है और क्षेत्र उत्तेजना इलेक्ट्रोड CA3 (चित्रा 4B) के भीतर रखा गया है ।

एक बार इलेक्ट्रोड रखा गया है और कश्मीर+ रिकॉर्डिंग एक स्थिर आधार रेखा तक पहुँच गया है, तो वर्तमान आयाम बढ़ाने की दालों स्लाइस करने के लिए लागू किया जा सकता है (चित्रा 5, शीर्ष). इस गतिविधि की तरंग एक घातीय क्षय दर है, जो TTX आवेदन (चित्रा 5, नीचे) के साथ समाप्त हो गया है के साथ+ कश्मीर में एक तेजी से वृद्धि के रूप में प्रकट होता है ।

Figure 1
चित्र 1 : silanization प्रतिक्रिया का आरेख और K+ चयनात्मक microelectrode वास्तुकला । silanization प्रतिक्रिया है कि borosilicate ग्लास और silanization रिएजेंट dichlorodimethylsilane (DDS) के उजागर ध्रुवीय हाइड्रॉक्सिल समूहों के बीच होता है की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । यह प्रतिक्रिया ग् hydrophobic की सतह को रेंडर करती है, जो K+ ionophore को एक पतली झिल्ली बनाने की अनुमति देती है । B. के आरेख K+ चुनिंदा microelectrode. इलेक्ट्रोड खारा समाधान के साथ backfilled है और K+ चयनित समाधान टिप पर एक 1-2 mm मोटी परत में जगह है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : DDS निष्कर्षण के आरेख । एक कंटेनर से DDS निष्कर्षण के लिए नाइट्रोजन प्रतिस्थापन प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । DDS अस्थिर और ज्वलनशील है और जब यह उच्च सांद्रता में है, इसलिए यह निष्क्रिय नाइट्रोजन गैस के साथ हटा दिया DDS की जगह आवश्यक है वायुमंडलीय गैसों के साथ हिंसक प्रतिक्रिया कर सकते हैं । एक नाइट्रोजन से भरा गुब्बारा एक सिरिंज या उचित टयूबिंग के माध्यम से एक सुई से जुड़ा है । इस सुई की अनुमति कंटेनर पर सीलेंट के माध्यम से डाला जाता है नाइट्रोजन गैस (एन2) कंटेनर में प्रवाह । अलग से, एक लंबी (3-10 सेमी) सुई एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा है और कंटेनर में डाला जाता है । इस सिरिंज तो DDS निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि केवल नाइट्रोजन गैस कंटेनर में प्रवेश कर सकते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : microelectrodes का अंशांकन । ए स्नान छिड़काव खारा में विभिंन K+ सांद्रता के आवेदन तेजी से और reversibly इलेक्ट्रोड टिप भर में क्षमता में Nernstian परिवर्तन का उत्पादन कर सकते हैं । ACSF में K+ का B. Stepwise अनुप्रयोग इलेक्ट्रोड टिप क्षमता में एक विशिष्ट और स्थिर परिवर्तन उदाहरण देते हैं । ग. k+ के एमवी परिवर्तन की साजिश के उत्तर में+ चार इलेक्ट्रोड में बढ़ती सांद्रता के जवाब में चुनिंदा इलेक्ट्रोड; आर2 इन चार इलेक्ट्रोड के लिए ०.९९९५ है । 10 मिमी k+ के डी. फास्ट छिड़काव प्रणाली स्नान आवेदन k+ चुनिंदा इलेक्ट्रोड टिप भर में वोल्टेज में एक कदम प्रतिक्रिया का कारण बनता है. ई. मापा प्रतिक्रिया समय की साजिश (ताऊ एमएस में); वृद्धि और क्षय समय के बीच कोई अंतर नहीं पाया गया (मतलब ± SEM, पी = ०.९३९, दो नमूना टीपरीक्षण) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : extracellular K+ माप के लिए उपकरण । ए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग एक खुर्दबीन एक संलग्न कैमरा और टुकड़ा दृश्य के लिए एलसीडी डिस्प्ले के साथ एक विरोधी कंपन तालिका के लिए तय के होते हैं । K+ इलेक्ट्रोड electrophysiological रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ एक संलग्न पीसी के लिए संकेत outputs जो डिजिटल बोर्ड के लिए एक headstage, एम्पलीफायर और एनालॉग के लिए तय हो गई है. विद्युत उत्तेजना इलेक्ट्रोड एक उत्तेजना अलग है जो उत्तेजना आयाम और समय उत्तेजना प्रसव के लिए एक उत्तेजक बदलता है करने के लिए जुड़े हुए हैं । B. स्लाइस तैयार करने का आरेख और स्लाइस पर विभिंन इलेक्ट्रोड की जमावट का स्थान । CA3 लगभग हिप्पोकैम्पस जीनस में दाना सेल परत के लिए उचित पार्श्व हिप्पोकैम्पस के भाग के रूप में पहचाना जा सकता है, परत radiatum गिरने rostral पिरामिड सेल लेयर के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : बिजली पैदा की माप कश्मीर+ रिलीज । के प्रतिनिधि निशान+ बेसल शर्तों के तहत रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से रिलीज (ऊपर) और (नीचे) रिकॉर्डिंग करने के लिए पहले 5 मिनट के लिए tetrodotoxin (०.२५ µ m) के आवेदन पर उनके नुकसान. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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विधि है कि हम यहां का वर्णन हमें वयस्क चूहों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में Schaffer जमानतों की विद्युत उत्तेजना के जवाब में कश्मीर की गतिशीलता का आकलन करने की अनुमति दी है । K+ आयन चयनात्मक microelectrodes तैयार करने की हमारी विधि पहले वर्णित प्रक्रियाओं के समान है12,13,14,15. हालांकि, इस विधि में वैकल्पिक इलेक्ट्रोड विंयास पर लाभ यह है कि यह तेजी से और जटिल है K+ चयनात्मक microelectrodes तैयार करने के लिए । उपयुक्त अंशांकन के बाद, इन इलेक्ट्रोड मजबूती से मापने के लिए पाया गया K+ स्लाइस में विद्युत उत्तेजना के दौरान गतिशीलता, और ऐसी प्रतिक्रियाओं TTX द्वारा अवरुद्ध थे. इन प्रयोगों में, 80-160 की उत्तेजना 10 हर्ट्ज पर यूए इस्तेमाल किया गया; हालांकि, एक विशेष प्रयोग के लिए उत्तेजना शर्तों का अनुकूलन और ब्याज की एक मस्तिष्क क्षेत्र के लिए आवश्यक हो जाएगा । ये मान एक मार्गदर्शिका के रूप में सूचीबद्ध होते हैं ।

इलेक्ट्रोड की प्रतिक्रिया की ढलान होना चाहिए ५८.२ एमवी प्रति लॉग [K]. इस तरह के एक मूल्य K+ चयनात्मक अर्द्ध पारगंय झिल्ली के लिए ताकि नेर्ंस्ट और Nicolsky-Eisenman समीकरणों से भविष्यवाणी की है; उत्तरार्द्ध आयनों16के बीच बातचीत के लिए बेहतर खाते । इलेक्ट्रोड में अनुमानित तरीके से प्रतिसाद नहीं देता है, तो यह दो प्राथमिक कारणों में से एक के लिए हो सकता है । पहले silanization अपर्याप्त हो सकता है, झिल्ली खो जाने या नमक पुलों के रूप में पैदा करने के लिए । झिल्ली खुर्दबीन के माध्यम से अवलोकन द्वारा बरकरार है कि पुष्टि करें, वहाँ पिपेट समाधान और झिल्ली के बीच एक स्पष्ट इंटरफेस होना चाहिए । एक और कारण, पिपेट में बुलबुले की उपस्थिति है कि चांदी क्लोराइड तार से वर्तमान के प्रवाह में बाधा हो सकती है । यदि बुलबुले मनाया जाता है, तो पिपेट को दूर करने और उंहें हटाने के लिए जोरदार झटका । यदि ये समाधान विफल हो जाते हैं, तो किसी अंय K+ चयनित इलेक्ट्रोड को पुन: बनाएं या अधिक समय तक या उच्च तापमान पर दोहराएं silanization । हालांकि, यह इन कुंजी नियंत्रण दोहराने के लिए महत्वपूर्ण है हर बार एक नया मस्तिष्क क्षेत्र का अध्ययन किया है या एक नया microelectrode परीक्षण किया है ।

दो विशिष्ट एम्पलीफायरों इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन अन्य एम्पलीफायरों के रूप में इनपुट प्रतिबाधा से अधिक या बराबर है जब तक इस्तेमाल किया जा सकता ५०० MΩ. ५०० MΩ और 5 GΩ इनपुट impedances के साथ इलेक्ट्रोड को तुले होने पर, हम वहां की एक सीमा से अधिक की स्थापना के साथ वोल्टेज प्रतिक्रिया की ढलान में कोई अंतर नहीं था पाया k+ सांद्रता (५६.९ ± ०.७ और ५६.५ ± ०.९ एमवी प्रति दस गुना परिवर्तन में [K+ ] ५०० MΩ और 5 GΩ इनपुट impedances के लिए क्रमशः; P = ०.७५९, युग्मित t-परीक्षण, n = 4 इलेक्ट्रोड) ।

हम भी [K+] में एक ज्ञात कूदने के लिए इलेक्ट्रोड की प्रतिक्रिया समय अनुमान करने के लिए तेजी से समाधान स्विच का इस्तेमाल किया ४.५ से 10 मिमी (चित्रा 3 डी). इलेक्ट्रोड वृद्धि और क्षय बार के साथ जवाब दिया (ताऊ) के ८५ ± 12 और ८५ ± 15 ms, क्रमशः. इस के संबंध में, हमारे कस्टम तेजी से समाधान switcher के लिए समाधान विनिमय कैनेटीक्स ८५ ± 27 ms था । इसलिए, k+ चुनिंदा इलेक्ट्रोड के रूप में तेजी से समाधान switcher हम कार्यरत है और कश्मीर की गतिशीलता से कहीं तेज के रूप में कैनेटीक्स के साथ जवाब+ में Schaffer संपार्श्विक उत्तेजना (figure 5) के फलस्वरूप extracellular वातावरण । इन डेटा का सुझाव है कि k+ चयनित इलेक्ट्रोड का कैनेटीक्स का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है k+ संचय और मस्तिष्क ऊतक में मंजूरी । हालांकि, भविष्य में काम उचित नियंत्रण और अंशांकन एक मामले दर मामले के आधार पर की जरूरत होगी । हमारा सुझाव है कि यह आपके रिकॉर्डिंग चैंबर में समाधान विनिमय कैनेटीक्स को समझने के लिए समय बिताने के लिए मूल्यवान है ।

हम तीन गंभीर महत्वपूर्ण कारकों है कि गुणवत्ता और स्लाइस में कश्मीर+ माप की मजबूती को प्रभावित पाया. सबसे पहले तैयारी की गुणवत्ता है, दोनों ऊतक स्वास्थ्य और उपयोग जानवरों के उम्र के लिए प्रासंगिक दिखाई देते हैं । इस अध्ययन के लिए, हमने C57/Bl6N चूहों का इस्तेमाल किया है जो ~ 12 सप्ताह पुराना है । दुर्लभ अवसरों पर, हम सहज K+ उतार चढ़ाव ~ ०.१ mM और टिकाऊ 5-10 सेकंड के लिए राशि के साथ स्लाइस पाया; इन स्लाइसों को छोड़ दिया गया । दूसरी रिकॉर्डिंग microelectrode की गुणवत्ता है । प्राथमिक मुद्दा समय और तापमान है कि खींचा कांच केशिका के silanization के लिए प्रयोग किया जाता है । हम अनुशंसा करते हैं > 170 ° c (रात भर के लिए स्वीकार्य है) या 30 मिनट के लिए २०० ° c पर कम 6 घंटे के लिए । silanization एजेंट के साथ इलेक्ट्रोड के अपर्याप्त हीटिंग इलेक्ट्रोड के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो K+ ionophore के क्रमिक हानि के कारण एक स्थिर स्थिति की क्षमता बनाए रखने नहीं है । इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोड तैयार करते समय, हम एक पतली परत (1-2 mm) के K+ ionophore का व्यास के साथ टिप में रखने की सलाह देते हैं 10-20 µm यानी औसतन कोशिका शरीर (आंकड़ा 1b) के लगभग आकार । जरूरत से ज्यादा चौड़ा टिप तोड़ नहीं है, या कश्मीर+ चयनित झिल्ली अखंडता खो देंगे और इलेक्ट्रोड विफल हो जाएगा । इस चरण में सही आकार के सुझावों को प्राप्त करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है । एक भी ठीक टिप या एक परत की बहुत मोटी के साथ K+ चुनिंदा इलेक्ट्रोड, ठीक से निर्माण इलेक्ट्रोड की तुलना में सुस्त प्रतिक्रियाओं हो सकता है. तीसरे कारक उत्तेजना इलेक्ट्रोड और K+ चुनिंदा इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी है । हम लगभग ५०० µm के एक अंतर इलेक्ट्रोड दूरी का इस्तेमाल किया है, लेकिन इष्टतम दूरी काफी व्यक्तिगत मस्तिष्क क्षेत्र के साथ भिंन हो सकते है और ध्यान से हाथ में विशेष प्रयोग के लिए विचार करने की आवश्यकता होगी ।

एकल बैरल विंयास के अलावा, वहां वर्तमान में कश्मीर बनाने के लिए कई तरीके है+-द्विध्रुवी और गाढ़ा प्रारूपों17में चयनात्मक microelectrodes । इन विधियों के प्रकाशित विवरण की तुलना में, एकल चैनल इलेक्ट्रोड दो मुख्य नुकसान है: 1) एक थोड़ा बड़ा टिप व्यास (~ 10 बनाम 4 µm), जो द्विध्रुवी और गाढ़ा करने के लिए extracellular अंतरिक्ष comparted के अधिक से अधिक व्यवधान पैदा कर सकता है इलेक्ट्रोड, और 2) द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड में के रूप में कई आयन प्रजातियों के एक साथ माप के साथ असंगति. हालांकि, एकल चैनल इलेक्ट्रोड कई लाभ प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, इन इलेक्ट्रोड से कम पांच मिनट में गढ़े जा सकते हैं और इसलिए अधिक डिस्पोजेबल कर रहे हैं और किया जा सकता है और प्रयोगों से पहले जल्दी से नपे. इसलिए, पाठ्यक्रम प्रयोगों के दौरान इलेक्ट्रोड टूटना का खतरा एक चिंता का कम है. इसके अतिरिक्त, क्योंकि जमीन इलेक्ट्रोड और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड शारीरिक रूप से स्नान की मात्रा से अलग कर रहे हैं, इलेक्ट्रोड की नोक पर नमक पुलों के गठन के लिए कोई मौका नहीं है, जो गाढ़ा और द्विध्रुवी में इलेक्ट्रोड विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं इलेक्ट्रोड. एक चैनल इलेक्ट्रोड की प्रतिक्रिया समय द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड की तुलना में तेजी से है और संभावना गाढ़ा इलेक्ट्रोड के लिए तुलनीय (~ 20 ms), हालांकि हमारे फास्ट छिड़काव प्रणाली केवल ८० ms के आदेश पर प्रतिक्रिया समय की एक माप की अनुमति दी (चित्रा 3E ). इसके अलावा, इन इलेक्ट्रोड द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड की तुलना में कम शोर की पेशकश, जो अधिक से अधिक टिप प्रतिरोध है और उच्च इनपुट प्रतिरोध के साथ एम्पलीफायरों के उपयोग की आवश्यकता होती है. अंत में, इन इलेक्ट्रोड एक विशेष micromanipulator या headstage के रूप में गाढ़ा इलेक्ट्रोड के लिए आवश्यक है के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । संतुलन पर, निर्माण के फायदे और एक चैनल इलेक्ट्रोड के उपयोग में आसानी नुकसान का वजन बढ़ना.

दृष्टिकोण है कि हम यहां इस्तेमाल के लिए माप में कश्मीर की+ गतिशीलता कई मस्तिष्क क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है कश्मीर+ विनियमन अध्ययन । हालांकि इस प्रोटोकॉल के उपयोग को दर्शाता है K+-मस्तिष्क के ऊतकों में विद्युत पैदा पोटेशियम आयनों की गतिशीलता की माप के लिए चुनिंदा इलेक्ट्रोड, इस प्रोटोकॉल को मोटे तौर पर कई विभिन्न ऊतकों में इस्तेमाल किया जा सकता है जहां यह करने के लिए वांछनीय है माप K+ गतिशीलता । ऐसी स्थितियों में सहज गतिशीलता और औषधीय, optogenetic, या chemogenetic सेलुलर सक्रियण के जवाब में परिवर्तन शामिल हो सकते हैं । इन microelectrodes पर्याप्त गुणवत्ता और विश्वसनीयता के साथ बनाया जा सकता है के रूप में किसी भी प्रयोगशाला toolbox में इस तकनीक के तेजी से एकीकरण की अनुमति । स्वास्थ्य और रोगग्रस्त राज्यों में k+ सांद्रता का विस्तृत विश्लेषण आगे का पता लगाने और कैसे विभिंन आणविक और सेलुलर घटकों के मस्तिष्क3में कश्मीर+ सांद्रता आराम करने के लिए योगदान के ठहराव सक्षम हो जाएगा, 18,19.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

खाख लैब को NIH MH104069 ने सपोर्ट किया था । मॉडि लैब को NIH NS030549 ने सपोर्ट किया था । J.C.O. धन्यवाद NIH T32 तंत्रिका Microcircuits प्रशिक्षण अनुदान (NS058280) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome DSK Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice Taconic Stock#B6
Microscope Olympus BX51
Electrode puller Sutter P-97
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2
pCLAMP10.3 Molecular Devices n/a
Custom microfil 28G tip World precision instruments CMF28G
Tungsten Rod A-M Systems 716000
Bipolar stimulating electrodes FHC MX21XEW(T01)
Stimulus isolator World precision instruments A365
Grass S88 Stimulator Grass Instruments Company S88
Borosilicate glass pipettes World precision instruments 1B150-4
A to D board Digidata 1322A Axon Instruments
Signal Amplifier Multiclamp 700A or 700B Axon Instruments
Headstage CV-7B Cat 1 Axon Instruments
Patch computer Dell n/a
Sodium Chloride Sigma S5886
Potassium Chloride Sigma P3911
HEPES Sigma H3375
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S0751
D-glucose Sigma G7528
Calcium Chloride Sigma 21108
Magnesium Chloride Sigma M8266
valinomycin Sigma V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene Sigma 40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate Sigma 60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane Sigma 85126-5ml
TTX Cayman Chemical Company 14964
Hydrochloric acid Sigma H1758-500mL
Sucrose Sigma S9378-5kg
Pipette Micromanipulator Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens Olympus PlanAPO 10xW

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References

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बनाने, परीक्षण, और वयस्क मस्तिष्क के ऊतक स्लाइस में पोटेशियम आयन चयनात्मक Microelectrodes का उपयोग
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Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. J. Vis. Exp. (135), e57511, doi:10.3791/57511 (2018).More

Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. J. Vis. Exp. (135), e57511, doi:10.3791/57511 (2018).

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