Summary
Kalium ionen bijdragen tot de rustpotentiaal membraan van cellen en extracellulaire K+ concentratie is een cruciale regulator van cellulaire prikkelbaarheid. We beschrijven hoe te maken, te kalibreren en te gebruiken monopolaire K+-selectieve microelectrodes. Deze elektroden, kunt de meting van elektrisch evoked K+ concentratie dynamiek in volwassen hippocampal plakjes.
Abstract
Kalium ionen aanzienlijk bijdragen tot de rustpotentiaal membraan van cellen en extracellulaire K+ concentratie is daarom een belangrijke regulator van de prikkelbaarheid van de cel. Concentraties van extracellulaire K+ beïnvloeden de rust membraan potentiële en cellulaire prikkelbaarheid gewijzigd door een verschuiving van het evenwicht tussen open en gesloten, geïnactiveerd Staten voor spanning afhankelijk van de ionenkanalen die ten grondslag liggen aan de actiepotentiaal Inleiding en geleiding. Vandaar, is het waardevol voor extracellulaire K+ dynamiek in gezondheid en valt bestuurlijk gezien onder zieke rechtstreeks te meten. Hier beschrijven we hoe te maken, te kalibreren en te gebruiken monopolaire K+-selectieve microelectrodes. We ingezet hen in volwassen hippocampal hersenen segmenten voor het meten van de dynamiek van de concentratie elektrisch evoked K+ . Het oordeelkundige gebruik van dergelijke elektroden is een belangrijk onderdeel van de tool-kit nodig te evalueren van de cellulaire en biofysische mechanismen waarmee extracellulaire K+ concentraties in het zenuwstelsel.
Introduction
Kalium-ion concentraties worden strak gereguleerd in de hersenen, en hun schommelingen een krachtige invloed uitoefenen op de rustpotentiaal membraan van alle cellen. In het licht van deze kritische bijdragen is een belangrijk doel van de biologie het bepalen van de cellulaire en biofysische mechanismen die worden gebruikt voor de concentratie van K+ strak te regelen in de extracellulaire ruimte in verschillende organen van het lichaam1 , 2. een belangrijke voorwaarde in deze studies is het vermogen om te K+ concentraties nauwkeurig meten. Hoewel veel onderdelen die tot kalium homeostase in de hersenen in gezonde en zieke staten bijdragen geïdentificeerde3,4,5 geweest, is verdere vooruitgang vertraagd vanwege de gespecialiseerde aard van ion selectieve microelectrodes voorbereiden kalium meting. Micro-elektrode sensoren vertegenwoordigen de gouden standaard voor het meten van K+ concentraties in vitro, in weefsel segmenten en in vivo.
Benaderingen van de nieuwere voor K+ monitoring worden ontwikkeld met behulp van optische sensoren, maar deze een biologisch relevant bereik van K+ -concentraties niet gedetecteerd of niet al volledig in biologische systemen, doorgelicht hebben hoewel eerste resultaten veelbelovende6,7,8te verschijnen. Vergeleken met optische sensoren, zijn microelectrodes fundamenteel beperkt tot een puntbron meting van ionen, hoewel elektrode matrices van de ruimtelijke resolutie9 verbeteren kunnen. Dit artikel richt zich op de sensoren van de single-barreled micro-elektrode voor het toezicht op K+ dynamics.
In dit werk, rapporteren we gedetailleerde stapsgewijze procedures voor het maken van K+ selectieve microelectrodes, met behulp van een valinomycin gebaseerde kalium-ionophore waarmee zeer selectief (104 K+ vouw om het boekje nb+ selectiviteit) K+ verkeer over membranen10. Een natuurlijk voorkomende polypeptide, valinomycin fungeert als een K+ doorlaatbare poriën en vergemakkelijkt de stroom van K+ beneden het elektrochemische gradiënt. Ook beschrijven we hoe ter ijking van de elektroden, hoe te slaan en te gebruiken en tot slot hoe implementeren voor het meten van K+ concentratie dynamiek in acute hippocampal hersenen plakjes van volwassen muizen. Het gebruik van dergelijke elektroden samen met genetisch gemodificeerde muizen dat het gebrek aan specifieke ionenkanalen voorgesteld te reguleren de extracellulaire K+ dynamiek moet onthullen de cellulaire mechanismen die door het zenuwstelsel worden gebruikt om te controleren de ambient concentratie van K + in de extracellulaire milieu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven verliepen volgens het nationale Instituut van Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de Chancellor's Animal Research Committee aan de Universiteit van Californië, Los Angeles. Alle muizen werden ondergebracht bij voedsel en water beschikbaar ad libitum in een omgeving van 12 h licht-donker. Alle dieren waren gezond met geen duidelijke gedragsveranderingen, waren niet betrokken bij eerdere studies, en werden opgeofferd tijdens de lichte cyclus. Gegevens voor experimenten werden verzameld uit volwassen muizen (6-8 weken oud voor alle experimenten).
1. bereiding van de selectieve microelectrodes K+
- Silanization van borosilicaatglas
- Voldoende glazen capillairen te verwijderen uit de verpakking en leg in een conische tube van 50 mL. Vul conische buis naar boven met 1 M HCl. Wash elektroden met zachte agitatie in HCl's nachts of voor een minimum van 6 uur.
- Kort spoelen haarvaten met 70% ethanol en droog dan volledig bij 100-120 ° C voor 6-8 uur. Opslag gewassen haarvaten in containers met watervrij calciumsulfaat droogmiddel voor maximaal 4 weken voor verder gebruik.
- Trek vóór silanization, haarvaten naar een fijne tip met behulp van een micro-elektrode-trekker. De microelectrodes die we gebruiken zijn ongeveer 2-5 micron in diameter. Altijd behandelen gewassen haarvaten met handschoenen, als oliën van de huid met silanization interfereren kunnen.
- Microelectrodes in een glazen container plaatsen, zodat de elektroden van de bodem om te voorkomen dat tip breuk zijn verheven. De microelectrodes naar de container met autoclaaf tape of soortgelijke plakband vast te stellen.
- Ongeveer 0,5 mL 5% dichlorodimethylsilane (DDS) silanization oplossing verwijderen uit de container met behulp van de methode van de stikstof-replacement (Zie Figuur 2). Een ballon vullen met stikstofgas en bevestig een spuit of de buis en de naald aan de ballon. Steek de naald in de DDS-container tijdens het opstellen van DDS in een aparte spuit via een langere naald.
- De silanization oplossing ontkleuring van toepassing op de toppen van de pipetten en onmiddellijk dekken. Plaats de container bezit is van de microelectrodes met silanization-oplossing in een voorverwarmde oven van (170-180 ° C) laboratorium voor 10-12 uur of bij 200-220 ° C gedurende 30 minuten
- Na de incubatie, zet de oven en verwijder vervolgens de plaat uit de oven. Wees voorzichtig met het verwijderen van de plaat uit de incubator, aangezien er zeer heet. Plaats de plaat op een bankje bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten zodat het glaswerk om te koelen.
- Verwijder de microelectrodes uit de plaat (gebruik een scheermesje of scalpel mes te snijden van de tape) en plaats hen in een dessicant gevulde luchtdichte verpakking. Gesilaneerde microelectrodes vrij van vocht gehouden kunnen worden gebruikt voor maximaal 1 week na silanization.
- De elektroden priming
- Bereiden van een stamoplossing van K+ ionophore cocktail: 5% w/v valinomycin, 93% (v/v): 1,2-dimethyl-3-nitrobenzeen, 2% w/v kalium tetrakis(4-chlorophenyl) boraat11. Deze oplossing is een vage gele kleur. In een luchtdichte, ondoorzichtige verpakking bij kamertemperatuur bewaren. Als goed opgeslagen deze oplossing kan vele maanden duren.
- Voorbereiden van een stamoplossing van 10 mM HEPES gebufferd 300 mM NaCl met een pH van 7,4. Het herstellen van de elektrode in een klem en de aanvulling funderingsput met de gebufferde NaCl met behulp van een 28G microfil tip verbonden met een spuit. Let op dat de zoutoplossing het einde van de micro-elektrode tip heeft bereikt. Bevestigen dat de micro-elektrode vrij grote luchtbellen die met de stroom van stroom interfereren kunnen.
- De tip van de elektrode met ongeveer 10-20 µm breed, met de botte kant van een scalpel of scheermesje verbreken.
- Met behulp van een micropipet, het toepassen van een kleine druppel (~0.1 µl) van de ionophore K+ , nabij de monding van de micro-elektrode. Als de elektrode goed gesilaneerde die de druppel zal worden geabsorbeerd in de gebroken tip is. Vul de elektrode tot 1-2 mm met de K+ ionophore, en Verwijder overtollig gebruik papieren zakdoekje.
2. kalibratie van de selectieve Microelectrodes K+
- Bereiding van de ijkoplossingen
- Bereid oplossingen van verschillende concentraties van KCl in gelijke osmolariteit kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) door NaCl vervangen door KCl. We 0,1 1, 4.5, 10 en 100 mM K+ ACSF, gebruikt voor de kalibratie van de elektroden. De recepten voor deze ijkoplossingen zijn vermeld in tabel 1.
| Chemische stof | MW | definitieve mM | 0.1 mM [K +] | 1 mM [K +] | 4.5 mM [K +] | 10 mM [K +] | 100 mM [K +] |
| (g / mol) | |||||||
| NaCl | 58.44 | varieert | 1,51 g | 1,50 g | 1,44 g | 1.4 g | 0.345 g |
| KCl | 1 M voorraad | varieert | 20 µl | 200 µl | 900 µl | 2 ml | 20 ml |
| CaCl2 | 1 M voorraad | 2 | 400 µl | ||||
| MgCl2 | 1 M voorraad | 1 | 200 µl | ||||
| NaH2PO4 | 119.98 | 1.2 | 0.29 g | ||||
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 0.437 g | ||||
| D-Glucose | 180.16 | 10 | 0,360 g | ||||
| Water | q.s. 200 ml | ||||||
Tabel 1. Kalium ijkoplossingen
- Micro-elektrode kalibratie
- Bubble alle oplossingen met 95% O2/5% CO2 gedurende ten minste 20 minuten voordat u begint met het experiment. Beginnen de bad met 4.5 mM [K+] zoogdierlevercellen ACSF met een snelheid van 3 mL per minuut. Plaats de selectieve K+ -elektrode in elektrode-houder verbonden aan de headstage van de elektrode op de manipulator. Deze headstage is verbonden met een geschikte versterker. Breng de tip van de elektrode in de bad perfusaat.
- Controleer de Ag/AgCl-elektrode voor grond baadt in dezelfde oplossing en dat de stroom stabiel is. Ijkoplossingen op een stapsgewijze manier van toepassing en de mogelijke wijzigingen opnemen in mV over het uiteinde van de elektrode. Wachten voor de mogelijkheden op het puntje van de elektrode te bereiken van een stabiele waarde voordat u naar de volgende oplossing
- De steady-state spanning wijziging in reactie op de toepassing van de ijkoplossingen op de elektrode tip meten. Bevestigen dat de helling van de elektrode respons ten minste 52 en niet groter is dan 58 is mV per log verandering in [K+].
3. bereiding van Acute Hippocampal hersenen segmenten
- Voorbereiding van segment oplossingen
- Bereiden van 500 mL sacharose snijden oplossing bestaat uit: 194 mM sacharose, 30 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, en 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, verzadigd met 95% O2 en 5% CO2.
- Bereiden van 1-2 liter opnameoplossing (ACSF) bestaat uit: 124 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4en 26 mM NaHCO3; pH 7,3-7.4 (na borrelen), 290-300 mOsm, verzadigd met 95% O2 en 5% CO2. Vul een bekerglas een hersenen segment houder kamer met het opnemen van de oplossing en bewaar deze op 32-34 ° C. Vul de vibratome kamer met ijswater slush.
- Acute segment voorbereiding
- Diep anesthetize een muis door deze te plaatsen in een glazen stolp voorgevuld met 2-3 mL Isofluraan. Controleer voor teen snuifje reflex en als niet-reagerende, snel onthoofden met behulp van een paar scherpe schaar of guillotine als uw dier protocol vereist.
- Maak een incisie van 2-3 cm, met behulp van schaar uit het caudal gedeelte van de schedel te snijden de hoofdhuid langs de middellijn. Maak twee 1 cm horizontale insnijdingen van het foramen magnum langs de zijkanten van de schedel terwijl handmatig intrekken de hoofdhuid. Dan, met behulp van fijn schaar, snijd een sneetje de lengte van de schedel, langs de middellijn vanaf de achterkant van de schedel naar de neus.
- Met behulp van fijne pincet ingevoegd in de buurt van de middellijn, trekken de ingesneden schedel in twee gedeelten. Pak de muis hersenen van de schedel en gebruik een mes om te verwijderen het cerebellum en de bulbus bollen, die respectievelijk op de caudal en rostraal gedeelten van de hersenen liggen. Deze kunnen worden geïdentificeerd door de grote kloven, die hen van de cortex scheiden.
- Monteren van het blok van de hersenen op de lade van de vibratome met behulp van superlijm. Vul de vibratome lade met ijskoude snijden oplossing.
- Gesneden weefselsecties op de coronale vlak bij 300 µm dikte. Meestal kunnen 6 coronale hippocampal segmenten worden verzameld.
- Nadat elke sectie wordt gesneden, onmiddellijk de plakjes overbrengen naar het segment holding bekerglas opgewarmd tot 32-34° C. Houd de secties op deze temperatuur gedurende 20 minuten voordat u verwijdert het bekerglas van de secties en plaats deze bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20-30 minuten voorafgaand aan de opname.
4. meting van de elektrisch Evoked K+ Dynamics
- Instellen van de segment-voorbereiding
- Voorzichtig plaatst het segment van de hersenen in het bad met behulp van een precisiepipet Pasteur en houd hem zachtjes in plaats met een platina harp met nylon snaren.
- Zorgen de toppen van de bipolaire stimulerende elektrode evenwijdig aan elkaar en zijn niveau met het vliegtuig van het segment. Langzaam, in de loop van 6-7 seconden, invoegen de elektroden CA3 stratum radiatum ongeveer 40-50 µm diep om te stimuleren Schaffer zekerheden. In coronale secties, kan CA3 worden ongeveer geïdentificeerd als het gedeelte van de hippocampus goede laterale aan de cellaag van de submodule op de hippocampal genu, met de stratum radiatum mediale en ventrale dalen tot de piramidale cellaag.
- Steek voorzichtig de K+-selectieve elektrode in CA1 stratum radiatum ongeveer 50 µm diep, door het langzaam het verlagen van de elektrode over ongeveer 3-4 seconden. Toestaan dat het potentieel om te stabiliseren in de elektrode voordat u stimulaties toepast op het segment: dit duurt meestal 5 tot 10 minuten. Als het segment spontane vertoont veranderingen in extracellulaire K+ vervolgens negeren en herhaal dit proces met een nieuw segment.
- Maatregel opgeroepen K+ release
- Toepassing treinen van elektrische stimulatie (8 pulsen) door handmatig het indrukken van de trekker op de stimulator tijdens het digitaal opnemen van reacties. Toepassing stimulatie bij 10 Hz en 1 ms pulsbreedte, vanaf 10 µA stimulans amplitude.
- Toenemende stimulatie amplitudes worden toegepast met een factor 2 totdat een maximale amplitude van K+ reactie wordt gedetecteerd. Als u geen antwoord niet wordt weergegeven, de positie van de K+ -elektrode dichter te verplaatsen naar de site van de stimulatie in 100 µm in stappen
- Het bepalen van de amplitude van de stimulans die de helft van de maximale respons oplevert. In onze ervaring is dit tussen 40-160 µA, afhankelijk van de kwaliteit van de voorbereiding, de leeftijd van het dier en de afstand tussen de elektroden van de stimulatie en selectieve K+ -elektrode.
- In hetzelfde segment, met behulp van de amplitude van een stimulus op één stap lager is dan de amplitude die de helft van de maximale reactie produceert (bijvoorbeeld als 80 µA een half-maximale-reactie produceert, gebruikt 40 µA) prikkel treinen van het toenemende aantal pulsen van toepassing. Aanvankelijk hebben we treinen van 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 en 128 pulsen gebruikt.
- Om te bevestigen dat K+ signalen zijn gemedieerd door actiepotentiaal afvuren van het elektrisch gestimuleerd Schaffer zekerheden bad, 0,5 µM TTX in ACSF van toepassing voor 10 minuten en herhaalt u het protocol stimulatie. Geen evoked reacties moeten worden nageleefd.
- Na het beëindigen van het segment experiment, bevestigen de elektrode heeft haar responsivity onderhouden door opnieuw kalibreren de elektrode in de ijkoplossingen en waarborgen van de reactie is niet afgeweken door meer dan 10% van de eerste kalibratie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij bereid voor selectieve meting van extracellulaire K+, ion-selectieve microelectrodes bekleed met een hydrofobe laag via silanization van schone borosilicaatglas pipetten (figuur 1A). Deze coating kan de K+ -ionophore met valinomycin om te rusten op het puntje van de elektrode en toestaan dat alleen K+ flux via een smalle opening aan het uiteinde van de elektrode (figuur 1B). Na de priming de elektroden met de zoutoplossing teruggestort en de K+ -ionophore, kunnen de elektroden worden getest voor hun snelle en lineaire reactie op Stapsgewijze veranderingen in Bad K+ concentraties (Figuur 3 bis) en hun reactie op Bad K+ wijzigingen gedurende het kalibratietraject (figuur 3B) in een zoutoplossing of ACSF op een wijze voorspeld door de Nernst vergelijking2. De verandering in de potentiële steady-state kan worden uitgezet tegen het bad K+ concentratie om te bepalen van de helling van de lijn, die ongeveer 58.2 moet mV per log [K+], volgens de Nernst-vergelijking, en maar liefst 52 mV per Log [K+] (Figuur 3 c). We daarnaast getest van het reactievermogen van de K+ Ionselectieve electroden en vond dat ze gereageerd op een verandering van de 5.5 mM in K+ met opkomst en verval tijd constanten voor ongeveer 85 ms (figuur 3D,E).
Het elektrofysiologische opname tuig bestaat uit een standaard rechtop Microscoop aangesloten op een LCD-scherm voor het identificeren van de plaatsing van het stimuleren en het opnemen van elektroden. Geen speciale optica nodig zijn voor de visuele plaatsing van de K+ en stimulatie elektroden; We gebruiken een 5 x of 10 x objectief en witte licht van een halogeen lamp, maar een witte LED in plaats daarvan gebruikt kan worden. De stimulerende elektrode is aangesloten op de uitgang van een stimulus isolator, die depolarizing huidige via de getimede bezorging van pulsen van een stimulator of andere dergelijke timing-apparaat levert. Met andere woorden, levert de stimulator treinen van 2 V, 10-20 Hz timing pulsen aan de prikkel isolator. Na ontvangst van deze pulsen, levert de stimulans isolator vervolgens de gewenste stroom aan de elektroden van de stimulatie. De opname-elektrode is verbonden met een elektrode-houder, aangesloten op een headstage, versterker en A/D Raad van bestuur, die de interface naar een PC met elektrofysiologische opnamesoftware (figuur 4A). Nadat de elektrode is met succes gekalibreerd en de acute segmenten zijn opgesteld, kan het segment in het perfusaat ACSF worden geplaatst. Ter stimulering van de collaterals Schaffer, de K+-selectieve elektrode wordt geplaatst binnen de CA1 stratum radiatum en het veld stimulatie elektrode is geplaatst binnen de CA3 (figuur 4B).
Zodra de elektroden zijn geplaatst en de opname van K+ een stabiele basislijn heeft bereikt, dan pulsen van verhoging van de huidige amplitude kunnen worden toegepast op het segment (Figuur 5, bovenaan). De golfvorm van deze activiteit verschijnt als een snelle toename van K+ met een exponentiële afname-tempo, die met toepassing van de TTX (Figuur 5, bodem) is afgeschaft.
Figuur 1 : Diagram van silanization reactie en K+ selectieve micro-elektrode architectuur. A. schematische weergave van silanization reactie die tussen de blootgestelde polar hydroxylgroepen van de borosilicaat glas en de silanization reagens dichlorodimethylsilane (DDS optreedt). Deze reactie maakt het oppervlak van het glas hydrofobe, waarmee de K+ ionophore om te vormen van een dunne membraan. B. Diagram van de K+ selectieve micro-elektrode. De elektrode is teruggestort met zoutoplossing en de selectieve oplosbaarheid van K+ is een plaats in een 1-2 mm dikke laag op het puntje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Diagram van DDS extractie. Schematische weergave van de vervangingsprocedure stikstof voor DDS extractie uit een container. DDS is vluchtig en brandbaar en kan heftig reageren met atmosferische gassen wanneer daarom in hoge concentraties is het noodzakelijk ter vervanging van de DDS verwijderd met inert stikstofgas. Een ballon gevuld met stikstof is verbonden met een naald via een spuit of passende slangen. Deze naald wordt ingebracht via het afdichtmiddel aan de container waardoor stikstof (N2) gasstroming in de container. Afzonderlijk, is een lange (3-10 cm) naald verbonden met een spuit van 1 mL en ingevoegd in de container. Deze spuit wordt vervolgens gebruikt om uit te pakken van DDS, maar alleen stikstofgas van de container opgeven kunt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Kalibratie van microelectrodes. A. Bad perfusie toepassing van verschillende K+ concentraties in een zoutoplossing kan snel en omkeerbaar produceren Nernstian veranderingen in het potentieel over het uiteinde van de elektrode. B. stapsgewijze toepassing van K+ in ACSF roept een karakteristiek en stabiele verandering in het potentieel van de tip elektrode. C. Plot van de mV-wijziging van de selectieve K+ -elektrode in reactie op de toenemende concentraties van K+ in vier elektroden; de R-2 is 0.9995 voor deze vier elektroden. D. Snel perfusie Bad systeemtoepassing van 10 mM K+ veroorzaakt een reactie stap in spanning over het uiteinde van de selectieve elektrode K+ . E. Plot van de gemeten respons tijden (tau in ms); geen verschil tussen de tijd van opkomst en verval werd ontdekt (bedoel ± SEM, p = 0.939, twee sample t-test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Apparaat voor het meten van extracellulaire K+ . A. de elektrofysiologie tuig bestaat uit een Microscoop vastgesteld aan een anti-trillingen-tabel met een aangesloten camera en LCD-display voor segment visualisatie. De elektrode K+ is bevestigd aan een headstage, de versterker en de analoog naar digitaal bestuur die het signaal naar een aangesloten PC met elektrofysiologische opnamesoftware uitgangen. De elektrische stimulatie elektroden worden aangesloten op een stimulans isolator die variëren van de amplitude van de stimulatie en een stimulator voor timing stimulans levering. B. Diagram van het preparaat segment en de locatie van de plaatsing van de elektroden van de verschillende in het segment. CA3 kan ongeveer worden geïdentificeerd als het gedeelte van de hippocampus goede laterale aan de cellaag van de submodule op de hippocampal genu, met de stratum radiatum aan de piramidale cellaag rostraal vallen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Meting van elektrisch evoked K+ release. Representatieve sporen van K+ vrijwaart van de elektrode van de opname onder basale omstandigheden (boven) en hun verlies bij de aanvraag van tetrodotoxine (0,25 µM) om 5 minuten vóór opname (onder). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode die wij hier beschrijven heeft ons om te beoordelen van K+ dynamics in reactie op elektrische stimulatie van Schaffer zekerheden in acute hippocampal plakjes van volwassen muizen toegestaan. Onze methode voor te bereiden K+ ion selectieve microelectrodes is vergelijkbaar met de eerder beschreven procedures12,13,14,15. Deze methode heeft echter voordelen ten opzichte van alternatieve elektrode configuraties in die zin dat het snelle en ongecompliceerde ter voorbereiding van de selectieve microelectrodes K+ . Na de juiste kalibratie, deze elektroden bleken te krachtig K+ dynamics in plakjes meten tijdens elektrische stimulatie en dergelijke reacties werden geblokkeerd door TTX. In deze experimenten, werden stimulaties van 80-160 uA bij 10 Hz gebruikt; Niettemin, optimalisatie van stimulatie voorwaarden voor een bepaald experiment en voor een gebied van de hersenen van belang zal worden verlangd. Deze waarden worden vermeld als een gids.
De helling van de reactie van de elektroden moeten 58.2 mV per log [K+]. Een dergelijke waarde wordt voorspeld uit de Nernst en Nicolsky-Eisenman vergelijkingen voor een selectieve semi-permeabel membraan van K+ ; de laatste is beter goed voor interacties tussen ionen16. Als de elektrode niet op de voorspelde manier reageert, zou dit zijn voor een van de twee primaire redenen. Ten eerste zou het silanization kunnen onvoldoende, waardoor het membraan worden verloren of zout bruggen te vormen. Bevestigen dat het membraan is intact door observatie door de Microscoop, moet er een duidelijke interface tussen de pipet-oplossing en het membraan. Een andere reden, zou de aanwezigheid van bellen in de pipet die de doorstroming van huidige van de draad van zilverchloride belemmeren. Als bubbels worden waargenomen, verwijder dan de pipet en flick krachtig om ze te verwijderen. Als deze oplossingen niet, opnieuw maken een andere K+ selectieve elektrode of repeat silanization voor langer of bij hogere temperaturen. Het is echter belangrijk te herhalen van deze essentiële controles telkens een nieuwe regio van de hersenen is onderzocht of een nieuwe micro-elektrode wordt getest.
Twee specifieke versterkers werden gebruikt in deze experimenten, maar andere versterkers kunnen worden gebruikt zolang de ingangsimpedantie groter dan of gelijk aan 500 MΩ is. De elektroden met zowel 500 MΩ en 5 GΩ input impedances hebben gekalibreerd, we vonden was er geen verschil in de helling van de reactie van de spanning met een van deze instellingen over een bereik van K+ concentraties (56.9 ± 0,7 en 56,5 ± 0,9 mV tienvoudige wijzigen in per [K+ < / C1 >] voor 500 MΩ en 5 GΩ impedances, respectievelijk input; P = 0.759, gepaarde t-test, n = 4 elektroden).
We gebruikten ook snelle oplossing schakelaars te schatten de reactietijd van de elektroden op een bekende sprong in [K+] van 4.5 tot 10 mM (figuur 3D). De elektroden reageerde met de tijden van opkomst en verval (tau) van 85 ± 12 en 85 ± 15 ms, respectievelijk. In dit verband reageren dat de kinetiek van de uitwisseling oplossing voor onze aangepaste snelle oplossing switcher was 85 ± 27 ms. Vandaar de K+ Ionselectieve electroden met kinetiek zo snel als de oplossing switcher die we werkzaam en veel sneller dan de dynamiek van K+ in de extracellulaire milieu als gevolg van Schaffer collateral stimulatie (Figuur 5). Deze gegevens duiden erop dat K+ Ionselectieve electroden kunnen worden gebruikt voor het schatten van de kinetiek van K+ accumulatie en ruimen van bouwterreinen in hersenweefsel. Werkt echter in de toekomst passende controles en kalibraties op een case-by-case basis nodig zullen zijn. Wij stellen voor dat er waardevolle tijd inzicht in de oplossing uitwisseling kinetiek in de zaal van uw opname.
We vonden drie kritisch belangrijke factoren die invloed hebben op de kwaliteit en de robuustheid van K+ metingen in plakjes. De eerste is de kwaliteit van de voorbereiding, zowel de weefsel gezondheid en leeftijd van de dieren gebruikt lijken te worden betrokken. Voor deze studie hebben we gebruikt C57/Bl6N muizen die ~ 12 oud weken. Bij zeldzame gelegenheden vonden we segmenten met spontane K+ schommelingen ten bedrage van ~0.1 mM en het duurt 5-10 seconden; deze segmenten werden weggegooid. De tweede is de kwaliteit van de opname-micro-elektrode. Het primaire probleem is de tijd en temperatuur die wordt gebruikt voor silanization van het capillaire getrokken glas. Het is raadzaam > 170 ° C gedurende ten minste 6 uur (tot overnachting is acceptabel) of bij 200 ° C gedurende 30 minuten. Onvoldoende verwarming van de elektroden met de silanization-reagens kan leiden tot elektroden die niet een steady-state potentiële vanwege geleidelijk verlies van de ionophore K+ onderhouden. Daarnaast bij de voorbereiding van de elektroden, raden wij het plaatsen van een dun laagje (1-2 mm) van de ionophore K+ in de tip met een diameter van 10-20 µm dat wil zeggen op ongeveer de grootte van een gemiddelde cel lichaam (figuur 1B). Breek niet de overdreven breed, tip of het K+ selectieve membraan integriteit zal verliezen en de elektrode zal mislukken. Deze stap wellicht wat oefening om de uiteinden van het juiste formaat. K+ Ionselectieve electroden met een te fijne tip of te dik voor een laag hebben trage reacties, in vergelijking met goed geconstrueerde elektroden. De derde factor is de afstand tussen de elektrode stimulatie en de selectieve K+ -elektrode. We hebben gebruik gemaakt van een inter elektrode afstand van ongeveer 500 µm, echter de optimale afstand kan aanzienlijk variëren met de individuele hersenen gebied en moet zorgvuldig worden overwogen voor de bijzonder experiment bij de hand.
Naast de configuratie van één vat, er zijn momenteel verschillende methoden voor het maken van K+-selectieve microelectrodes in bipolaire en concentrische formaten17. Vergeleken met de gepubliceerde beschrijvingen van deze methoden, enkellijns elektroden hebben twee belangrijke nadelen: 1) een iets grotere tip diameter (~ 10 vs 4 µm), waardoor grotere verstoring van de extracellulaire ruimte comparted te bipolaire concentrische elektroden, en 2) incompatibiliteit met gelijktijdige meting van meerdere ion-soorten zoals de bipolaire elektroden. Echter, de elektroden enkellijns bieden verschillende voordelen. Met name deze elektroden in minder dan vijf minuten kan worden vervaardigd en zijn daarom meer besteedbaar en kan worden gemaakt en snel gekalibreerd voor experimenten. Het risico van breuk van de elektrode tijdens de cursus experimenten daarom minder van een punt van zorg. Bovendien, omdat de grond elektrode en de opname-elektrode fysiek door het volume van het bad gescheiden zijn, is er geen kans voor de vorming van zout bruggen op het puntje van de elektrode, die tot falen van de elektrode in de concentrische en bipolaire leiden kan elektroden. De reactietijd van de elektroden enkellijns is sneller dan de bipolaire elektroden en waarschijnlijk vergelijkbaar met concentrische elektroden (~ 20 ms), hoewel onze snelle perfusie-systeem alleen toegestaan een meting van responstijden volgorde 80 ms (figuur 3E ). Bovendien bieden deze elektroden minder ruis in vergelijking met bipolaire elektroden, die hebben meer tip weerstand en vereisen het gebruik van versterkers met hogere invoer weerstand. Tot slot, deze elektroden vereisen niet het gebruik van een speciale micromanipulator of headstage zoals is vereist voor concentrische elektroden. Per saldo, de voordelen van de constructie en gebruiksgemak van enkellijns elektroden zwaarder weegt dan de nadelen.
De aanpak die we hier gebruikt voor het meten van de dynamiek van K+ in segmenten kan worden gebruikt in vele hersengebieden te bestuderen van K+ verordening. Hoewel dit protocol het gebruik van K+demonstreert-Ionselectieve electroden voor de metingen van de dynamiek van elektrisch evoked kalium-ionen in brain weefsels, dit protocol kan worden over het algemeen gebruikt in veel verschillende weefsels waar het wenselijk is te K+ dynamiek te meten. Dergelijke situaties kunnen de dynamiek van de spontane en wijzigingen opneemt in antwoorden op farmacologische, optogenetic, of chemogenetic cellulaire activering. Deze microelectrodes kunnen worden gemaakt met voldoende kwaliteit en betrouwbaarheid verkregen, mogelijk maakt de snelle integratie van deze techniek in een laboratorium-werkset. De gedetailleerde analyses van K+ concentraties in gezondheid en zieke Staten zal verder inschakelen detectie en kwantificering van hoe verschillende onderdelen van de moleculaire en cellulaire tot rust K+ concentraties in de hersenen3bijdragen, 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het Khakh lab werd gesteund door de NIH MH104069. De Mody lab werd gesteund door de NIH NS030549. J.C.O. bedankt de NIH T32 Grant(NS058280) voor Training van neurale micro schakelingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
