Summary
Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini katkıda bulunmak ve ekstraselüler K+ konsantrasyon hücresel uyarılabilirlik çok önemli bir düzenleyicisidir. Biz nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Böyle elektrotları kullanarak elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics yetişkin Hipokampal dilimleri içinde ölçüm sağlar.
Abstract
Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini önemli ölçüde katkıda bulunmak, bu nedenle, ve ekstraselüler K+ konsantrasyonu hücre uyarılabilirlik çok önemli bir regülatör. Aksiyon potansiyeli altında yatan voltaj bağımlı iyon kanalları için kapalı, açık ve Inaktif devletler arasında denge ilerletmeniz istirahat membran potansiyeli ve hücresel uyarılabilirlik ekstraselüler K+ etkiler konsantrasyonları değişmiş başlatma ve iletken. Bu nedenle, doğrudan hücre dışı K+ dynamics sağlık ve hastalıklı Birleşik ölçmek için değerlidir. Burada, nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Biz onları elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics ölçmek için yetişkin Hipokampal beyin dilimler halinde dağıtılabilir. Böyle elektrotlar akılcı kullanımı ekstraselüler K+ konsantrasyonları sinir sisteminde kontrol hücresel ve biyofizik mekanizmalar değerlendirmek için gerekli araç kitinin önemli bir parçasıdır.
Introduction
Potasyum iyon konsantrasyonlarının sıkıca beyinde düzenlenir ve onların dalgalanmaları istirahat membran potansiyeli tüm hücrelerin üzerinde güçlü bir etkisi uygulamak. Bu kritik katkıları ışığında Biyoloji önemli bir amacı sıkı K+ konsantrasyonu düzenlemek için kullanılan hücresel ve biyofiziksel mekanizmaları hücre dışı alan vücut1 farklı organlarda belirlemektir , 2. bu çalışmalarda önemli bir gereksinimi K+ konsantrasyonları doğru ölçmek için yeteneğidir. Sağlıklı ve hastalıklı Birleşik beyinde homeostazı potasyum katkıda birçok bileşeni tanımlanan3,4,5, olmasına rağmen daha fazla ilerleme özel yapısı nedeniyle yavaşladı İyon seçici microelectrodes potasyum ölçüm için hazırlanıyor. Elektrot sensörler K+ konsantrasyonları vitro, dokusu dilimlerin ve içinde vivoölçmek için altın standart temsil eder.
K+ için yeni yaklaşımlar izleme bunlar biyolojik ilgili aralığı K+ konsantrasyonları algılamaz veya tamamen biyolojik sistemlerde, her ne kadar incelenmesi değil ancak optik sensörler, kullanarak ilk sonuçları geliştiriliyor gelecek vaat eden6,7,8görünür. Elektrot dizilerin Uzaysal çözünürlük9artırabilirsiniz optik sensörler için karşılaştırıldığında, microelectrodes temelde bir nokta kaynak ölçüyle iyonlar, sınırlı olmakla birlikte. Bu makale K+ dynamics izlemek için tek namlulu elektrot sensörler üzerinde duruluyor.
Bu çalışmada, biz K+ selektif microelectrodes, (104 kat K+ Na+ seçicilik) çok seçici izin veren bir valinomycin tabanlı potasyum ionophore kullanarak yapmak için detaylı kademeli işlemler raporu K+ membranlar10üzerinden hareket. Doğal olarak meydana gelen bir polipeptit valinomycin K+ geçirgen gözenek davranır ve K+ akış aşağı 's elektrokimyasal gradyan kolaylaştırır. Biz de elektrotlar, kalibre açıklar nasıl depolamak ve bunları kullanmak ve nihayet onları K+ konsantrasyon dinamiklerini akut Hipokampal beyin dilimleri yetişkin fareler üzerinden ölçmek için daà ° ã½tma. Böyle elektrotlar ile birlikte hücre dışı K+ dynamics düzenleyen için önerilen belirli iyon kanalları eksikliği genetiği değiştirilmiş fare kullanımı K ortam konsantrasyonu kontrol etmek için sinir sistemi tarafından kullanılan hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak + ekstrasellüler ortamında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Ulusal Enstitüsü, Sağlık Rehberi uygun olarak bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için yapılmıştır ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles Chancellor's hayvan Araştırma Komitesi tarafından kabul edildi. Bütün fareler ile yiyecek ve su kullanılabilir ad libitum 12 h koyu ortamda muhafaza. Bütün hayvanlar hiçbir belirgin davranış değişiklikleri ile sağlıklı, önceki çalışmalarda dahil edilmemişlerdir ve ışık döngüsü sırasında kurban edildi. Deneyler için veri--dan yetişkin fareler (6-8 hafta tüm deneyler için eski) toplanmıştır.
1. K+ selektif microelectrodes hazırlanması
- Borosilikat cam Silanization
- Yeterli cam kılcal paketinden çıkarın ve 50 mL konik tüp içine yerleştirin. Dön konik tüp nazik ajitasyon HCl gecede veya en az 6 saat ile 1 M HCl. yıkama elektrotlar ile doldurun.
- Kısaca kılcal % 70 etanol ile durulayın ve 6-8 saat için 100-120 ° C'de tamamen kuru. Yıkanmış kılcal kapları susuz kalsiyum sülfat kurutucu ile 4 hafta daha da kullanmadan önce için saklayın.
- Silanization önce kılcal bir elektrot çektirmenin kullanarak iyi bahşiş çek. Kullandığımız microelectrodes yaklaşık 2-5 mikron çapında vardır. Cilt yağlar ile silanization engelleyebilir gibi her zaman eldiven ile yıkanmış kılcal başa.
- Microelectrodes elektrotlar alttan uç kırılma önlemek için yüksek bir cam kap içine yerleştirin. Autoclavable teyp veya benzer yapışkan bant kullanarak kapsayıcı microelectrodes saptamak.
- Yaklaşık 0.5 mL % 5 dichlorodimethylsilane (DDS) silanization çözeltisi azot değiştirme yöntemini kullanarak kendi kapsayıcıdan Kaldır (bkz. Şekil 2). Bir balon azot gazı ile doldurun ve bir şırınga veya tüp ve iğne için balon ekleyebilirsiniz. İğne ile uzun bir iğne ayrı bir şırınga DDS kadar çizerken DDS konteyner içine yerleştirin.
- Silanization çözüm dropwise Pipetler ipuçları için geçerlidir ve hemen kapağı. Microelectrodes silanization çözüm ile Önceden ısıtılmış (170-180 ° C) laboratuvar fırın içine 10-12 saat için ya da 200-220 ° C'de 30 dakika boyunca tutarak konteyner yerleştirin
- Kuluçka sonra fırın ve plaka fırından çıkarın. Olarak son derece sıcak plaka kuluçka makinesi çıkartırken dikkatli olun. 10-15 dakika soğumasını Züccaciye Mağazaları için oda sıcaklığında bir bankta plaka yerleştirin.
- Microelectrodes (kaset kesmek için bir jilet veya neşter bıçak kullanarak) plaka kaldırmak ve nem alıcı bir dolu hava geçirmez konteyner içine koyun. Silanized microelectrodes nem ücretsiz tutulması için ilâ 1 hafta silanization takip kullanılabilir.
- Elektrotlar priming
- K+ ionophore kokteyl stok çözeltisi hazırlamak: % 5 w/v valinomycin, % 93 v/v 1,2-Dimetil-3-nitrobenzene, %2 w/v potasyum tetrakis(4-chlorophenyl) Bor11. Bu çözüm bir soluk sarı renktir. Oda sıcaklığında opak hava geçirmez bir kapta tutun. Düzgün depolanan bu çözüm aylar sürebilir eğer.
- 10 mM 300 mM NaCl pH 7.4 arabelleğe HEPES stok çözeltisi hazırlamak. Elektrot bir kelepçe ve backfill bir şırıngaya bağlı 28 G microfil ucu kullanarak tamponlu NaCl ile sabitleyin. Tuzlu çözüm elektrot ucunu sonuna ulaştı gözlemlemek. Elektrot akım akışı ile engelleyebilir büyük baloncuklar ücretsiz olduğunu doğrulayın.
- Elektrot ucunu yaklaşık 10-20 µm için geniş, kör tarafı bistüri veya jilet kullanarak bölünürler.
- Bir micropipette kullanarak, küçük damlacık (~0.1 µl) elektrot ucuna yakın K+ ionophore uygulanır. Elektrot silanized düzgün olmuşsa damlacığı ucu kırık emilir. Dolgu için 1-2 mm K+ ionophore ve Kaldır fazla elektrot kağıt mendil kullanarak.
2. K+ selektif Microelectrodes kalibrasyonu
- Kalibrasyon çözüm hazırlanması
- KCl eşit Osmolarite yapay serebrospinal sıvı (ACSF) çeşitli konsantrasyonları çözümleri ile KCl NaCl değiştirerek hazırlayın. Biz 0,1, 1, 4.5, 10 ve 100 mM K+ ACSF, elektrot kalibrasyon için kullanılır. Bu kalibrasyon çözümler tariflerini Tablo 1' de listelenmiştir.
| Kimyasal | MW | son mM | 0,1 mM [K +] | 1 mM [K +] | 4.5 mM [K +] | 10 mM [K +] | 100 mM [K +] |
| (g / mol) | |||||||
| NaCl | 58.44 | değişir | 1,51 g | 1.50 g | 1.44 g | 1.4 g | 0,345 g |
| KCl | 1 M hisse senedi | değişir | 20 µl | 200 µl | 900 µl | 2 ml | 20 ml |
| CaCl2 | 1 M hisse senedi | 2 | 400 µl | ||||
| MgCl2 | 1 M hisse senedi | 1 | 200 µl | ||||
| NaH2PO4 | 119.98 | 1.2 | 0.29 g | ||||
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 0,437 g | ||||
| D-glikoz | 180.16 | 10 | 0,360 g | ||||
| Su | QS 200 ml | ||||||
Tablo 1. Potasyum kalibrasyon çözüm
- Elektrot kalibrasyon
- Tüm çözümleri ile % 95'i O2/5% CO2 deneme başlamadan önce en az 20 dakika kabarcık. Banyo 4,5 mM [K+] ile Ventriküler başlamak dakikada 3 mL oranında ACSF. K+ seçici elektrot elektrot tutucu elektrot headstage manipülatör üzerinde bağlı yerleştirin. Bu headstage için uygun bir amplifikatör bağlıdır. Elektrot ucunu banyo perfusate yerleştirin.
- Ag/AgCl zemin elektrot aynı çözüm içinde boğulmuş olduğunu ve akış sabit olduğundan emin olun. Kalibrasyon çözüm kademeli bir şekilde uygulayın ve olası değişiklikler mV içinde kaydetmek arasında elektrot uç. İstikrarlı bir değer sonraki çözüme geçmeden önce ulaşma potansiyeline elektrot uç bekleyin
- Kararlı duruma voltaj değişikliği yanıt kalibrasyon çözüm uygulamaya elektrot uç olarak ölçmek. Elektrot yanıt eğimi en az 52 58 fazla olduğunu doğrulayın ve mV başına günlük değişim [k+].
3. akut Hipokampal beyin dilimleri hazırlanması
- Dilim çözümleri hazırlanması
- 500 mL sukroz hazırlamak kesme çözüm oluşur: 194 mM Sükroz, 30 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 10 mM D-glikoz, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4ve 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, % 95'i O2 ve %5 CO2ile doymuş.
- 1-2 litre kayıt çözüm (ACSF) oluşan hazırlamak: 124 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glikoz, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4ve 26 mM NaHCO3; (sonra köpüren) pH 7.3 7.4, 290-300 mOsm, % 95'i O2 ve %5 CO2ile doymuş. Çözüm kayıt ile beyin dilim sahibi odası içeren bir kabı ve 32-34 ° C'de tutmak Vibratome odası buz-su slush ile doldurun.
- Akut dilim hazırlık
- Derin bir fare çan ile 2-3 mL isoflurane precharged bir kavanoza koyarak anestezi. Ayak çimdik refleks için kontrol ve non-yanıt veren, hızlı bir şekilde hayvan iletişim kuralı gerektirir gibi keskin makas veya Giyotin bir çift kullanarak başını kesmek.
- Orta çizgi boyunca kafa derisi kesmek için kafatasının Kaudal bölümünden makası kullanarak 2-3 cm kesi yapmak. El ile kafa derisi geri çeker iken, iki 1 cm Yatay kesikler deliği magnum kenarlarında üzerinden kafatası yapmak. Sonra iyi makası kullanarak, bir kesi uzunluğu boyunca kafatasının arkasından orta hat burnuna kafatası kesti.
- İyi forseps orta hat takılı kullanarak, iki porsiyon kazıma kafatasında geri çek. Fare beyin kafatasından ayıklamak ve serebellum ve beyin Kaudal ve rostral bölümleri sırasıyla bulunan olfaktör ampuller kaldırmak için bir bıçak kullanın. Bunlar ayrı them korteks büyük çatlaklar belirlenebilir.
- Beyin blok süper yapıştırıcı kullanarak vibratome tepsi üzerine monte. Vibratome tepsi buz gibi soğuk kesme çözüm ile doldurun.
- Doku bölümleri 300 µm kalınlık, koronal uçakta kesti. Genellikle 6 koronal Hipokampal dilimleri toplanabilir.
- Her bölüm kesmek sonra hemen kabı 32-34 ° C'ye sıcak tutan dilim için dilimleri aktarın Bölümü içeren kabı kaldırmadan önce bölümler 20 dk için bu sıcaklıkta tutmak ve oda sıcaklığında en az 20-30 dakika kayıt önce burası.
4. elektriksel olarak uyarılmış K+ Dynamics ölçümü
- Dilim hazırlık kurma
- Yavaşça banyoda Pasteur pipet kullanarak beyin dilim yerleştirin ve nazikçe Platin harp naylon dizeleri ile olan yerde tutun.
- İki kutuplu uyarıcı elektrot uçları birbirine paralel ve dilim boyutunda düzeyiyle olun. Yavaş yavaş, 6-7 saniye boyunca, elektrotlar CA3 stratum radiatum yaklaşık 40-50 µm derin Schaffer de¤erler uyarmak için ekleyin. Koronal bölümlerde CA3 yaklaşık Hipokampus uygun lateral Hipokampal genu granül hücre katmanında bölümüyle piramit hücre katmanı düşen medial ve ventral stratum radiatum ile tespit edilebilir.
- Dikkatle K+Ekle-seçici elektrot CA1 stratum radiatum yaklaşık 50 µm elektrot yaklaşık 3-4 saniye içinde yavaş yavaş azaltarak derin içine. Dilimi elektrodlar uygulamadan önce elektrot arasında dengelemek için potansiyel izin: Bu genellikle 5-10 dakika sürer. Dilimi spontan sergileyen Eğer değişiklikleri ekstraselüler k+ sonra atmak ve yeni bir dilim ile bu işlemi tekrarlayın.
- K+ sürüm ölçü uyarılmış
- Trenler elektrik stimülasyon (8 bakliyat) el ile uyarıcı tetiğe dijital olarak yanıt kaydederken iç karartıcı tarafından uygulanır. Uyarımı 10 Hz ve 10 µA uyarıcı genlik başlangıç 1 ms darbe genişliği de uygulanır.
- En fazla bir K+ yanıt genlik gelinceye artan stimülasyon genlikleri 2 kat uygulanır. Herhangi bir yanıt yoksa, 100 µm artışlarla stimülasyon sitedeki K+ elektrot daha yakın konumunu taşımak
- Yarım maksimal yanıt üreten uyarıcı genlik belirlemek. Deneyim, bu 40-160 µA, bağlı olarak üzerine hazırlık kalite, hayvan ve stimülasyon elektrotlar ve K+ seçici elektrot arasındaki mesafe yaş arasındadır.
- Bir adımda yarım maksimal yanıt üreten genlik düşük bir uyarıcı genlik aynı dilimi kullanarak (örneğin 80 µA bir yarı-azami yanıt neden oluyorsa, 40 µA kullanın) nabız sayısı artan uyarıcı trenler uygulamak. Başlangıçta, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 ile 128 bakliyat tren kullandık.
- K+ sinyalleri elektriksel olarak uyarılmış Schaffer de¤erler banyo aksiyon potansiyeli ateş tarafından aracılı onaylamak için 0.5 µM TTX ACSF içinde 10 dakika boyunca uygulayın ve stimülasyon protokolü. Hiçbir çatışmaya yanıt dikkat edilmelidir.
- Dilim deney bitirdikten sonra elektrot elektrot kalibrasyon çözüm yeniden ayarlama tarafından onun responsivity ettirmiştir ve yanıt sağlanması fazla % 10 oranında ilk kalibrasyon dan sapma değil onaylamak
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre dışı K+seçici ölçüm için iyon-seçici microelectrodes temiz borosilikat cam Pipetler (şekil 1A) silanization ile hidrofobik bir tabaka ile kaplı hazırladık. Bu kaplama valinomycin elektrot uç vasıl dinlenme ve sadece K+ akı elektrot uç (şekil 1B) dar bir delikten izin vermeyi içeren K+ ionophore sağlar. Elektrotlar göre backfilled tuzlu çözüm ve K+ ionophore ile priming sonra elektrotlar onların hızlı ve lineer tepki banyo K+ konsantrasyonlarda (şekil 3A) kademeli değişiklikler için ve kendi yanıt almak için test edilebilir banyo K+ (şekil 3B) kalibrasyon aralığında serum fizyolojik içinde değişir veya ACSF bir şekilde Nernst denklemi2tarafından öngördü. Potansiyel sabit durumundaki değişikliği yaklaşık 58.2 olmalıdır çizgisinin eğimini belirlemek için banyo K+ konsantrasyon karşı çizilebilir mV başına günlük [K+], Nernst denklemi ve en az 52 göre mV başına oturum [K+] (şekil 3 c). Ayrıca yanıt K+ seçici elektrot sınadı ve onlar K+ 5.5 mM değişikliği yükselişi ve çürüme zamanı sabitleri yaklaşık 85 MS (3D şekil,E) ile cevap buldu.
Elektrofizyolojik kayıt teçhizat uyarıcı yerleşim belirlenmesi ve elektrotlar kayıt bir LCD ekran bağlı standart dik mikroskop oluşur. Hiçbir özel optik K+ ve stimülasyon elektrotlar görsel yerleştirmek için gereklidir; Biz bir 5 x veya 10 x objektif lens ve halojen ampul beyaz ışık kullanır, ancak beyaz LED yerine kullanılabilir. Uyarıcı elektrot geçerli bir uyarıcı ya da diğer tür zamanlama cihazı bakliyat zamanlanmış teslimi ile depolarize sunar bir uyarıcı izolatör çıkışını bağlıdır. Başka bir deyişle, uyarıcı trenler 2 V, 10-20 Hz zamanlama bakliyat uyarıcı izolatör sunar. Bu darbeleri aldıktan sonra uyarıcı izolatör daha sonra istenen geçerli stimülasyon elektrotlar teslim eder. Kayıt elektrot bir elektrot tutucu bir headstage, amplifikatör ve A/D kurulu, hangi Elektrofizyolojik kayıt yazılımı (şekil 4A) bir PC'ye arabirim bağlı, bağlandığı. Elektrot başarıyla kalibre edilmiş ve akut dilimleri hazırlanan sonra dilimi ACSF perfusate yerleştirilebilir. Schaffer de¤erler, K+uyarmak için-seçici elektrot CA1 stratum radiatum içinde yerleştirilir ve alan stimülasyon elektrot CA3 içinde yerleştirilir (şekil 4B).
Bir kez elektrotlar yerleştirilir ve K+ kayıt istikrarlı bir temel ulaştı, o zaman geçerli genlik artan bakliyat dilimi uygulanabilir (şekil 5, üst). Bu faaliyet dalga TTX uygulama (şekil 5, alt) kaldırılmış bir üstel çürüme oranı ile K+ hızlı bir artış olarak görünür.
Resim 1 : Silanization tepki ve K+ seçici elektrot mimarisi diyagramı. A. borosilikat cam maruz kutup hidroksil grupları ve silanization reaktif dichlorodimethylsilane (DDS) arasında oluşan silanization reaksiyon şematik gösterimi. Bu reaksiyon hidrofobik, ince bir zar oluşturmak K+ ionophore sağlayan cam yüzeyine işler. K+ seçici elektrot B. diyagramı. Elektrot göre backfilled ile tuzlu eriyik ve K+ seçici çözüm 1-2 mm kalın bir tabaka uç yerde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Diyagramı DDS ekstraksiyon. Azot değiştirme yordamı için DDS çekme--dan bir kapsayıcı şematik gösterimi. DDS uçucu ve yanıcı ve yüksek konsantrasyonlarda bu nedenle etkisiz azot gazı ile kaldırıldı DDS değiştirmek için gerekli olduğunda şiddetle atmosferdeki gazlar ile tepki verebilir. Azot ile dolu bir balon bir iğne şırınga veya uygun tüp ile bağlanır. Bu iğne dolgu macunu konteyner azot gazı (N2) akışına izin kapsayıcısındaki aracılığıyla eklenir. Ayrı ayrı, bir uzun (3-10 cm) iğne 1 mL şırınga bağlı ve konteyner içine eklenmiş. Bu şırınga daha sonra sadece azot gazı konteyner girebilirsiniz DDS, ayıklamak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Microelectrodes kalibrasyonu. A. serum farklı K+ konsantrasyonlarda banyo perfüzyon uygulama hızla ve geri dönülebilir olarak üretebilir potansiyel değişimler Nernstian elektrot uç arasında. B. k+ ACSF içinde kademeli uygulama elektrot uç potansiyel bir karakteristik ve istikrarlı değişiklik çağrıştırır. C. arsa K+ seçici elektrot dört elektrotlar konsantrasyonlarda k+ artan karşılık mV değişimin; R2 dört bu elektrotlar için 0.9995 olduğunu. Ö. Hızlı perfüzyon sistem banyo uygulaması+ 10 mm K bir adım yanıt K+ seçici elektrot uç arasında gerilim neden olur. E. arsa ölçülen yanıtının zaman (MS tau); yükselişi ve çürüme zaman arasında bir fark olmadığı tespit edilmiştir (yani ± SEM, p = 0.939, iki örnek t-test). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : İçin hücre dışı K+ Ölçü aleti. A. bir ekli fotoğraf makinesi ve dilim görüntüleme için LCD ekran ile bir anti-titreşim tabloya sabit mikroskop Elektrofizyoloji teçhizat oluşur. K+ elektrot bir headstage, amplifikatör ve analog sinyal Elektrofizyolojik kayıt yazılımı ile ekli bir PC'ye çıktılar Dijital Pano için sabittir. Elektriksel stimülasyon elektrotlar stimülasyon genlik ve zamanlama uyarıcı teslimat için bir uyarıcı değişir bir uyarıcı izolatör bağlanır. Dilim hazırlık ve dilim çeşitli elektrot yerleştirme konumunu B. diyagramı. CA3 yaklaşık Hipokampus uygun lateral Hipokampal genu granül hücre katmanında bölümüyle piramit hücre katmanı rostral düşen stratum radiatum ile tespit edilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Elektriksel olarak uyarılmış K+ çıkış ölçümü. K+ temsilcisi izleri Bazal koşullar (üst) altında kayıt elektrot ve onların kaybı Tetradotoksin (0.25 µM) başvurusu (alt) kayıt önce 5 dakika üzerine yayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada tarif yöntemi bize K+ dynamics yetişkin fareler tarafından yapılan yanıt Schaffer de¤erler akut Hipokampal dilimleri içinde elektrik stimülasyon olarak değerlendirmek izin verdi. K+ iyon seçici microelectrodes hazırlama bizim daha önce açıklanan yordamları12,13,14,15' e benzer bir yöntemdir. Ancak, hızlı ve basit K+ selektif microelectrodes hazırlamak için o bu yöntemi alternatif elektrot yapılandırmaları üzerinde avantajları vardır. Uygun kalibrasyon sonra bu elektrotlar sağlam elektriksel stimülasyon sırasında K+ dynamics dilimleri içinde ölçmek için bulundu ve böyle yanıt TTX tarafından bloke edildi. Bu deneylerde, 80-160 uA 10 Hz değerinde elektrodlar kullanılmıştır; Ancak, en iyi duruma getirme stimülasyon koşullardan belirli bir deney ve ilgi bir beyin alan için gerekli olacaktır. Bu değerler bir kılavuz olarak listelenir.
Elektrotlar yanıt eğimi 58.2 olmalıdır mV başına günlük [K+]. Böyle bir değer için bir K+ seçici yarı geçirgen membran Nernst ve Nicolsky-Eisenman denklemleri üzerinden tahmin edilmektedir; İkincisi daha iyi iyonları16arasındaki etkileşimler hesapları. Elektrot öngörülen şekilde yanıt vermezse, bu iki temel nedenden biri için olabilir. İlk silanization yetersiz, kayıp ya da tuz köprüleri forma olmak membran neden olabilir. Onaylamak gözlem mikroskop aracılığıyla tarafından membran sağlamdır, pipet çözüm ve membran arasında açık bir arabirim olmalıdır. Başka bir nedenle geçerli gümüş klorür tel üzerinden akışını engel pipet kabarcıkları varlığı olabilir. Kabarcıklar gözlenir, sonra pipet ve şiddetle çıkarıp filmi kaldırın. Bu çözümler başarısız olursa, başka bir K+ seçici elektrot yeniden yapmak veya daha uzun veya daha yüksek sıcaklıklarda silanization için yineleyin. Ancak, her zaman yeni bir beyin bölgesi okudu ya da yeni bir elektrot test anahtar bu denetimleri yinelemek önemlidir.
İki belirli amplifikatörler bu deneylerde kullanılan, ama giriş empedansı sıfırdan büyük veya eşit 500 MΩ olduğu sürece diğer amplifikatörler kullanılan olabilir. Elektrotlar 500 MΩ ve 5 GΩ giriş impedances ile kalibre, bulduk K aralığı+ konsantrasyonları üzerinde hiçbir fark gerilim yanıt eğimi ile her iki ayar yapıldı (56,9 ± 0.7 ve 56.5 ± 0.9 mV başına panolarında değişiklik [K+ < / C1 >] 500 MΩ ve 5 GΩ impedances, sırasıyla; giriş için P = 0.759, eşleştirilmiş t-testi, n = 4 elektrotlar).
Ayrıca hızlı çözüm anahtarları [K+] bilinen bir sıçrama için elektrotlar 4.5 ila 10 mM (3D şekil) üzerinden yanıt süresini tahmin etmek için kullanılır. Elektrotlar ile yükselişi ve çürüme kez yanıt verdi (tau) 85 12 ve 85 ± ± 15 ms, anılan sıraya göre. Bu ile ilgili olarak, çözüm Satım Kinetik bizim özel hızlı çözüm şalter için 85 ± 27 Bayan dolayısıyla, yapıldı K+ seçici elektrot ile Kinetik kadar hızlı istihdam çözüm şalter ve K+ dinamiklerini daha hızlı yanıt ekstraselüler ortamın sonucu olarak Schaffer teminat stimülasyon (şekil 5). Bu verileri K+ seçici elektrot Kinetik K+ birikimi ve beyin dokusu içinde izni tahmin etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, gelecekte uygun denetimleri çalışır ve bir harf tarafından ayrı ayrı kalibrasyonlar gerekecektir. Biz çözüm Satım Kinetik, kayıt odasında anlama vakit geçirmek için değerli olduğunu göstermektedir.
Dilimleri ölçümlerde K+ sağlamlığı ve kalitesini etkileyen üç önemli faktör bulduk. İlk hazırlık kalitesini, doku sağlık ve yaş kullanılan hayvanların ilgili olarak görünmektedir. Bu çalışma için ~ 12 haftalık C57/Bl6N fareler kullandık. Nadir durumlarda, ~0.1 mM için tutarında ve 5-10 saniye süren spontan K+ dalgalanmaları ile dilimleri bulduk; Bu dilimler atıldı. İkinci kayıt elektrot kalitesidir. Birincil mesele zaman ve sıcaklık çekti cam kapiller silanization için kullanılır. Biz tavsiye > 170 ° C en az 6 saat (gece kadar kabul edilir) veya 200 ° c 30 dakika. Yetersiz Isıtma elektrot silanization reaktif ile kararlı bir duruma potansiyel K+ ionophore kademeli kaybı nedeniyle korumak değil elektrotlar yol açabilir. Ayrıca, elektrotlar hazırlanırken, ucu çapı 10-20 µm Yani boyutta yaklaşık ortalama bir hücre vücut (şekil 1B) ile ince bir tabaka (1-2 mm) K+ ionophore yerleştirerek öneririz. Aşırı geniş uç bozulmaz veya K+ seçici membran bütünlüğü kaybedersiniz ve elektrot başarısız olur. Bu adımı doğru boyutta ipuçları elde etmek için biraz pratik gerektirir. K+ seçici elektrot ile çok iyi bir ipucu ya da çok kalın bir tabaka sluggish yanıt-e doğru düzgün inşa elektrot karşılaştırıldığında, olabilir. Üçüncü faktör stimülasyon elektrot ve K+ seçici elektrot arasındaki mesafedir. Biz bir elektrot arası mesafe yaklaşık 500 µm kullanmış ancak Optimum mesafe ile bireysel beyin alanı önemli ölçüde değişebilir ve eldeki belirli deneme için dikkatle düşünülmesi gerekir.
Tek varil yapılandırmanın yanı sıra, şu anda K+yapmak için birkaç yöntem vardır-seçici microelectrodes İki kutuplu ve konsantrik biçimleri17. Bu yöntemler yayımlanan açıklamalarını karşılaştırıldığında, tek kanal elektrotlar iki ana dezavantajları var: 1) bipolar ve konsantrik comparted ekstrasellüler boşluk daha fazla bozulmasına neden olabilecek bir biraz daha büyük uç çapı (~ 10 vs 4 µm) elektrotlar ve 2) aynı anda birden fazla iyon türler olduğu gibi iki kutuplu elektrotlar ölçümü ile uyumsuzluğu. Ancak, tek kanal elektrotlar birkaç avantaj sunar. Özellikle, bu elektrotlar az beş dakika içinde sahte olduğu ve bu nedenle daha tek kullanımlık ve yapılan ve hızlı bir şekilde daha önce deneyler kalibre. Bu nedenle, ders deneyler sırasında elektrot kırılma riski az bir endişe. Ayrıca, zemin elektrot ve kayıt elektrot banyo cilt tarafından fiziksel olarak ayrılmış çünkü hiçbir şansı yoktur elektrot başarısızlık konsantrik ve bipolar yol açabilir elektrot ucundaki tuz köprüleri oluşumu için elektrotlar. Tek kanal elektrotlar tepki süresi iki kutuplu elektrotlar ve büyük olasılıkla karşılaştırılabilir konsantrik elektrotlar (~ 20 ms), daha hızlı hızlı perfüzyon sistemimiz yalnızca yanıt süreleri 80 ms (şekil 3E sırasına ölçüsü kabul edilir olsa ). Ayrıca, bu elektrotlar büyük uç direnci ve amplifikatörler kullanımı ile daha yüksek giriş direnci gerektiren iki kutuplu elektrotlar ile karşılaştırıldığında daha düşük gürültü sunuyoruz. Son olarak, bu elektrotlar bir özel micromanipulator veya konsantrik elektrotlar için gerekli olduğu headstage kullanımı gerektirmez. Denge, inşaat avantajları ve rahatlık-in kullanma tek kanal elektrot dezavantajları daha ağır basar.
Burada K+ dynamics dilimleri içinde ölçmek için kullanılan yaklaşım birçok beyin bölgelerinde K+ yönetmelik eğitim için kullanılabilir. Her ne kadar bu iletişim kuralı K+kullanımını gösterir-elektriksel olarak uyarılmış potasyum iyonları dinamikleri ölçümleri için seçici elektrot beyin dokuları, bu protokol genel olarak birçok farklı dokularda için arzu nerede kullanılabilir K+ dynamics ölçmek. Bu gibi durumlarda farmakolojik, karşılık olarak spontan dynamics ve değişiklikleri içerebilir optogenetic, ya da chemogenetic hücresel harekete geçirmek. Bu microelectrodes bu teknik hızlı entegrasyon herhangi bir laboratuvar araç kutusu içine izin vermek için yeterli kalite ve güvenilirliği ile yapılabilir. K+ konsantrasyonları sağlık ve hastalıklı Birleşik detaylı analizler daha fazla algılama ve nasıl çeşitli moleküler ve hücresel bileşenleri için istirahat K+ beyin3konsantrasyonlarda katkıda miktar sağlayacaktır, 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Khakh laboratuvar NIH MH104069 tarafından desteklenmiştir. Mody laboratuvar NIH NS030549 tarafından desteklenmiştir. J.C.O. NIH T32 sinirsel Mikri şemalar eğitim Grant(NS058280) teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
