Neuroscience

صنع واختبار واستخدام البوتاسيوم أيون ميكروليكتروديس انتقائية في شرائح أنسجة الدماغ الكبار

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57511

J. Christopher Octeau¹, Guido Faas², Istvan Mody^1,2, Baljit S. Khakh^1,3

¹Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ²Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ³Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Summary

أيونات البوتاسيوم تساهم يستريح إمكانات غشاء الخلايا والخلية ك⁺ تركيز منظم حاسمة لاستثارة الخلوية. ونحن تصف كيفية جعل ومعايرة واستخدام أحادي القطب ك⁺-ميكروليكتروديس انتقائية. استخدام هذه الأقطاب يتيح قياس ديناميات تركيز ك⁺ مقولة كهربائياً في شرائح هيبوكامبال الكبار.

Abstract

أيونات البوتاسيوم تساهم مساهمة كبيرة في إمكانات غشاء يستريح من الخلايا، وذلك، خارج الخلية ك⁺ تركيز منظم حاسمة لاستثارة الخلية. تغيير تركيزات من خارج الخلية ك⁺ يؤثر على استثارة الغشاء يستريح المحتملة والخلوية بالتحول في التوازنات بين الدول المغلقة والمفتوحة والمعطل لقنوات أيون تعتمد على الجهد التي تكمن وراء إمكانات العمل بدء والتوصيل. ومن ثم فإنها ذات قيمة لقياس ديناميات ك⁺ خارج الخلية في الصحة والدول المريضة مباشرة. هنا، نحن تصف كيفية جعل ومعايرة واستخدام أحادي القطب ك⁺-ميكروليكتروديس انتقائية. قمنا بنشر لهم في شرائح المخ هيبوكامبال الكبار لقياس ديناميات تركيز ك⁺ مقولة كهربائياً. الاستخدام الحكيم لهذه الأقطاب هو جزء مهم من مجموعة الأدوات اللازمة لتقييم الآليات الخلوية والفيزيائية التي تتحكم في تركيزات ك⁺ خارج الخلية في الجهاز العصبي.

Introduction

أحكام تنظم تركيزات أيون البوتاسيوم في الدماغ، وتقلباتها له تأثير قوي على إمكانات غشاء يستريح كافة الخلايا. وفي ضوء هذه الإسهامات الحاسمة، هو هدفا هاما لعلم الأحياء تحديد الآليات الخلوية والفيزيائية الحيوية التي يتم استخدامها لتنظيم محكم تركيز ك⁺ في الفضاء خارج الخلية في الأجهزة المختلفة ل الجسم¹ ^, ²-شرط هام في هذه الدراسات هو القدرة على قياس تركيزات ك⁺ بدقة. على الرغم من أن العديد من العناصر التي تسهم في التوازن البوتاسيوم في الدماغ في الدول السليمة والمريضة قد حددت³^،^،من⁴⁵، تباطأ التقدم كذلك بسبب الطبيعة المتخصصة إعداد أيون ميكروليكتروديس الانتقائي لقياس البوتاسيوم. أجهزة الاستشعار ميكروليكترودي تمثل المعيار الذهبي لقياس ك⁺ التركيزات في المختبر، في شرائح الأنسجة و في فيفو.

أحدث النهج ك⁺ الرصد هي قيد التطوير باستخدام أجهزة الاستشعار البصرية، بيد أن هذه لا يكشف تركيزات البيولوجية ذات الصلة لمجموعة ك⁺ أو قد لا تم تماما وفحص في النظم البيولوجية، على الرغم من أن النتائج الأولية تبدو واعدة⁶^،^،من⁷⁸. مقارنة بأجهزة الاستشعار البصرية، ميكروليكتروديس محدودة أساسا لقياس نقطة مصدر الأيونات، على الرغم من صفائف القطب يمكن تحسين القرار المكانية⁹. تركز هذه المقالة على ماسورة واحدة ميكروليكترودي أجهزة الاستشعار لرصد ديناميات ك⁺ .

في هذا العمل، نحن تقرير مفصل إجراءات التدرجي لجعل ك⁺ ميكروليكتروديس انتقائية، باستخدام ionophore بوتاسيوم المستندة إلى فالينوميسين التي تسمح بانتقائية للغاية (10⁴ إضعاف ك⁺ إلى الانتقائية نا⁺ ) ك⁺ الحركة عبر أغشية¹⁰. ببتيد طبيعيا، فالينوميسين بمثابة مسام نفاذية ك⁺ وييسر تدفق ك⁺ إلى أسفل التدرج اللوني الكهروكيميائية. ونحن أيضا وصف كيفية معايرة الأقطاب، كيفية تخزينها واستخدامها، وأخيراً كيفية نشرها لقياس ديناميات تركيز ك⁺ في شرائح المخ هيبوكامبال الحاد من الفئران الكبار. استخدام أقطاب هذه جنبا إلى جنب مع الفئران المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى قنوات أيون المحددة المقترحة لتنظيم خارج الخلية ك⁺ حيوية ينبغي أن تكشف عن الآليات الخلوية المستخدمة من قبل الجهاز العصبي للتحكم بتركيز ك المحيطة ⁺ في الوسط خارج الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات وأجريت وفقا "المعهد الوطني للدليل الصحي" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ووافقت عليها "لجنة البحوث الحيوانية" المستشار في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس. تم إيواء جميع الفئران مع تتوفر الأغذية والمياه libitum الإعلانية في بيئة ضوء الظلام ح 12. جميع الحيوانات صحية مع لا تغييرات سلوكية واضحة، ولم يشاركوا في الدراسات السابقة، وضحى بها أثناء دورة خفيفة. تم جمع البيانات لإجراء التجارب من الفئران الكبار (6-8 أسابيع من العمر لجميع التجارب).

1-إعداد ميكروليكتروديس انتقائية ك⁺

سيلانيزيشن زجاج البورسليكات
1. إزالة الشعيرات الدموية الزجاج كافية من التعبئة والتغليف، ووضع في أنبوب 50 مل مخروطية. ملء أنبوب مخروطي إلى أعلى مع أقطاب HCl. يغسل م 1 مع الانفعالات لطيف في HCl بين عشية وضحاها، أو على الأقل لمدة 6 ساعات.
2. شطف بإيجاز الشعيرات الدموية مع الإيثانول 70% وثم جاف تماما عند 100-120 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات. تخزين الشعيرات الدموية غسلها في حاويات مع كبريتات الكالسيوم اللامائية ديسيككانت لمدة 4 أسابيع قبل استخدامها مرة أخرى.
3. قبل سيلانيزيشن، سحب الشعيرات الدموية لنصيحة خير استخدام ساحبة ميكروليكترودي. ميكروليكتروديس التي نستخدمها حوالي 2-5 ميكرون في القطر. دائماً معالجة الشعيرات الدموية غسلها بقفازات والزيوت من الجلد يمكن أن تتداخل مع سيلانيزيشن.
4. ضع ميكروليكتروديس في حاوية زجاج حيث أن أقطاب كهربائية مرتفعة من أسفل لمنع الكسر تلميح. إصلاح ميكروليكتروديس للحاوية باستخدام الشريط أوتوكلافابل أو شريط لاصق مماثلة.
5. إزالة ما يقرب من 0.5 مل من محلول سيلانيزيشن 5% ديتشلوروديميثيلسيلاني (دس) من الحاوية الخاصة به باستخدام الأسلوب استبدال النيتروجين (انظر الشكل 2). ملء بالون بغاز النيتروجين وإرفاقه حقنه أو الأنبوب والإبرة البالون. أدخل الإبرة في الحاوية دس حين وضع دس في محقن منفصل عن طريق إبرة أطول.
6. تطبيق الحل سيلانيزيشن دروبويسي إلى نصائح الماصات وتغطي فورا. مكان الحاوية عقد ميكروليكتروديس مع الحل سيلانيزيشن في فرن مختبر المعالجون مسبقاً (170-180 درجة مئوية) لمدة 10-12 ساعة أو 200-220 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة
7. وبعد التفريخ، إيقاف تشغيل الفرن ثم قم بإزالة اللوحة من الفرن. كن حذراً عند إزالة اللوحة من الحاضنة، كما أنها ساخنة للغاية. وضع اللوحة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة للسماح للأواني الزجاجية لتبريد.
8. إزالة ميكروليكتروديس من اللوحة (باستخدام شفرة حلاقة أو شفرة المبضع بقص الشريط) ووضعها في وعاء محكم معبأ المجففة. يمكن استخدام ميكروليكتروديس سيلانيزيد التي تبقى خالية من الرطوبة لتصل إلى 1 الأسبوع التالي سيلانيزيشن.
فتيلة أقطاب كهربائية
1. إعداد حل أسهم من ك⁺ionophore كوكتيل: 5% w/v فالينوميسين، 93% v/v 1، 2-ثنائي ميثيل-3-النيترو بنزين، والبوتاسيوم 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) بورات¹¹. هذا الحل لون أصفر باهت. تبقى في وعاء محكم الإغلاق، ومبهمة في درجة حرارة الغرفة. إذا المخزنة بشكل صحيح هذا الحل يمكن أن تستمر عدة أشهر.
2. إعداد حل أسهم من 10 ملم حبيس مخزنة 300 مم كلوريد الصوديوم عند الأس الهيدروجيني 7.4. إصلاح مسرى إلى المشبك والردم مع كلوريد الصوديوم مخزنة بشكل مؤقت باستخدام تلميح ميكروفيل ز 28 متصلاً بحقنه. ويلاحظ أن المحلول الملحي قد وصلت إلى نهاية الحافة ميكروليكترودي. التأكد من أن ميكروليكترودي خالية من الفقاعات الكبيرة التي يمكن أن تتداخل مع تدفق التيار.
3. كسر غيض مسرى إلى حوالي 10-20 ميكرومتر على نطاق واسع، استخدام الجانب حادة مشرط أو شفرة حلاقة.
4. استخدام ميكروبيبيتي، تطبيق المعالجة تجميعية صغيرة (~0.1 ميليلتر) من إيونوفوري ك⁺ قرب غيض من ميكروليكترودي. إذا تم بشكل صحيح سيلانيزيد سيتم استيعاب الحبرية في تلميح كسر مسرى. تعبئة مسرى إلى 1-2 ملم مع إيونوفوري ك⁺ ، وإزالة الزائدة باستخدام المناديل الورقية.

2-معايرة ميكروليكتروديس انتقائية ك⁺

تحضير محاليل المعايرة
1. إعداد حلول لتركيزات مختلفة من بوكل في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية الاسموليه متساوية (قام) بالاستعاضة عن كلوريد الصوديوم مع بوكل. كنا 0، 1، 1، 4، 5، 10 و 100 ملم ك⁺ قام، للمعايرة من أقطاب كهربائية. وترد في الجدول 1وصفات لهذه الحلول المعايرة.

المادة الكيميائية	ميغاواط	مم النهائي	مم 0.1 [K +]	1 ملم [K +]	4.5 مم [K +]	10 ملم [K +]	100 ملم [K +]
المادة الكيميائية	(g/mol)	مم النهائي	مم 0.1 [K +]	1 ملم [K +]	4.5 مم [K +]	10 ملم [K +]	100 ملم [K +]
كلوريد الصوديوم	58.44	ويختلف	ز 1.51	ز 1.50	ز 1.44	ز 1.4	ز 0.345
بوكل	الأسهم م 1	ويختلف	20 ميليلتر	200 ميليلتر	ميليلتر 900	2 مل	20 مل
كاكل₂	الأسهم م 1	2	400 ميليلتر
مجكل₂	الأسهم م 1	1	200 ميليلتر
نة₂بو₄	119.98	1.2	ز 0.29
NaHCO₃	84.01	26	ز 0.437
د-الجلوكوز	180.16	10	ز 0.360
المياه	q.s. 200 مل

الجدول 1. حلول معايرة البوتاسيوم

ميكروليكترودي المعايرة
1. فقاعة كل الحلول مع 95% O₂5% CO₂ لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل البدء بالتجربة. تبدأ بيرفوسينج الحمام مع 4.5 ملم [ك⁺] قام بمعدل 3 مل في الدقيقة الواحدة. ضع مسرى انتقائية ك⁺ إلى حامل القطب يعلق على هيدستاجي القطب على المناور. هذا هيدستاجي متصل بمكبر للصوت مناسب. إدراج تلميح مسرى بيرفوساتي حمام.
2. ضمان مسرى الأرض Ag/AgCl هو حمم في نفس الحل، وأن التدفق مطرد. تطبيق حلول المعايرة بطريقة تدريجية وتسجيل التغييرات المحتملة في المتوسط عبر الحافة قطب كهربائي. الانتظار لامكانيتها في تلميح قطب كهربائي للتوصل إلى قيمة ثابتة قبل التحول إلى الحل التالي
3. قياس تغير الجهد ثابت الدولة استجابة لتطبيق حلول المعايرة على طرف القطب. التأكد من أن الميل للاستجابة القطب 52 على الأقل ولا يزيد عن 58 أم كل تغيير سجل في [ك⁺].

3-إعداد شرائح المخ هيبوكامبال الحادة

إعداد الحلول شريحة
1. إعداد 500 مل السكروز قطع الحل تتألف من: السكروز 194 مم، 30 مم كلوريد الصوديوم، 4.5 مم بوكل، 10 ملم د-الجلوكوز، 1 مم مجكل₂، 1.2 مم نة₂ص₄، و ناكو 26 مم₃، موسم 290-300، مشبعة مع 95% O₂ و 5% CO₂.
2. إعداد 1-2 لترات من تسجيل الحل (قام) تتألف من: 124 كلوريد الصوديوم، 4.5 مم بوكل، 1 مم مجكل₂، 10 ملم د-الجلوكوز، 2 مم كاكل₂، 1.2 مم نة₂بو₄، و 26 ملم ناكو₃؛ الرقم الهيدروجيني 7.3-7.4 (بعد السطح)، موسم 290-300، مشبعة مع 95% O₂ و 5% CO₂. ملء كوب يحتوي على غرفة حامل شريحة الدماغ مع تسجيل الحل وإبقائه في 32-34 درجة مئوية. ملء قاعة فيبرتوم مع طين الماء المثلج.
إعداد شريحة الحادة
1. تخدير عميق ماوس بوضعه في جرة بيل بريتشارجيد مع إيسوفلوراني 2-3 مل. تحقق منعكس قرصه أخمص القدمين، وإذا كان غير المستجيبة، قطع رأس سريعاً باستخدام زوج من مقص حاد أو المقصلة كما يتطلب البروتوكول الخاص بك الحيوانات.
2. جعل شق 2-3 سم باستخدام المقص من الجزء والذيلية من الجمجمة إلى قطع فروة الرأس على طول خط الوسط. بينما يدوياً تراجعه فروة الرأس، جعل اثنين 1 سم شقوق أفقية من ماغنوم ثقبة على طول جانبي الجمجمة. ثم، باستخدام مقص غرامة، قطع شق طول الجمجمة، على طول خط الوسط من الجزء الخلفي الجمجمة إلى الآنف.
3. استخدام الملقط غرامة إدراجها قرب خط الوسط، تتراجع الجمجمة قطعي في جزأين. استخراج المخ الماوس من الجمجمة واستخدام شفرة لإزالة المخيخ والمصابيح شمي، التي تقع على التوالي في أجزاء الدماغ والذيلية وروسترال. يمكن تحديد هذه التشققات الكبيرة، التي فصلها عن القشرة.
4. جبل كتلة الدماغ على الدرج فيبرتوم استخدام سوبر الغراء. ملء علبة فيبرتوم مع الحل قطع الجليد الباردة.
5. قص مقاطع الأنسجة على متن الطائرة الاكليلية في 300 ميكرون سمك. وعادة ما يمكن جمعها 6 شرائح هيبوكامبال الاكليلية.
6. بعد أن يتم قطع كل قسم، نقل على الفور الشرائح إلى الشريحة عقد الكأس استعد 32-34 درجة مئوية. إبقاء الأبواب في درجة الحرارة هذه لمدة 20 دقيقة قبل إزالة الكأس التي تحتوي المقاطع ومكان هذا في درجة حرارة الغرفة قبل تسجيل 20-30 دقيقة على الأقل.

4-قياس ديناميات كهربائياً مقولة ك⁺

إعداد إعداد شريحة
1. بلطف ضع شريحة الدماغ في الحمام باستخدام ماصة باستور ولطف أنه عقد في مكان مع قيثارة البلاتين مع سلاسل النايلون.
2. ضمان النصائح من ثنائي القطب الكهربائي محفزة موازية لبعضها البعض وهي المستوى مع طائرة الشريحة. ببطء، على مدى 6-7 ثوان، إدراج الأقطاب CA3 الطبقة رادياتوم حوالي 40-50 ميكرون العميق لحفز شافر ضمانات إضافية. في المقاطع الاكليلية، CA3 يمكن تقريبا التعرف كجزء جانبية الحصين السليم إلى طبقة الخلايا الحبيبية في جينو هيبوكامبال، مع رادياتوم الطبقة الوقوع الآنسي والبطني إلى طبقة الخلايا الهرمية.
3. إدراج بعناية ك⁺-القطب الانتقائي في CA1 الطبقة رادياتوم ما يقرب من 50 ميكرومتر العميقة، عن طريق خفض الكهربائي ببطء على مدى ما يقرب من 3-4 ثوان. تتيح إمكانات لتحقيق الاستقرار عبر مسرى قبل تطبيق التحفيز على الشريحة: وهذا عادة ما يستغرق 5 إلى 10 دقائق. إذا كانت الشريحة معارض عفوية تجاهل التغييرات في الخلية ك⁺ ثم وكرر هذه العملية مع شريحة جديدة.
التدبير آثار إطلاق سراح ك⁺
1. تطبقه يدوياً كئيبة على الزناد على مشجعا أثناء رقمياً تسجيل استجابات القطارات للتحفيز الكهربائي (8 البقول). تطبيق التحفيز في 10 هرتز و 1 عرض النبض مرض التصلب العصبي المتعدد، بدءاً من 10 السعة التحفيز µA.
2. تطبيق زيادة تحفيز ستريك بعامل 2 حتى يتم اكتشاف حالة من سعة استجابة ك⁺ الحد أقصى. إذا كنت لا ترى أي استجابة، نقل موضع مسرى ك⁺ أقرب إلى موقع التحفيز في 100 ميكرومتر في زيادات
3. تحديد السعة التحفيز التي تنتج نصف الاستجابة القصوى. في تجربتنا، هذا بين 40-160 µA، اعتماداً على نوعية إعداد وسن الحيوان، والمسافة بين أقطاب التحفيز والقطب الانتقائي ك⁺ .
4. في نفس الشريحة، استخدام سعة حافز في خطوة واحدة أقل من السعة التي تنتج نصف الاستجابة القصوى (مثلاً إذا كان ينتج 80 µA رد النصف الأعلى، استخدم 40 µA) تطبيق القطارات حافزا لزيادة عدد النبضات. في البداية، وقد استخدمنا القطارات من البقول 1، 2، 4، 8، 16، 32، 64 و 128.
5. للتأكد من أن يتم بإطلاق إمكانات عمل حمام الضمانات شافر حفزت كهربائياً وساطة إشارات ك⁺ ، تطبيق 0.5 ميكرومتر ت في قام لمدة 10 دقائق وكرر البروتوكول التحفيز. ينبغي أن تراعي أية استجابات مقولة.
6. بعد الانتهاء من هذه التجربة شريحة، تأكيد مسرى حافظت على ريسبونسيفيتي بإعادة معايرة مسرى في حلول المعايرة وضمان الاستجابة قد انحرفت ليس بأكثر من 10% من المعايرة الأولية

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للقياس الانتقائي لخارج الخلية ك⁺، نحن على استعداد ميكروليكتروديس الأيوني الانتقائي مغطاة بطبقة مسعور من خلال سيلانيزيشن لتنظيف البورسليكات الزجاج الماصات (الشكل 1A). ويتيح هذا الطلاء إيونوفوري ك⁺ التي تحتوي على فالينوميسين للراحة في غيض مسرى والسماح فقط ك⁺ في الجريان داخل فتحه ضيقة على طرف القطب (الشكل 1B). بعد فتيلة الأقطاب مع المحلول الملحي تردم وإيونوفوري ك⁺ ، يمكن أن يكون اختبار أقطاب كهربائية لاستجابتها السريعة والخطي للتغييرات التدرجي في حمام ك⁺ تركيزات (الشكل 3A) وعلى استجابتها حمام ك⁺ يتغير عبر النطاق المعايرة (الشكل 3B) في المحلول الملحي أو قام بطريقة توقع من المعادلة [نرنست]². يمكن رسم التغيير في حالة ثابتة المحتملة ضد حمام تركيز ك⁺ من أجل تحديد منحدر الخط، والتي ينبغي أن يكون حوالي 58.2 mV كل سجل [ك⁺]، وفقا للمعادلة [نرنست]، ولا يقل عن 52 mV الواحدة تسجيل [ك⁺] (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك نحن اختبار مدى استجابة أقطاب انتقائية ك⁺ ، ووجدت أنها استجابت لتغيير 5.5 ملم في ك⁺ مع الثوابت وقت صعود واضمحلال لحوالي 85 ms (الشكل 3D،هاء).

تلاعب تسجيل الكهربية يتكون من المجهر تستقيم قياسية متصلة على شاشة LCD لتحديد موضع حفز وتسجيل كهربائي. هناك حاجة إلى لا البصريات الخاص لوضع visual ك⁺ واقطاب التحفيز؛ نستخدم 5 x أو 10 x الهدف العدسة والضوء الأبيض من لمبة هالوجين، ولكن الصمام أبيض يمكن أن تستخدم بدلاً من ذلك. مسرى حفز متصلاً بإخراج المعزل الحافز، الذي يسلم ديبولاريزينج الحالية عن طريق توقيت تسليم البقول من مشجعا أو جهاز توقيت مثل هذه. وبعبارة أخرى، يسلم مشجعا القطارات 2 V، 10-20 هرتز نبضات التوقيت إلى المعزل التحفيز. عند استلام هذه البقول، يسلم المعزل التحفيز ثم الحالي المطلوب لأقطاب التحفيز. التسجيل الكهربائي متصلاً بصاحب قطب، متصلاً هيدستاجي ومكبر للصوت والمجلس A/D، الذي واجهة لجهاز كمبيوتر مع برنامج تسجيل الكهربية (الشكل 4 أ). بعد معايرة الكهربائي قد تم بنجاح وتم إعداد الشرائح الحادة، يمكن أن توضع الشريحة في بيرفوساتي قام. لحفز الضمانات شافر، ك⁺-يوضع القطب الانتقائي داخل رادياتوم الطبقة CA1 ومسرى تنشيط الحقل تندرج في CA3 (الشكل 4 باء).

متى تم وضع أقطاب كهربائية وتسجيل ك⁺ وصلت إلى خط أساس مستقر، ثم يمكن تطبيق البقول لزيادة السعة الحالية للشريحة (الشكل 5، أعلى). يظهر الموجي لهذا النشاط كزيادة سريعة في ك⁺ بمعدل تحلل أسي، الذي يلغي مع تطبيق تتكس (الشكل 5، أسفل).

الشكل 1 : الرسم التخطيطي لرد فعل سيلانيزيشن والهندسة المعمارية انتقائية ميكرويليكترودي ك⁺ . ألف التمثيل التخطيطي لرد فعل سيلانيزيشن الذي يحدث بين مجموعات الهيدروكسيل القطبية المكشوفة من زجاج البورسليكات وديتشلوروديميثيلسيلاني كاشف سيلانيزيشن (DDS). رد الفعل هذا يجعل سطح الزجاج مسعور، مما يسمح إيونوفوري ك⁺ لتكوين غشاء رقيق. رسم تخطيطي باء من ميكروليكترودي انتقائية ك⁺ . مسرى تردم مع المحلول الملحي والحل انتقائية ك⁺ مكان في طبقة سميكة من 1-2 مم في التلميح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : الرسم التخطيطي لاستخراج دس. التمثيل التخطيطي إجراء استبدال النيتروجين لاستخراج دس من حاوية. دس المتفجرة والقابلة للاشتعال ويمكن الرد بعنف مع غازات الغلاف الجوي عندما يكون في تركيزات عالية ولذلك من الضروري أن تحل محل دس إزالتها مع غاز النيتروجين خامل. بالون مليئة بالنيتروجين متصل بإبرة عن طريق الحقن أو الأنابيب المناسبة. يتم إدراج هذه الإبرة من خلال التسرب في الحاوية يسمح تدفق الغاز (N₂) النيتروجين في الوعاء. بشكل منفصل، متصل بحقنه 1 مل إبرة طويلة (3-10 سم) وإدراجها في الحاوية. ثم يتم استخدام هذه المحاقن لاستخراج دس، بينما يمكن إدخال غاز النيتروجين فقط الحاوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : معايرة ميكروليكتروديس. ألف حمام نضح التطبيق من تركيزات مختلفة ك⁺ في المحلول الملحي يمكن عكسية وسرعة إنتاج التغييرات نيرنستيان في الإمكانات عبر الحافة القطب. ب التطبيق التدريجي من ك⁺ في قام يستحضر تغيير المميزة ومستقرة في إمكانات نصيحة القطب. ارسم جيم للتغيير أم ك⁺ القطب الانتقائي في استجابة لتزايد تركيزات ك⁺ في أربعة أقطاب؛ R² هو 0.9995 لهذه الأقطاب الأربعة. د يؤدي التطبيق في حمام نظام التروية سريع 10 مم ك⁺ استجابة خطوة في الجهد عبر الحافة القطب الانتقائي ك⁺ . هاء الأرض استجابة قياس الأوقات (تاو في مرض التصلب العصبي المتعدد)؛ تم الكشف عن لا الفرق بين وقت صعود واضمحلال (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، ف = 0.939، هما نموذج تي-اختبار). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : جهاز لقياس ك⁺ خارج الخلية. ألف تلاعب الكهربية يتكون من المجهر ثابتة إلى جدول المضادة اهتزاز مع الكاميرا المرفقة وشاشة LCD للتصور شريحة. يتم إصلاح مسرى ك⁺ إلى هيدستاجي، ومكبر للصوت والتناظرية إلى الرقمية المجلس التي النواتج إشارة إلى جهاز كمبيوتر مرفقة مع برنامج تسجيل الكهربية. أقطاب التحفيز الكهربائي متصلاً المعزل تحفيز التي تختلف السعة التحفيز ومشجعا لتوقيت تقديم الحوافز. ب الرسم التخطيطي وإعداد شريحة ومكان وضع أقطاب مختلف في الشريحة. يمكن تحديد CA3 تقريبا كجزء جانبية الحصين السليم إلى طبقة الخلايا الحبيبية في جينو هيبوكامبال، مع رادياتوم الطبقة روسترال التي تقع على طبقة الخلايا الهرمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : القياس كهربائياً مقولة ك⁺ الإصدار. آثار الممثل ك⁺ الإفراج عن مسرى التسجيل تحت ظروف القاعدية (أعلى) وخسارتهم عند تطبيق تيدرودوتاكسين (0.25 ميكرومتر) لمدة 5 دقائق قبل تسجيل (أسفل). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأسلوب الذي يصف لنا هنا قد سمح لنا تقييم ديناميات ك⁺ استجابة للتحفيز الكهربائي للضمانات شافر في شرائح هيبوكامبال الحاد من الفئران الكبار. لدينا طريقة لإعداد ك⁺ميكروليكتروديس أيون انتقائية مماثلة للإجراءات الموصوفة في وقت سابق¹²^،¹³^،^،من¹⁴¹⁵. ومع ذلك، هذا الأسلوب مزايا أكثر من تكوينات بديلة القطب حيث أنها سريعة وغير معقدة لإعداد ميكروليكتروديس ك⁺ انتقائية. بعد معايرة المناسبة، تم العثور على هذه الأقطاب الكهربائية لقياس قوة حيوية ك⁺ في الشرائح أثناء التحفيز الكهربائي، وقد سدت هذه الردود ت. واستخدمت في هذه التجارب، والتحفيز من 80-160 تعميم الوصول إلى الخدمات في 10 هرتز؛ ومع ذلك، سيلزم الأمثل لشروط التحفيز لتجربة معينة ومنطقة الدماغ من الفائدة. يتم سرد هذه القيم كدليل.

ينبغي أن يكون منحدر رد الأقطاب 58.2 mV كل سجل [ك⁺]. هذه قيمة هي توقع من المعادلات] [نرنست] ونيكولسكي ايزنمان لغشاء شبه منفذ انتقائية ك⁺ ؛ حسابات هذا الأخير أفضل للتفاعلات بين أيونات¹⁶. إذا لم يستجب الكهربائي بالطريقة المتوقعة، وهذا يمكن أن يكون لأحد سببين أساسيين. أولاً سيلانيزيشن يمكن أن تكون غير كافية، مما تسبب في الغشاء أن الجسور المفقودة أو الملح بشكل. التأكد من أن الغشاء سليمة بالمراقبة عن طريق المجهر، ينبغي أن يكون هناك واجهة واضحة بين الحل ماصة والغشاء. يمكن أن يكون هناك سبب آخر، وجود فقاعات في ماصة التي تعوق تدفق الحالية من سلك كلوريد الفضة. إذا هي لاحظت فقاعات، ثم إزالة ماصة ونفض الغبار بشدة لإزالتها. إذا فشلت هذه الحلول، تجعل إعادة آخر ك⁺ القطب الانتقائي أو تكرار سيلانيزيشن لفترة أطول، أو عند درجات حرارة أعلى. ومع ذلك، من المهم تكرار هذه الضوابط الرئيسية في كل مرة هو درس منطقة الدماغ جديدة أو يتم اختبارها ميكروليكترودي جديدة.

واستخدمت اثنين من مكبرات الصوت الخاصة في هذه التجارب، ولكن يمكن استخدام مكبرات الصوت الأخرى ما دام مقاومة الإدخال أكبر من أو يساوي 500 MΩ. وبعد معايرة الأقطاب مع 500 MΩ و 5 GΩ الإدخال ممانعات، وجدنا لم يكن هناك فرق في منحدر استجابة الجهد مع أما الإعداد أكثر تركيزات تتراوح من ك⁺ (56.9 mV ± 0.9 ± 0.7 و 56.5 كل تغيير عشرة إضعاف في [ك^{+ ] لإدخال 500 MΩ و 5 GΩ ممانعات، على التوالي؛ P = 0.759، إقران تي-اختبار، n = 4 أقطاب).}

كنا أيضا مفاتيح الحل السريع لتقدير الوقت استجابة لأقطاب كهربائية إلى قفزة معروفة في [ك⁺] من 4.5 إلى 10 ملم (الشكل 3D). ورد الأقطاب مع أوقات صعود واضمحلال (تاو) ± ± 12 و 85 85 15 مللي ثانية، على التوالي. فيما يتعلق بهذا، حركية تبادل الحل للجلاد حل سريع مخصص لنا كانت السيدة ± 27 85 ومن ثم أقطاب انتقائية ك⁺ الاستجابة مع حركية أسرع وقت الجلاد الحل نحن العاملين وأسرع بكثير من ديناميات ك⁺ في الوسط خارج الخلية نتيجة تنشيط شافر الجانبية (الشكل 5). تشير هذه البيانات إلى أن أقطاب انتقائية ك⁺ يمكن استخدامها لتقدير حركية تراكم ك⁺ والتخليص في أنسجة المخ. ومع ذلك، في المستقبل العمل ضوابط ملائمة وسيلزم معايرات على أساس حالة بحالة. ونقترح أن قيماً لقضاء بعض الوقت في فهم حركية تبادل الحل في دائرة التسجيل الخاص بك.

وجدنا ثلاثة عوامل حاسمة الأهمية التي تؤثر على جودة ومتانة من القياسات ك⁺ في الشرائح. الأول هو نوعية الإعداد، ذات الصلة، فيما يبدو، في كل من الأنسجة الصحية والسن من الحيوانات المستخدمة. لهذه الدراسة، وقد استخدمنا فئران C57/Bl6N التي أسابيع ~ 12 من العمر. وفي مناسبات نادرة، وجدنا شرائح مع تقلبات ك⁺ عفوية تصل إلى مم ~0.1 ودائم 5-10 ثواني؛ تم تجاهل هذه الشرائح. والثاني هو نوعية ميكرويليكترودي التسجيل. المسألة الرئيسية هي الوقت ودرجة الحرارة المستخدمة سيلانيزيشن الزجاج سحبت الشعرية. ونحن نوصي > 170 درجة مئوية لمدة 6 ساعات على الأقل (حتى بين عشية وضحاها هو مقبول) أو عند 200 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يمكن أن يؤدي نقص التدفئة من الأقطاب مع الكاشف سيلانيزيشن إلى أقطاب عدم المحافظة على مستوى ثابت المحتملة بسبب الفقدان التدريجي إيونوفوري ك⁺ . بالإضافة إلى ذلك، عند إعداد الأقطاب، نوصي بوضع طبقة رقيقة من إيونوفوري ك⁺ (1-2 مم) في تلميح التي يبلغ قطرها 10-20 ميكرون أي على ما يقارب حجم هيئة خلية متوسط (الشكل 1B). لا تكسر نصيحة واسعة بشكل مفرط أو الغشاء الانتقائي ك⁺ سوف تفقد سلامتها ومسرى ستفشل. قد تتطلب هذه الخطوة بعض الممارسات لتحقيق نصائح الحجم الصحيح. يمكن أن يكون ك⁺ أقطاب انتقائية مع تلميح جيد جداً أو سميكة جداً من طبقة الردود بطيئا، مقارنة بأقطاب مكونة بشكل صحيح. والعامل الثالث هو المسافة بين قطب التحفيز ومسرى انتقائية ك⁺ . نحن استخدمت على مسافة بين القطب كهربائي لحوالي 500 ميكرومتر، لكن المسافة الأمثل يمكن أن تختلف إلى حد كبير مع منطقة الدماغ الفردية وسوف تحتاج إلى النظر بعناية لتجربة خاصة في متناول اليد.

بالإضافة إلى التكوين برميل واحد، وهناك حاليا العديد من الطرق لجعل ك⁺--تنسيقات ميكرويليكتروديس انتقائية في القطبين ومتحدة المركز¹⁷. مقارنة الأوصاف المنشورة من هذه الأساليب، واقطاب قناة واحدة قد العيوب الرئيسية اثنين: 1) قطرها نصيحة أكبر قليلاً (~ 10 مقابل 4 ميكرومتر)، التي يمكن أن تتسبب في اختلال أكبر من مساحة خارج الخلية كومبارتيد للقطبين ومتحدة المركز كهربائي، و 2) التعارض مع قياس متزامنة متعددة الأنواع أيون كما هو الحال في أقطاب القطبين. ومع ذلك، أقطاب قناة واحدة تقدم العديد من المزايا. على وجه التحديد، يمكن أن تكون ملفقة في أقل من خمس دقائق هذه الأقطاب وهي بالتالي المتاح أكثر ويمكن إجراؤها، ومعايرة بسرعة قبل التجارب. ولذلك، خطر الكسر قطب كهربائي أثناء تجارب بالطبع أقل من القلق. بالإضافة إلى ذلك، نظراً لأن القطب الأرضي، والقطب تسجيل مفصولة ماديا بحجم الحمام، ليس هناك فرصة لتشكيل جسور الملح على طرف القطب، الذي يمكن أن يؤدي إلى فشل القطب في متحدة المركز وثنائي القطب أقطاب كهربائية. زمن الاستجابة لأقطاب قناة واحدة أسرع من أقطاب القطبين واقطاب يماثل متحدة المركز المحتمل (~ 20 مللي ثانية)، على الرغم من أن يسمح نظامنا نضح سريعة فقط مقياسا لأوقات الاستجابة بناء على أمر من 80 مرض التصلب العصبي المتعدد (3E الشكل ). وعلاوة على ذلك، توفر هذه الأقطاب الضوضاء أقل مقارنة بأقطاب ثنائي القطب، الذي يكون أكبر نصيحة المقاومة وتتطلب استخدام مكبرات الصوت مع المقاومة الإدخال أعلى. وأخيراً، هذه الأقطاب لا تتطلب استخدام ميكرومانيبولاتور المتخصصة أو هيدستاجي كما هو مطلوب لأقطاب متحدة المركز. في التوازن، مزايا البناء وسهولة استخدام أقطاب قناة واحدة تفوق المساوئ.

يمكن استخدام النهج التي استخدمت هنا لقياس ديناميات ك⁺ في شرائح في العديد من مناطق الدماغ لدراسة تنظيم ك⁺ . على الرغم من أن هذا البروتوكول يوضح استخدام ك⁺-أقطاب انتقائية للقياسات لديناميات أيونات البوتاسيوم مقولة كهربائياً في الدماغ الأنسجة، وهذا البروتوكول على نطاق واسع استخدامها في العديد من الأنسجة المختلفة حيث أنه من المستصوب قياس ديناميات ك⁺ . هذه الحالات قد تشمل ديناميات عفوية والتغييرات استجابة الدوائية، أوبتوجينيتيك، أو تشيموجينيتيك الخلوية التنشيط. ويمكن إجراء هذه ميكروليكتروديس مع نوعية وموثوقية كافية تسمح بالاندماج السريع لهذه التقنية في أي مربع الأدوات المختبرية. تحليلات مفصلة لتركيزات ك⁺ في الصحة والدول المريضة سيمكن مواصلة الكشف والتحديد الكمي للمكونات الجزيئية والخلوية المختلفة كيف تسهم يستريح ك⁺ التركيزات في الدماغ³^، ¹⁸^،¹⁹.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد المختبر كاخ MH104069 المعاهد الوطنية للصحة. مختبر مودي أيده NS030549 المعاهد الوطنية للصحة. بفضل J.C.O. Grant(NS058280) التدريب رقائق العصبية في المعاهد الوطنية للصحة T32.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW