Summary
יוני אשלגן לתרום פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, ריכוז K+ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של הסלולר דעתנית. אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K+-microelectrodes סלקטיבית. באמצעות אלקטרודות כזה מאפשר מדידת דינמיקה ריכוז K+ חשמלית עורר בפרוסות בהיפוקמפוס למבוגרים.
Abstract
יוני אשלגן לתרום באופן משמעותי פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, לכן, ריכוז K+ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של התא דעתנית. שינו את ריכוזי משפיע על K+ חוץ-תאית את מנוחתו ממברנה פוטנציאליים וסלולריות דעתנית על ידי הסטה של שיוויי משקל בין מדינות סגור פתוח, מוחלש תעלות יונים תלוית מתח העומדים בבסיס פוטנציאל הפעולה חניכה, הולכה. . מכאן, זה חשוב למדוד ישירות את הדינמיקה K+ חוץ-תאית של הברית חולות ובריאות. כאן, אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K+-microelectrodes סלקטיבית. אנחנו לפרוס אותם לפרוסות מוח בהיפוקמפוס למבוגרים כדי למדוד דינמיקה עורר חשמלית של ריכוז K+ . שימוש מושכל אלקטרודות כאלה היא חלק חשוב של ערכת הכלי הדרושים להעריך המנגנונים הסלולר ואת biophysical לשלוט ריכוזים K+ חוץ-תאית במערכת העצבים.
Introduction
ריכוז יון אשלגן מוסדרים בחוזקה במוח, תנודות שלהם השפעה חזקה על פוטנציאל ממברנה מנוחתו של כל התאים. לאור בתרומותיה קריטי, מטרה חשובה של ביולוגיה היא לקבוע את המנגנונים הסלולר ואת biophysical המשמשים בחוזקה לווסת את הריכוז של K+ בחלל חוץ-תאית באיברים שונים של גוף1 , 2. דרישה חשובה במחקרים אלה הוא היכולת למדוד ריכוזים K+ במדויק. למרות רכיבים רבים אשר תורמים אשלגן הומאוסטזיס במוח במצבים בריאים וחולים היה להיות מזוהה3,4,5, עוד התקדמות האיטה בשל אופי מיוחדות הכנת יון סלקטיבי microelectrodes למדידה אשלגן. חיישנים microelectrode מייצגים את תקן זהב למדידת K+ ריכוזים במבחנה, פרוסות רקמות ו vivo בתוך.
גישות חדשות יותר עבור K+ ניטור נמצאים בפיתוח באמצעות חיישנים אופטיים, אולם אלה לא זיהית ריכוזים של טווח רלוונטי מבחינה ביולוגית של K+ או לא נבדקו במערכות ביולוגיות, למרות תוצאות ראשוניות מופיעים6,מבטיח7,8. בהשוואה לחיישנים אופטיים, microelectrodes מוגבלות באופן מהותי מדידה נקודת המקור של יונים, למרות אלקטרודה מערכים יכול לשפר את הרזולוציה המרחבית9. מאמר זה מתמקד החיישנים microelectrode חד-קני לניטור K+ dynamics.
בעבודה זו, אנחנו מדווחים הליכים מפורטים stepwise כדי להפוך K+ microelectrodes סלקטיבית, באמצעות ionophore של אשלגן מבוססי valinomycin המתיר סלקטיבי מאוד (104 קיפול K+ ל נה+ סלקטיביות) K+ תנועת הקרומים10. מפוליפפטיד המתרחשים באופן טבעי, valinomycin פועל כמו נקבובית חדיר K+ ואסטמה ומקילה על הזרימה של K+ למטה. זה הדרגתי אלקטרוכימי. אנחנו גם מתארים כיצד לכייל את האלקטרודות, כיצד לאחסן ולהשתמש בהם, ולבסוף כיצד לפרוס אותם כדי למדוד דינמיקה ריכוז K+ מוח בהיפוקמפוס חריפה פרוסות של עכברים בוגרים. שימוש כזה אלקטרודות יחד עם עכברים מהונדסים שאין תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים מוצע להסדיר את הדינמיקה K+ חוץ-תאית לחשוף את המנגנונים התאיים המשמשים את מערכת העצבים כדי לשלוט של החוק, K + ב חצרו חוץ-תאית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים נערכו על פי המכון הלאומי של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי ועדת המחקר של בעל חיים של הקנצלר ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס. כל העכברים שוכנו עם מים ואוכל זמינים ad libitum בסביבה בהירה-כהה 12 שעות. כל בעלי החיים היו בריאים ללא שינויים התנהגותיים ברור, לא היו מעורבים במחקרים קודמים, הוקרבו במהלך מחזור אור. נאספו נתונים לניסויים של עכברים בוגרים (בן לניסויים כל 6-8 שבועות).
1. הכנת microelectrodes סלקטיבית K+
- Silanization של זכוכית בורוסיליקט
- הסרת נימים זכוכית מספקת האריזה ומניחים לתוך צינור חרוטי 50 מ. למלא צינור חרוטי העליון 1 מ' אלקטרודות HCl. לשטוף עם עצבנות עדין ב- HCl בן לילה או לקבוצות של 6 שעות.
- בקצרה לשטוף נימים עם 70% אתנול, ואז יבש לחלוטין ב 100-120 מעלות צלזיוס במשך 6-8 שעות. לאחסן נימים שטף מכולות עם נטול מים סידן גופרתי סופג לחות עד 4 שבועות לפני להמשך השימוש.
- לפני silanization, הצמד נימים טיפ בסדר באמצעות של פולר microelectrode. Microelectrodes בהם אנו משתמשים הם כ- 2-5 מיקרון קוטר. תמיד להתמודד עם שטף נימים עם כפפות, כמו שמנים של העור יכולים להפריע silanization.
- המקום microelectrodes לתוך מיכל זכוכית כך האלקטרודות גבוהות מהתחתית כדי למנוע שבירה עצה. לתקן את microelectrodes אל המיכל באמצעות קלטת autoclavable או סרט דביק דומה.
- הסר כ- 0.5 מ"ל של פתרון silanization 5% dichlorodimethylsilane (DDS) המכיל שלו באמצעות שיטת החלפת חנקן (ראה איור 2). למלא בלון גז חנקן, לצרף הבלון מזרק או שפופרת ואת המחט. הכנס את המחט לתוך המיכל DDS תוך כדי ציור למעלה DDS לתוך מזרק נפרד באמצעות מחט ארוך יותר.
- החלת הפתרון silanization dropwise עד קצות מדי סוכר ומכסים מיד. הכנס את המיכל אל מחזיק את microelectrodes עם silanization פתרון לתוך תנור מראש ומחוממת מעבדה (170-180 מעלות צלזיוס) למשך 10-12 שעות או ב- 200-220 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות
- לאחר הדגירה, לכבות את התנור, לאחר מכן הסר את הלוחית של התנור. היה זהיר בעת הסרת את הצלחת החממה, שזה מאוד חם. מניחים את הצלחת על ספסל בטמפרטורת החדר במשך 10-15 דקות לאפשר את כלי הזכוכית להתקרר.
- להסיר את microelectrodes הצלחת (באמצעות גילוח או להב סכין לחתוך את הקלטת) למקם אותם לתוך מיכל אטום מילוי סופג לחות. Microelectrodes Silanized כל הזמן ללא של לחות יכול לשמש עבור עד שבוע 1 בעקבות silanization.
- הטרמה האלקטרודות
- להכין פתרון מניות של K+ ionophore קוקטייל: 5% w/v valinomycin, 93% v/v 1, 2-דימתיל-3-nitrobenzene, 2% w/v אשלגן tetrakis(4-chlorophenyl) בוראט11. פתרון זה הוא חלש צבע צהוב. לשמור בכלי אטום, אטום לאוויר בטמפרטורת החדר. אם נשמרת כראוי פתרון זה יכול להימשך חודשים רבים.
- להכין פתרון מניות של 10 מ מ HEPES buffered 300 מ"מ NaCl ב- pH 7.4. לתקן את האלקטרודה לתוך מלחציים מילוי עם NaCl במאגר באמצעות טיפ microfil 28 גרם מחובר מזרק. שים לב כי תמיסת מלח הגיע לסוף של קצה microelectrode. לאשר microelectrode חינם של בועות גדולות שעלולה להפריע זרימת הזרם.
- לשבור את קצה האלקטרודה רחב, באמצעות הצד הקהה של אזמל או גילוח כ 10-20 מיקרומטר.
- שימוש של micropipette, להחיל droplet קטן (~0.1 µl) של ionophore K+ סמוך לקצה microelectrode. אם האלקטרודה כבר כראוי silanized שה-droplet ייקלטו הקצה השבור. מילוי האלקטרודה 1-2 מ"מ עם K+ ionophore, ולהסיר עודפי באמצעות ממחטת נייר.
2. כיול של K+ Microelectrodes סלקטיבית
- אופן ההכנה של פתרונות כיול
- להכין פתרונות של ריכוזים שונים של אשלגן בנוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) שווה osmolarity על-ידי החלפת אשלגן כלורי NaCl. השתמשנו 0.1, 1, 4.5, 10 ו- 100 מ מ K+ , חנה המבר לצורך כיול של האלקטרודות. המתכונים האלה פתרונות כיול מפורטים בטבלה 1.
| כימית | MW | מ מ הסופי | 0.1 מ מ [K +] | 1 מ"מ [K +] | 4.5 מ מ [K +] | 10 מ מ [K +] | 100 מ מ [K +] |
| (g / mol) | |||||||
| NaCl | 58.44 | משתנה | 1.51 g | 1.50 גרם | 1.44 g | 1.4 גרם | 0.345 g |
| אשלגן כלורי | 1 מ' מניות | משתנה | 20 µl | 200 µl | 900 µl | 2 מ | 20 מ |
| CaCl2 | 1 מ' מניות | 2 | 400 µl | ||||
| MgCl2 | 1 מ' מניות | 1 | 200 µl | ||||
| 2PO NaH4 | 119.98 | 1.2 | 0.29 g | ||||
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 0.437 g | ||||
| D-גלוקוז | 180.16 | 10 | 0.360 g | ||||
| מים | q.s. 200 מ ל | ||||||
טבלה 1. אשלגן כיול פתרונות
- כיול microelectrode
- בועה כל הפתרונות ב- 95% או2/5% CO2 לפחות 20 דקות לפני תחילת הניסוי. להתחיל פרפוזיה האמבט עם 4.5 מ מ [K+] חנה המבר בקצב של 3 מ ל לדקה. למקם את האלקטרודה סלקטיבי K+ מחזיק אלקטרודה מחוברת headstage האלקטרודות על manipulator. Headstage הזה מחובר מגבר המתאים. הכנס את קצה האלקטרודה perfusate אמבט.
- ודא שהאלקטרודה הקרקע Ag/AgCl והכל טובל הפתרון אותו הזרם יציב. להחיל כיול פתרונות אופנה stepwise ולהקליט את השינויים פוטנציאליים ב mV לאורך קצה האלקטרודה. לחכות הפוטנציאל בקצה האלקטרודה להגיע ערך יציב לפני המעבר הפתרון הבא
- למדוד את השינוי מתח מצב יציב בתגובה היישום של הפתרונות כיול אל קצה האלקטרודה. לאשר כי השיפוע של תגובת אלקטרודה היא 52 לפחות לא יותר מ 58 mV לכל יומן בשינוי [K+].
3. הכנת פרוסות המוח בהיפוקמפוס חריפה
- אופן ההכנה של פתרונות פרוסה
- הכנת 500 מ"ל סוכרוז חיתוך פתרון מורכב: 194 מ"מ סוכרוז, 30 מ מ NaCl, 4.5 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ D-גלוקוז, 1 מ MgCl2,2PO NaH 1.2 מ מ4, ו 26 מ מ NaHCO3, 290-300 mOsm, רווי 95% O2 ו- 5% CO2.
- להכין 1-2 ליטר פתרון הקלטה (כלנית חדד) מורכב: 124 מ"מ NaCl, 4.5 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl2, 10 מ מ D-גלוקוז, מ מ 2 CaCl2, 1.2 מ מ NaH2PO4ו- 26 מ מ NaHCO3; pH 7.3-7.4 (לאחר מבעבעים), 290-300 mOsm, רווי 95% O2 ו- 5% CO2. מילוי גביע המכיל חדר בעל המוח פרוסה עם הקלטה פתרון ולשמור אותו ב- 32-34 מעלות צלזיוס. למלא את התא vibratome הרפש קרח-מים.
- הכנה חריפה פרוסה
- עמוק עזים ומתנגד עכבר על-ידי הצבתו בתוך צנצנת precharged עם 2-3 מ ל איזופלוריין. בדוק אם רפלקס קמצוץ הבוהן, אם לא מגיב, במהירות לערוף אותו בעזרת זוג מספריים חדים או גיליוטינה כמו פרוטוקול החיות שלך דורש.
- עושים חתך 2-3 ס מ באמצעות המזמרה מחלק סימטרית של הגולגולת לחתוך את הקרקפת לאורך הקו האמצעי. בזמן באופן ידני בכדי לבטל את הקרקפת, לעשות שני 1 ס מ אופקי חתכים של המאגנום נקב לאורך הצד של הגולגולת. אז, בעזרת מזמרה בסדר, חותכים חתך האורך של הגולגולת, לאורך הקו האמצעי מהחלק האחורי של הגולגולת האף.
- באמצעות מלקחיים בסדר מוכנס ליד הקו האמצעי, תמשוך את הגולגולת חרות בשני חלקים. לחלץ את מוח העכבר הגולגולת ולהשתמש להב להסיר את המוח ואת הריח נורות, אשר ממוקמים בהתאמה החלקים סימטרית, rostral של המוח. אלה יכול להיות מזוהה על ידי סדקים גדולים, אשר מפרידים בינם לבין קליפת המוח.
- הר הרחוב המוח על מגש vibratome באמצעות דבק סופר. למלא את המגש vibratome פתרון חיתוך קר כקרח.
- חותכים מקטעי רקמת במטוס הילתית ב 300 עובי מיקרומטר. בדרך כלל ניתן לאסוף 6 פרוסות בהיפוקמפוס הילתית.
- לאחר כל מקטע הוא נחתך, מיד להעביר את הפרוסות הפרוסה מחזיק גביע התחמם עד 32-34 מעלות צלזיוס. להשאיר הסעיפים בטמפרטורה זו כעשרים דקות לפני הסרת כשהספל המכיל את המקטעים ולמקם זה בטמפרטורת החדר במשך 20-30 דקות לפחות לפני ההקלטה.
4. מדידת דינמיקה חשמלית עורר K+
- הגדרת ההכנה פרוסה
- הנח בעדינות את הפרוסה המוח באמבטיה באמצעות פיפטה של פסטר, בעדינות שיצמיד אותו למקום עם נבל פלטינה עם ניילון מחרוזות.
- ודא הטיפים של האלקטרודה גירוי דו קוטבית מקבילים אחד לשני, נמצאים בגובה המטוס הפרוסה. . לאט, במשך 6-7 שניות, הכנס האלקטרודות CA3 הרובד radiatum כ- 40-50 מיקרומטר עמוק כדי לעורר שפר בהתקפה. בסעיפים הילתית, CA3 יכול להיות כ מזוהה כמו החלק של ההיפוקמפוס לרוחב מתאים לשכבת תא גרגר-מסכות בהיפוקמפוס, עם radiatum הרובד נופל המדיאלי, הגחון בשכבת תאים כפירמידה.
- להוסיף בזהירות את K+-סלקטיבית אלקטרודה לתוך CA1 שכבה radiatum כ 50 מיקרומטר עמוק, על-ידי הנמכת לאט האלקטרודה מעל כ- 3-4 שניות. לאפשר בעל פוטנציאל לייצב על פני האלקטרודה לפני החלת stimulations כדי הפרוסה: זה בדרך כלל לוקח 5-10 דקות. אם הפרוסה תערוכות ספונטנית שינויים חוץ-תאי K+ לאחר מכן למחוק, חזור על תהליך זה עם פרוסה חדשה.
- מדד עורר שחרור K+
- להחיל רכבות של גירוי חשמלי (8 פולסים) על ידי באופן ידני מדכא על ההדק על ממריץ תוך כדי הקלטה דיגיטלית תגובות. החל גירוי ב-10 הרץ ו 1 רוחב פולס ms, החל מ- 10 משרעת הגירוי µA.
- החל amplitudes גירוי גדל והולך לפי פקטור של 2 עד משרעת התגובה המרבית K+ מזוהה. אם אינך רואה תגובה כלשהי, העבר את המיקום של האלקטרודה K+ קרוב יותר לאתר גירוי 100 מיקרומטר בהפרשים
- לקבוע את משרעת גירוי שמייצר את התגובה מקסימלי חצי. מניסיוננו, זה בין 40-160 µA, כתלות באיכות ההכנה, הגיל של בעלי חיים, לבין המרחק בין גירוי אלקטרודות אלקטרודה סלקטיבי K+ .
- הפרוסה אותה, באמצעות משרעת של הגירוי בשלב אחד נמוך יותר מאשר משרעת שמייצר את התגובה מקסימלי חצי (למשל אם 80 µA מייצרת לתגובה חצי-מקסימלי, להשתמש 40 µA) החל גירוי רכבות של הגדלת מספר פולסים. בתחילה, השתמשנו רכבות של פולסים 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128.
- כדי לוודא כי K+ אותות הם מתווכת על-ידי ירי פוטנציאל הפעולה של האמבטיה בהתקפה שפר חשמלית מגורה, החל 0.5 מיקרומטר TTX בחנה המבר במשך 10 דקות וחזור על פרוטוקול גירוי. אין עורר תגובות להתייחס.
- לאחר שסיים את הניסוי פרוסה, לאשר האלקטרודה הקפיד שלה responsivity על ידי כיול מחדש האלקטרודה בפתרונות כיול ו הבטחת התגובה סטה לא יותר מ 10% מ כיול הראשונית
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
למדידה סלקטיבי של K חוץ-תאית+, הכנו microelectrodes סלקטיבית יון מצופה בשכבה הידרופובי דרך silanization של פיפטות זכוכית בורוסיליקט נקי (איור 1 א'). ציפוי זה מאפשר את ionophore K+ המכיל valinomycin לנוח בקצה האלקטרודה ולא להתיר רק K+ שטף דרך פתח צר בקצה אלקטרודה (איור 1B). לאחר הטרמה האלקטרודות עם תמיסת מלח עצמם נסתמו, את ionophore K+ , האלקטרודות ניתן לבחון את תגובתם המהירה וארוך stepwise שינויים בריכוזים K+ אמבט (איור 3 א) ועבור את תגובתם אמבט K+ שינויים על פני הטווח כיול (איור 3B) בתוך תמיסת מלח או חנה המבר באופן שמנבאת משוואת נרנסט2. השינוי במצב יציב פוטנציאליים ניתן להתוות נגד האמבטיה K+ ריכוז על מנת לקבוע את השיפוע של הקו, אשר צריכה להיות כ 58.2 mV לכל יומן [K+], על פי משוואת נרנסט, ו לא פחות מ-52 mV לכל כניסה [K+] (איור 3C). אנחנו בנוסף את התגובתיות של האלקטרודות סלקטיבי K+ נבדק ונמצא כי הם הגיבו שינוי בעובי 5.5 מ מ K+ עם קבועי זמן עלייה ודעיכה של 85 אלפיות שניה (איור תלת-ממד,E).
המתקן הקלטה אלקטרופיזיולוגיות מורכב מיקרוסקופ זקוף רגיל מחובר צג LCD עבור זיהוי המיקום עירור והקלטה אלקטרודות. אופטיקה מיוחד לא נחוצים להנחה חזותי של K+ , גירוי אלקטרודות; אנו משתמשים 5 x או המטרה 10x עדשה ואור לבן של נורת הלוגן, אך נורת LED יכול לשמש במקום. האלקטרודה מגרה מחובר הפלט של isolator גירוי, אשר מספק depolarizing הנוכחי באמצעות מסירה מתוזמן של פולסים של ממריץ או מהתקן אחר-עיתוי כזה. במילים אחרות, ממריץ מספק רכבות של 2 V, 10-20 Hz פולסים תזמון isolator הגירוי. עם קבלת פולסים אלו, isolator גירוי מספק ואז הזרם הרצוי האלקטרודות גירוי. האלקטרודה הקלטה מחובר מחזיק האלקטרודה, מחובר headstage, מגבר ולוח A/D, אשר ממשק למחשב בעזרת תוכנת הקלטה אלקטרופזיולוגים (איור 4A). לאחר האלקטרודה כוילה בהצלחה הפרוסות חריפה היה מוכן, ניתן להניח הפרוסה ב perfusate חנה המבר. כדי לעורר את בהתקפה שפר, K+-אלקטרודה סלקטיבי ממוקם בתוך radiatum שכבה CA1, האלקטרודה גירוי השדה ממוקם בתוך CA3 (איור 4B).
ברגע האלקטרודות מוקמו ההקלטה K+ הגיעה בסיס יציב, ואז פולסים של הגדלת משרעת הנוכחי ניתן להחיל על הפרוסה (איור 5, העליון). צורת גל של פעילות זו מופיעה עלייה מהירה ב K+ עם שיעור דעיכה מעריכית, במסגרתו הוא ביטל ביישום TTX (איור 5, התחתון).
איור 1 : תרשים של silanization התגובה ואדריכלות סלקטיבי microelectrode K+ . א ייצוג סכמטי של תגובה silanization המתרחש בין קבוצות הידרוקסיל קוטבי חשוף זכוכית בורוסיליקט את dichlorodimethylsilane ריאגנט silanization (DDS). התגובה הזו מעבד את פני השטח של הזכוכית הידרופוביות, אשר מאפשר את ionophore K+ ליצור קרום דק. B. דיאגרמה של microelectrode סלקטיבית K+ . האלקטרודה עצמם נסתמו עם תמיסת והוא הפתרון סלקטיבי K+ מקום בשכבה בעובי 1-2 מ מ בקצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תרשים של מיצוי DDS. ייצוג סכמטי של נוהל החלפת חנקן DDS החילוץ של מיכל. DDS הוא הפכפך, יכול להגיב באלימות עם באטמוספרה כאשר זה בריכוזים גבוהים ולכן שיש צורך להחליף את המב להסיר עם גז חנקן אינרטי. בלון ממולא חנקן מחובר מחט באמצעות מזרק או אבובים המתאים. את המחט מוחדר דרך חומר האיטום על המכולה ומאפשר זרימת גז (N2) חנקן לתוך המיכל. בנפרד, מחט ארוכה (3-10 ס מ) מחובר מזרק 1 מ"ל, מוכנס לתוך המכולה. המזרק משמש לאחר מכן כדי לחלץ DDS, בעוד רק גז חנקן יכולים להזין את המכולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : כיול של microelectrodes. א אמבט זלוף היישום של ריכוזים שונים של K+ בתוך תמיסת מלח יכול במהירות, הפיכה לייצר שינויים Nernstian הפוטנציאל על פני קצה האלקטרודה. B. יישום Stepwise של K+ חנה המבר מעורר שינוי מאפיין ויציב הפוטנציאל עצה אלקטרודה. ג. מגרש של השינוי mV של האלקטרודה סלקטיבי K+ בתגובה הגדלת ריכוזים של K+ ב ארבע אלקטרודות; ה R2 הוא 0.9995 עבור האלקטרודות ארבע. ד זלוף מהר אמבט יישום מערכת של 10 מ מ K+ גורם לתגובה שלב במתח על פני קצה האלקטרודה סלקטיבי K+ . אי העלילה של התגובה נמדד פעמים (טאו ב ms); אין הבדל בין זמן עלייה ודעיכה זוהה (זאת אומרת ± SEM, p = 0.939, שני מדגם t-מבחן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : מכשירי מדידה K+ חוץ-תאית. א המתקן אלקטרופיזיולוגיה מורכב מיקרוסקופ קבוע לטבלה אנטי רטט עם המצלמה המצורפת, צג LCD להמחשת פרוסה. האלקטרודה K+ קבוע headstage, מגבר ו אנלוגי לוח דיגיטלי אשר פלטי את האות מחשב מחובר עם תוכנת הקלטה אלקטרופיזיולוגיות. האלקטרודות גירוי חשמלי מחובר isolator גירוי אשר משתנה את משרעת גירוי ממריץ למסירה גירוי תזמון. B. דיאגרמה של הכנת פרוסה ואת המיקום של מיקום האלקטרודות שונים על הפרוסה. CA3 ניתן לזהות עם radiatum הרובד נופל rostral בשכבת תאים כפירמידה כמו החלק של ההיפוקמפוס לרוחב מתאים לשכבת תא גרגר-מסכות בהיפוקמפוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : מדידה של חשמלית עורר שחרור K+ . עקבות נציג של K+ שחרור האלקטרודה הקלטה בתנאים הבזליים (למעלה), הפסד שלהם על היישום של טטרודוקסין (0.25 מיקרומטר) עבור 5 דקות לפני הקלטה (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה שבה נתאר כאן אפשרה לנו להעריך K+ dynamics בתגובה גירוי חשמלי של שפר בהתקפה חריפה פרוסות בהיפוקמפוס של עכברים בוגרים. אופן הכנת K+ יון סלקטיבי microelectrodes דומה מוקדם יותר המתואר הליכים12,13,14,15. אולם, שיטה זו יש יתרונות על פני תצורות אלקטרודה חלופי כי הוא מהיר ולא מסובך להכין K+ microelectrodes סלקטיבית. לאחר כיול המתאים, האלקטרודות נמצאו למדוד robustly K+ dynamics פרוסות במהלך גירוי חשמלי, התגובות הנ ל היו חסומים טטרודוטוקסין. בניסויים אלה, שימשו stimulations של 80-160 uA ב-10 הרץ; עם זאת, אופטימיזציה של גירוי התנאים עבור ניסוי מסוים, אזור במוח עניין יידרש. ערכים אלה מפורטים כמדריך.
השיפוע של התגובה של האלקטרודות צריך להיות 58.2 mV לכל יומן [K+]. ערך כה הוא ניבא מן המשוואות נרנסט, Nicolsky-אייזנמן עבור K+ בררני קרום חדיר למחצה; האחרון כדאי חשבונות עבור אינטראקציות בין יונים16. אם האלקטרודה אינה מגיבה באופן החזוי, זה יכול להיות אחד משני טעמים. קודם silanization יכול להיות לקוי, גורם קרום להיות גשרים שאבדו או מלח לטופס. לאשר כי הקרום לא נפגע על ידי התבוננות מבעד למיקרוסקופ, צריך להיות ממשק ברור בין הפתרון פיפטה הקרום. סיבה נוספת, יכול להיות הנוכחות של בועות פיפטה לעכב את הזרימה של הנוכחי של החוט כלוריד כסף. אם בועות. מובחנות, ואז להסיר את פיפטה פליק נמרצות כדי להסיר אותם. אם פתרונות אלה ייכשלו, מחדש לעשות עוד K+ אלקטרודה סלקטיבית או חוזר silanization עבור יותר או בטמפרטורות גבוהות יותר. עם זאת, חשוב לחזור על פקדים אלה מפתח בכל פעם אזור במוח חדש הוא למד או microelectrode החדש נבדק.
שני מגברים ספציפי שימשו בניסויים אלה, אך מגברים אחרים יכול לשמש כל עוד עכבת הוא גדול או שווה ל- 500 MΩ. שיש מכויל האלקטרודות עם הן 500 MΩ ואימפדנסים 5 GΩ קלט, מצאנו שם נגמר אין הבדל השיפוע של התגובה מתח עם אחת מהגדרות ריכוזים טווח של K+ (mV ± 0.9 ± 0.7 ו- 56.5 56.9 לכל שינוי ten-fold [K+ < / c1 >] עבור 500 MΩ 5 GΩ קלט impedances, בהתאמה; P = 0.759, מזווגים t-test, n = 4 אלקטרודות).
השתמשנו גם מתגי פתרון מהיר כדי להעריך את זמן התגובה של החקירה קפיצה ידוע ב [K+] מ- 4.5 עד 10 מ"מ (איור תלת-ממד). האלקטרודות הגיבה עלייה ודעיכה פעמים (טאו) של ± ± 12 ו 85 85 15 ms, בהתאמה. ביחס זה, קינטיקה exchange הפתרון עבור switcher פתרון מהיר מותאם אישית שלנו היה 85 ± 27 מכאן, גב' האלקטרודות סלקטיבי K+ מגיבות עם קינטיקה מהר ככל switcher פתרון שאנחנו מועסקים ולא רחוק מהר יותר הדינמיקה של K+ חוץ-תאית הסביבה שבה התרחשה בעקבות גירוי סביבתי שפר (איור 5). נתונים אלו מראים כי אלקטרודות סלקטיבי K+ יכול לשמש כדי להעריך את קינטיקה של הצטברות K+ , סיווג ברקמת המוח. עם זאת, בעתיד לעבוד הפקדים המתאימים, יהיה צורך ולידציות על בסיס מקרה לגופו. אנו ממליצים כי זה יקר לבלות זמן להבין את פתרון exchange קינטיקה בתא ההקלטה שלך...
מצאנו שלושה גורמים חשובה ביותר המשפיעים על איכות ועמידות של מדידות K+ לפרוסות. הראשונה היא האיכות של ההכנה, רקמות בריאות והן גיל החיים להופיע רלבנטים. במחקר זה, השתמשנו עכברים C57/Bl6N כי הם ~ 12 שבועות. במקרים נדירים, מצאנו פרוסות עם תנודות K+ ספונטנית בהיקף של ~0.1 מ"מ ובר קיימא 5-10 שניות; פרוסות אלה שנמחקו. השניה היא האיכות של microelectrode ההקלטה. הנושא העיקרי הוא הזמן ואת הטמפרטורה המשמשת עבור silanization של הזכוכית משך נימי. אנו ממליצים > 170 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות לפחות (עד לילה הוא מקובל) או ב- 200 מעלות במשך 30 דקות. חימום לא מספיק של האלקטרודות עם הכימית silanization יכול להוביל אלקטרודות זה לא לשמור על מצב יציב פוטנציאליים בשל אובדן הדרגתי ionophore K+ . בנוסף, בעת הכנת האלקטרודות, מומלץ להניח שכבה דקה (1-2 מ מ) של ionophore K+ בקצה בקוטר של 10-20 מיקרומטר קרי-בערך בגודל של גוף התא הממוצע (איור 1B). אינם מפרים את הטיפ רחבים יתר על המידה, או קרום בררני K+ יאבד את תקינות ולא האלקטרודה ייכשל. שלב זה עלול לדרוש קצת אימון להשגת טיפים של הגודל הנכון. אלקטרודות סלקטיבי K+ עם טיפ דק או עבה מדי של שכבה יכול לקבל תגובות לאיטי, בהשוואה לאלקטרודות שלא נבנה כהלכה. הגורם השלישי הוא המרחק בין האלקטרודה גירוי האלקטרודה סלקטיבי K+ . אנו השתמשו של הבין-אלקטרודה מרחק של-500 מיקרומטר, אולם המרחק האופטימלי יכול להשתנות במידה ניכרת את האזור במוח בודדים, יהיה צורך לשקול בזהירות לניסוי מסוים בהישג יד.
בנוסף לתצורת חבית, קיימות כיום מספר שיטות להכנת K+-microelectrodes סלקטיבית של הפרעה דו קוטבית או קונצנטריים תבניות17. לעומת התיאורים שפורסמו של שיטות אלה, אלקטרודות ערוץ אחד יש שני חסרונות עיקריים: 1) מעט גדול יותר טיפ קוטר (~ 10 לעומת 4 מיקרומטר), אשר יכול לגרום שיבוש רבתי שטח חוץ-תאית comparted כדי הפרעה דו קוטבית או קונצנטריים אלקטרודות, ו- 2) אי-תאימות עם מדידת בו זמנית של מספר מינים יון כמו האלקטרודות הפרעה דו קוטבית. עם זאת, ערוץ אחד האלקטרודות מציעים מספר יתרונות. באופן ספציפי, האלקטרודות יכול להיות מפוברק תוך פחות מחמש דקות, ולכן הם יותר חד פעמיות, יכול וגם מכויל במהירות לפני הניסויים. לכן, הסיכון של שבירה אלקטרודה במהלך הניסויים הקורס הוא פחות מדאיג. בנוסף, כי הקרקע אלקטרודה ואת ההקלטה אלקטרודה מופרדים פיזית על ידי הנפח של האמבטיה, שאין סיכוי להיווצרות גשרי מלח בקצה האלקטרודה, אשר יכול להוביל לכישלון אלקטרודה קונצנטריים, הפרעה דו קוטבית אלקטרודות. זמן התגובה של האלקטרודות ערוץ אחד הוא מהר יותר אלקטרודות דו קוטבית ואלקטרודות להשוות קונצנטריים סביר (~ 20 ms), למרות מערכת זלוף מהר שלנו מותרת רק מדידה של זמני תגובה גודל 80 ms (איור 3E ). יתר על כן, האלקטרודות מציעים רעש נמוכה בהשוואה אלקטרודות דו קוטבי, אשר יש התנגדות טיפ גדול, דורשים שימוש מגברים עם התנגדות קלט יותר גבוהה. לבסוף, האלקטרודות אינם מצריכים השימוש של micromanipulator מיוחדים או headstage כפי נדרש עבור אלקטרודות קונצנטריים. על איזון, את היתרונות של הבנייה וקלות השימוש של אלקטרודות ערוץ אחד עולה על החסרונות.
הגישה כי השתמשנו כאן כדי למדוד דינמיקה K+ פרוסות יכול לשמש באזורים רבים של המוח ללמוד תקנה K+ . למרות פרוטוקול זה מדגים את השימוש של K+-אלקטרודות סלקטיבי המידות של הדינמיקה של יוני אשלגן עורר חשמלית בתוך המוח רקמות, פרוטוקול זה יכול להיות בשימוש נרחב ברקמות שונות רבות איפה זה רצוי למדוד דינמיקה K+ . מצבים כאלה עשויים לכלול ספונטנית דינמיקה ושינויים בתגובה תרופתי, optogenetic, או chemogenetic ההפעלה הסלולרית. Microelectrodes אלה יכולה להתבצע באמצעות מספקת איכות ואמינות כדי לאפשר אינטגרציה מהירה של טכניקה זו לתוך ארגז הכלים כל מעבדה. ניתוח מפורט של ריכוזים K+ בריאות ובמדינות הפגוע יאפשר עוד זיהוי, כימות של רכיבים שונים איך מולקולרית, תאית לתרום מנוחתו K+ ריכוזים של המוח3, 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המעבדה Khakh נתמכה על ידי NIH MH104069. המעבדה Mody נתמכה על ידי NIH NS030549. J.C.O. תודה את Grant(NS058280) של NIH T32 אימונים מתוכנת עצבית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
References
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
