Neuroscience

作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウムイオン選択的な電極を使用して

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57511

J. Christopher Octeau¹, Guido Faas², Istvan Mody^1,2, Baljit S. Khakh^1,3

¹Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ²Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ³Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Summary

カリウムイオンは細胞の静止膜電位に貢献し、細胞外の K⁺濃度細胞興奮性の重要な調節因子であります。確認、調整、モノポーラ K⁺を使用する方法について説明-選択的な電極。そのような電極を使用すると、大人の海馬スライスにおける電気的誘発 K⁺濃度動態の測定ができます。

Abstract

カリウムイオンは細胞の静止膜電位に貢献し、そのため、細胞外の K⁺濃度は細胞興奮性の重要な調節因子。活動電位の根底にある電位依存性イオンチャネルのクローズ、オープン、不活化状態間の平衡をシフトすることによって静止膜電位および細胞内興奮性細胞外の K⁺影響の濃度を変更発生と伝導。したがって、健康と病気にかかった状態で細胞外の K⁺のダイナミクスを直接測定する貴重なです。ここでは、確認、調整および単極 K⁺を使用する方法について述べる-選択的な電極。我々は電気的誘発 K⁺濃度動態を測定する成体海馬スライスで展開します。そのような電極の賢い使用は神経系における細胞外の K⁺の濃度を制御する細胞および生物物理学的メカニズムを評価するために必要なツールキットの重要な部分です。

Introduction

カリウムイオンの濃度が脳内で堅く調整され、それらの変動はすべての細胞の静止膜電位に強力な影響を及ぼします。これらの重要な貢献の観点から、生物学の重要な目標は、¹体のさまざまな器官の細胞外スペースでしっかりと K⁺の濃度を調節するために使用する細胞および生物物理学的メカニズムを決定することです。^,²。これらの研究で重要な要件は、K⁺濃度を正確に測定する能力。健康と病気の状態では、脳でカリウムの恒常性に貢献する多くのコンポーネントされているが、識別された³^,⁴^、⁵、さらに進行中の専門にされた性質のため抑制されていますカリウム測定用イオン選択性電極の準備。電極センサーを表す K⁺濃度の in vitro組織スライスのin vivo測定のゴールドスタンダード。

監視 K⁺のための新しいアプローチがしかし、これらは生物学的関連性の高い範囲の K⁺濃度を検出しないまたはない吟味されている完全に生体が光センサーを使用して開発中の最初の結果有望な⁶^,⁷^,⁸が表示されます。光センサーと比較して、電極、電極アレイ⁹空間分解能を向上させることが根本的にイオンの点光源測定に限定。K⁺の動態を監視するため銃身の単一電極センサーについて説明します。

この仕事で K⁺の選択的な電極、高選択的許可バリノマイシンベースカリウムイオノフォアを使用して (10⁴倍 K⁺ Na⁺選択性) をする段階的な手順の詳細は報告する K⁺膜¹⁰を移動します。自然に発生するポリペプチド、バリノマイシンは K⁺透水性孔として機能し、それの電気化学的勾配を K⁺の流れが容易になります。電極を調整する方法についても述べる保存し、それらを使用する方法、最後に大人のマウスから急性海馬脳スライスの K⁺濃度動態を測定するための展開方法について。特定のイオンチャネル細胞外 K⁺のダイナミクスを規制する提案を持たない遺伝子改変マウスと共にそのような電極を使用する必要があります K の大気中濃度を制御する神経系によって使用される細胞メカニズムを明らかにします。⁺細胞外の環境の中で。

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Protocol

すべての動物実験は、ケアと実験動物の使用のため国立の研究所に従って健康ガイドを実施し、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で一等書記官の動物研究委員会によって承認されました。すべてのマウスは、12 h 光暗い環境で食料や水の利用可能な自由で収容されました。すべての動物は明らかな行動変化と健康だったが以前の研究に関与していない、ライトサイクルの犠牲になった。実験のデータは、成体マウス (6-8 週間すべての実験のために古い) から収集されました。

1 K⁺の選択的な電極の作製

ホウケイ酸ガラスのシリル化
1. 包装から十分なガラス管を取り外し、50 mL の円錐管に入れます。穏やかな撹拌一晩塩酸または最低 6 時間で 1 M 塩酸洗浄電極上部に円錐形の管を埋めます。
2. 70% エタノールで毛細血管を簡単に洗浄し、6-8 時間 100-120 ° C で完全に乾燥します。さらに使用する前に最大 4 週間の無水カルシウム硫酸塩の乾燥剤を容器に洗った毛細血管を格納します。
3. シリル化、前に電極の引き手を使用してファインチップに毛細血管を引き出します。使用する電極は、直径約 2-5 ミクロンです。皮膚からオイルがシリル化を妨げることができます常に手袋で洗った毛細血管を処理します。
4. 電極が先端の破損を防ぐために下から上昇しているので、ガラスの容器に電極を配置します。オートクレーブテープまたは同じような粘着テープを使用してコンテナーへ電極を修正します。
5. 窒素置換メソッドを使用して、そのコンテナーから 5 %dichlorodimethylsilane (DDS) シリル化ソリューションの約 0.5 mL を削除 (図 2参照)。窒素ガスで風船をいっぱい、バルーンにシリンジやチューブ、針を取り付けます。長い針を介して別の注射器に DDS を描きながら、DDS コンテナーに針を挿入します。
6. ピペットの先端に滴下シリル化ソリューションを適用し、すぐにカバーします。シリル化ソリューションと電極に予め温めておいた (170-180 ° C) 実験室のオーブンに 10-12 時間または保持 200-220 ° C で 30 分のコンテナーを配置します。
7. 、孵化後は、オーブンを切りオーブンからプレートを削除します。非常に暑いので、インキュベーターからプレートを削除する注意してください。クールをガラスに 10-15 分間室温でベンチにプレートを配置します。
8. (テープをカットするかみそりの刃やメスの刃を使用して) プレートから、電極を削除と乾燥剤充填密閉容器にそれらを置きます。水分の自由保たれるシラン処理電極は、シリル化、次まで 1 週間使用できます。
電極をプライミング
1. K⁺イオノフォアカクテルの貯蔵液の準備: 5 %w/v バリノマイシン、93 %v/v 1, 2-ジメチル-3-ニトロベンゼン、2 w/v カリウム tetrakis(4-chlorophenyl) ホウ酸¹¹。このソリューションは、かすかな黄色の色です。室温の気密、不透明な容器にしてください。正しく保存されているこのソリューションが数ヶ月を持続できます。
2. 10 mM HEPES 緩衝 pH 7.4 で 300 mM の NaCl の原液を準備します。クランプとバックフィルに注射器に接続されている 28 G microfil の先端を使用してバッファーの NaCl で電極を固定します。食塩が電極先端の終わりに達したことを確認します。電極は電流の流れを妨げる大きな泡の無料を確認します。
3. 電極の先端を約 10-20 μ m、メスやかみそりの刃の鈍側を使用して、幅に分割します。
4. マイクロピペットを使用して、微小電極の先端の近くの K⁺イオノフォアの小さな液滴 (~0.1 μ l) を適用します。電極が正しく処理されている場合、壊れた先端に液滴が吸収されます。塗りつぶし K⁺イオノフォアと過剰な削除 1-2 mm の電極は、ティッシュペーパーを使用してください。

2 K⁺の選択的な電極の校正

校正溶液の調製
1. KCl 塩化ナトリウムに置き換えて等しい浸透圧人工髄液 (アプライド) KCl の様々な濃度の溶液を準備します。電極校正用 0.1、1、10 および 100 ミリメートル K⁺アプライド、4.5 を使いました。表 1にこれらの校正ソリューションのレシピのとおりです。

化学	MW	最終的な mM	0.1 mM [K +]	1 mM [K +]	4.5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
化学	(g/mol)	最終的な mM	0.1 mM [K +]	1 mM [K +]	4.5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
塩化ナトリウム	58.44	異なります	1.51 g	1.50 g	1.44 g	1.4 g	0.345 g
KCl	在庫 1 M	異なります	20 μ l	200 μ l	900 μ l	2 ml	20 ml
CaCl₂	在庫 1 M	2	400 μ l
MgCl₂	在庫 1 M	1	200 μ l
NaH₂PO₄	119.98	1.2	0.29 g
NaHCO₃	84.01	26	0.437 g
D-グルコース	180.16	10	0.360 g
水	品質 200 ml

表 1。カリウム校正ソリューション

電極校正
1. 実験を開始する前に、少なくとも 20 分間 95% O₂5% CO₂とすべてのソリューションをバブルします。4.5 mM [K⁺] と一緒にお風呂を灌開始 3 mL/分の速度でアプライド。マニピュレーターを電極パッチアンプ用アダプターに接続されている電極ホルダーに K⁺電極を配置します。このパッチアンプ用アダプターは、適切なアンプに接続されます。浴液に電極の先端を挿入します。
2. 銀/塩化銀接地電極は同じソリューションに包まれて流れが安定したことを確認します。段階的校正ソリューションを適用し、電極先端部にわたって mV の電位変化を記録します。次の解決策に切り替える前に安定した値に達するまで電極先端部の電位を待つ
3. 電極先端部に校正ソリューションのアプリケーションへの応答の定常電圧変化を測定します。電極の応答の斜面が少なくとも 52 と 58 を超えないことを確認 [K⁺] のログ変更ごとの mV。

3. 急性海馬脳スライスの準備

スライス溶液の調製
1. 500 mL のショ糖を準備切削ソリューションから成る: 194 mM ショ糖、30 mM の NaCl、4.5 mM KCl、10 mM 1 mM MgCl₂D-グルコース、1.2 mM NaH₂PO₄と 26 mM NaHCO₃95% O₂と 5% CO₂飽和 290 300 mOsm。
2. 構成されてレコーディングソリューション (アプライド) の 1-2 リットルを準備: 124 mM の NaCl、4.5 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM D-グルコース、CaCl₂2 mM、1.2 mM NaH₂PO₄と 26 mM NaHCO₃;pH 7.3 7.4 (バブル) 後、95% O₂と 5% CO₂飽和 290 300 mOsm。録音ソリューションと脳スライスホルダーチャンバーを含むビーカーを記入し、32-34 ° c. でそれを維持Vibratome のチャンバーを氷-水の秘密を持つ。
急性スライス標本
1. 深く 2-3 mL イソフルランとプリチャージベルジャーにそれを置くことによってマウスを麻酔します。つま先ピンチ反射確認し、場合非対応で急速に首を切る鋭いハサミやギロチンのペアを使用して動物のプロトコルを必要とします。
2. 正中線に沿って頭皮をカットする頭蓋骨の尾の部分からはさみを使用して 2-3 cm の切開を行います。頭皮を手動で取り消す中、2 1 cm 水平切開辺後頭孔から頭蓋を作る。その後、切開鼻に頭蓋の後部から正中線に沿って、頭蓋骨の長さをカット良い鋏を使用しています。
3. 正中線近くに挿入された微細鉗子を使用して、2 つの部分で切開頭蓋骨リトラクトします。頭蓋骨からマウスの脳を抽出し、小脳や脳の尾側と吻側部分にそれぞれ位置する嗅球を削除するブレードを使用します。これらは、皮質からそれらを分ける大きな亀裂によって識別することができます。
4. スーパー接着剤を使用して vibratome トレーに頭脳のブロックをマウントします。氷冷切削ソリューションで vibratome トレイを埋めます。
5. 300 μ m の厚みでコロナの平面の組織切片をカットします。通常 6 コロナ海馬スライスを収集できます。
6. 各セクションをカットすると後は、すぐにビーカー 32 から 34 ° C に加温を保持しているスライスにスライスを転送します。セクションを含むビーカーを削除する前に 20 分間この温度でセクションを維持し、記録する前に、少なくとも 20 〜 30 分の室温でこれを置きます。

4. 電気的誘発 K⁺のダイナミクス計測

スライス標本を設定
1. 浴をパスツールピペットを用いた脳スライスをそっと置き、ナイロン弦とプラチナハープの場所に押し当ててください。
2. 双極刺激電極の先端が互いに平行で、スライスの面でレベルを確認します。ゆっくりと、6-7 秒のコースで、電極に挿入 CA3 地層結腸寄生虫約 40-50 μ m シャファー側枝を刺激する深い。コロナセクションの CA3 約で識別できる適切な外側の海馬海馬の膝で顆粒細胞の層の部分の地層結腸寄生虫内側腹側錐体細胞層に落下します。
3. K⁺を慎重に挿入-CA1 地層結腸寄生虫約 50 μ m ゆっくり約 3-4 秒間に電極を下げることによって、深部に電極。刺激をスライスに適用する前に電極間で安定する可能性を許可する: これは通常 5 ~ 10 分かかります。スライスを表わす自発場合細胞外 K⁺の変化は、破棄し、新しいスライスと、このプロセスを繰り返します。
メジャー誘発 K⁺リリース
1. 手動で応答をデジタル記録中刺激でトリガーを押すことによって電気刺激 (8 パルス) の列車を適用します。10 Hz と 10 μ A 刺激振幅から始まる 1 ms のパルス幅で刺激を適用します。
2. 最大 K⁺応答振幅が検出されるまで、2 の要因によって増加の刺激振幅を適用します。任意の応答がない場合は、100 μ m 単位で刺激サイトに近い K⁺電極の位置を移動します。
3. 半分の最大応答を生成する刺激の振幅を決定します。我々の経験で、これは準備の質、動物と刺激電極と K⁺電極間距離の年齢に応じて 40 160 μ A の間です。
4. 同じスライスの半分の最大応答を生成する振幅より一段低いで刺激の振幅を使用して (例えば 80 μ A は、半最大応答を生成する場合は、40 μ A を使用して) のパルス数を増加させる刺激列車を適用。当初は、1、2、4、8、16、32、64、128 パルスの列車を使用しています。
5. K⁺の信号は電気的刺激シャファー担保風呂の活動電位発火によって仲介されることを確認するには、10 分間 0.5 μ M アプライドの TTX を適用し、刺激プロトコルを繰り返します。換起された応答を観察しない必要があります。
6. スライス実験を終えて確認電極は、再校正ソリューションで電極のキャリブレーションによってその感度を維持しているし、初期の校正から 10% 以上も逸脱していないが応答を確保します。

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Representative Results

細胞外 K⁺の選択的測定のきれいなホウケイ酸ガラスピペット (図 1 a) のシリル化による疎水性の層で被覆されたイオン選択性電極を作製しました。このコーティングにより、バリノマイシン電極の先端に置き、電極先端 (図 1 b) の狭い開口部を通って K⁺フラックスのみを許可するを含む K⁺イオノフォアです。埋食塩と K⁺イオノフォア電極をプライミング後バス K⁺濃度 (図 3 a) の段階的な変化に彼らの急速なと線形応答への応答として、電極はテストできます。バス K⁺は、生理食塩水の調整範囲内 (図 3 b) で変更またはネルンスト式²によって予測された方法でアプライド。潜在的な定常状態の変化は約 58.2 あるべき直線の傾きを決定するためにバス K⁺濃度に対してプロットできますログ [K⁺] ネルンストの同等化とも 52 によるとあたり mV mV あたりログイン [K⁺] (図 3)。我々はさらに K⁺電極の応答性をテストし、彼らが約 85 ms (図 3 D,E) の上昇と減衰時定数に K⁺で 5.5 mM の変更に対応することを発見します。

電気生理学的記録装置は、電極を記録する刺激的な配置を識別するための液晶ディスプレイに接続されている標準的な直立した顕微鏡で構成されます。K⁺と刺激電極のビジュアルを配置するための特別な光学系は必要ありません。5 倍や 10 倍対物レンズのハロゲン電球から白い光が、白色 LED は代わりにされる可能性があります。刺激電極が脱分極刺激物またはその他のタイミングデバイスからパルスの時間指定配送で現在提供刺激アイソレータの出力に接続されています。つまり、刺激は、2 V、10-20 Hz の列車に対し、刺激アイソレータにタイミングパルスを提供します。これらのパルスを受信すると、刺激アイソレータは、刺激電極に必要な電流を提供します。記録電極は、電極用ホルダー、パッチアンプ用アダプター、アンプと A/D ボード、電気生理学的記録ソフトウェア (図 4 a) で PC にインターフェイスに接続に接続されます。電極の調整が正常に完了しましたし、急性スライスが用意できたら後、は、アプライド出納のスライスを配置できます。シャファー担保を K⁺を刺激するために-CA1 地層結腸寄生虫内電極が配置され、フィールドの刺激電極は、CA3 内に配置 (図 4 b)。

一度電極が配置されている、K⁺録音に達したベースラインが安定し現在振幅の増大のパルスに適用できるスライス (図 5トップ)。このアクティビティの波形は、TTX アプリケーション (図 5下) を廃止、指数関数的減衰速度の K⁺の急激な増加として表示されます。

図 1:シリル化反応と K⁺の選択的な電極のアーキテクチャの図。A.ホウケイ酸ガラス露出極水酸基とシリル化試薬 dichlorodimethylsilane (DDS) との間に発生するシリル化反応の模式図。この反応は、薄い膜を形成する K⁺イオノフォアを可能にする疎水性でガラスの表面をレンダリングします。B.図 K⁺の選択的な電極。電極は K⁺の選択的なソリューションは、先端に 1-2 mm の厚い層での場所、食塩などならしますです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: DDS 抽出のダイアグラム。コンテナーから DDS 抽出窒素置換プロシージャの模式図。DDS は揮発性、可燃性、それは高濃度でしたがってが不活性の窒素ガスで削除 DDS を交換する必要があるときに大気中のガスに激しく反応することができます。窒素を充填した気球は、注射器や適切なチューブを介して針に接続されます。この針が容器に窒素ガス (N₂) フローを許可するコンテナーの密封剤を介して挿入されます。別々に長い (3 ~ 10 cm) 針 1 mL の注射器に接続し、コンテナーに挿入します。この注射器は、DDS、抽出窒素ガスだけはコンテナーを入力することができます使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 電極の校正。A. K⁺濃度が生理食塩水の違いによる風呂灌流アプリケーションできます迅速かつ可逆的にネルンストに変化をもたらす潜在的な電極先端部の間で。B. K⁺アプライドでの段階的な適用は、電極チップの特性と安定した変化を連想させます。C. 4 つの電極で K⁺の濃度の増加に応答 K⁺電極の mV 変化のプロットR²は、これらの 4 つの電極用 0.9995 です。+高速血流システムバスアプリケーション 10 mm K⁺ K⁺電極先端で電圧のステップ応答が発生します。E.測定された応答のプロット回 (ms のタウ);上昇、崩壊時間の違いが検出されなかった (± sem、 p = 0.939、2 つのサンプルt-テスト)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 細胞外の K⁺測定装置。A.電気生理学のリグは防振テーブルに固定して接続されたカメラとスライスの可視化のための LCD ディスプレイ顕微鏡で構成されています。K⁺電極はパッチアンプ用アダプター、アンプ、アナログを電気生理学的記録ソフトウェアに接続されている PC に信号を出力するデジタル基板に固定されています。電気刺激電極は刺激の振幅とタイミング刺激配信のため刺激に変化する刺激アイソレータに接続されます。B.スライス標本とスライスで様々な電極の配置の場所の図。CA3 は、吻側錐体細胞層に落ちている地層結腸寄生虫と海馬の膝で顆粒細胞層の適切な外側を海馬の部分として約識別できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 電気的誘発 K⁺リリースの測定。K⁺の代表的な痕跡は、基底条件 (上) 記録電極との損失 (下) を記録する前に 5 分のテトロドトキシン (0.25 μ M) の申出から解放します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明するメソッドを使用して、K⁺大人のマウスから急性海馬スライスでシャファー側枝の電気刺激に対する応答のダイナミクスを評価するためができました。K⁺イオン選択的な電極を準備するための手法は、以前記載されている手順¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵に似ています。ただし、このメソッドでは、迅速であり、K⁺の選択的な電極を準備するために複雑で、代替電極構成上の利点をします。適切な校正後しっかり電気刺激中にスライスの K⁺のダイナミクスを測定するこれらの電極が見つかりました、そのような応答は TTX によってブロックされました。これらの実験では 10 Hz で 80 160 uA の刺激は使用された;ただし、特定の実験のため、興味の脳領域の刺激条件の最適化が必要になります。これらの値は、ガイドとして表示されます。

電極の応答の斜面は 58.2 をする必要がありますログ [K⁺] あたりの mV。このような値が K⁺の選択的半透膜; のためのネルンストと Nicolsky ・アイゼンマン方程式から予測します。後者はよりイオン¹⁶間の相互作用のために占めています。電極が予測の方法で応答しない場合、これは 2 つの主な理由の 1 つかもしれない。まず、シリル化は十分ですが、フォームに紛失または塩橋に膜を引き起こすかもしれない。膜は、顕微鏡による観察でそのままピペットソリューションと膜間の明確なインタフェースが必要があることを確認します。もう一つの理由は、塩化銀ワイヤーからの電流の流れを妨げるピペットで気泡の存在可能性があります。泡が認められた場合は、ピペットやフリック積極的にそれらを削除するを削除します。これらのソリューションが失敗した場合、再別 K⁺電極を作るまたは長くまたはより高い温度でのシリル化を繰り返します。ただし、新しい脳領域の研究や新しい電極をテストするたびに、これらのキーのコントロールを繰り返すことが重要です。

特定の 2 つのアンプは、これらの実験で使用されたが、他のアンプは入力インピーダンスは 500 MΩ 以上限り、使用できます。500 MΩ と 5 GΩ 入力インピーダンス電極を校正を持つ、K⁺の範囲の濃度でなかったいずれかの設定と電圧応答の傾きの違いがわかった (10 倍変化あたり 56.9 ± 0.7 と 56.5 ± 0.9 mV [K^{+ ] 500 MΩ や 5 GΩ 入力インピーダンス、それぞれ;P = 0.759、ペアt-テスト、n = 4 の電極)。}

また 10 mM (3 D の図) を 4.5 から [k⁺] 知られているジャンプする電極の応答時間を予測する高速なソリューションスイッチを使いました。電極反応上昇と減衰時間 (タウ) 85 ± 12 と 85 ± 15 ms のそれぞれ。これに関連して当社カスタム高速ソリューションスイッチャーのソリューション交換速度は 85 ± 27 さんしたがって、K⁺電極反応速度で採用ソリューションスイッチャーとして迅速かつ K⁺のダイナミクスよりもはるかに高速で対応します。シャファー担保刺激 (図 5) の結果として細胞外の環境。これらのデータは、K⁺電極を K⁺の蓄積と脳組織のクリアランスの速度を推定する使用ことができることをお勧めします。ただし、将来的に適切なコントロールを動作し、校正ケースバイケースごとに必要になります。提案する記録室ソリューション交換反応を理解する時間を費やすことが有益です。

品質とスライスの K⁺測定の堅牢性に影響を与える 3 つの非常に重要な要因を発見しました。最初は準備の質、関連する組織の健康と使用される動物の年齢の両方が表示されます。この研究のため〜 12 週齢をされている C57/Bl6N マウスを使いました。まれに、自発的 K⁺揺動 ~0.1 mM に相当し、5-10 秒を持続させるとスライスを発見します。これらのスライスは破棄されました。2 つ目は、記録電極の品質です。主な問題は時間と温度の引っ張られたガラス管のシリル化に使用されます。お勧めします > 170 ° C 少なくとも 6 時間 (一晩までは許容される) または 200 ° C、30 分で。シリル化試薬と電極の不十分な加熱は、電極を保持しない定常状態潜在的な K⁺イオノフォアの漸進的な損失のためにつながることができます。さらに、電極を準備しているとき、つまりは平均の細胞体 (図 1 b) のサイズの約 10-20 μ m の直径で先端に K⁺イオノフォアの薄層 (1-2 mm) を配置することをお勧めします。過度に広い先端を破損していないか、または K⁺の選択的な膜は整合性を失うことになる、電極が失敗します。この手順は、適切なサイズのヒントを達成するためにいくつかの練習を必要があります。K⁺電極先端が細すぎるまたはあまりにも層の厚いは、正しく構築された電極に比較して低迷の応答を持つことができます。第三の要因は、刺激電極と K⁺の電極との間の距離です。我々約 500 μ m の電極間距離を使用している、しかし最適な距離個々の脳の部位によって、大きく変わることができます、特定の実験手で慎重に検討する必要があります。

シングルバレル構成に加えて、現在 K⁺を作るためのいくつかの方法-バイポーラおよび同心の選択的電極形式¹⁷。これらのメソッドのパブリッシュされた説明と比較して、シングルチャネル電極 2 つの主な欠点がある: 1) 大きめの先端径 (~ 10 対 4 μ m)、バイポーラと同心円状に区分細胞外スペースの大きな混乱を引き起こす可能性のあります。電極、および 2) バイポーラ電極のように複数のイオンの同時測定との互換性。ただし、シングルチャネル電極は、いくつかの利点を提供しています。具体的には、これらの電極は、5 分以内で作製することができより使い捨てしたがってとに製造・実験前に迅速に校正することができます。したがって、コースの実験中に電極破損の危険は心配が少ないです。さらに、接地電極と記録電極は、お風呂の容積によって物理的に切り離されているのでチャンスがない同心円のバイポーラ電極故障につながることができる電極の先端に塩橋の形成のため電極。シングルチャネル電極の応答時間はバイポーラ電極と可能性が同心円状に匹敵する電極 (~ 20 ms) より速く私たち高速血流システムのみ 80 ms (図 3 e程度の応答時間の測定).さらに、これらの電極は、低ノイズのバイポーラ電極、チップ抵抗が大きくなると高い入力抵抗と増幅器の使用を必要とする比較を提供しています。最後に、これらの電極には特殊なマイクロマニピュレーターまたはパッチアンプ用アダプター必要な同心円状の電極を使用は不要です。バランスでは、シングルチャネル電極の使いやすさと建設の利点はデメリットを上回る。

スライスの K⁺のダイナミクスを測定するためここで用いるアプローチは、K⁺規制を勉強する多くの脳領域で使用できます。このプロトコルは、K⁺の使用方法を示しますが-電極で電気的誘発のカリウムイオンの動態の測定のため脳組織は、このプロトコルが広くで使える多くの異なる組織が望ましいK⁺のダイナミクスを測定します。に対する薬理学的、自発的なダイナミクスと変更を含めることができますこのような状況、光遺伝学的または chemogenetic 細胞活性化。これらの電極は任意研究室ツールボックスにこの手法の迅速な統合を可能にする十分な品質と信頼性で可能です。脳³^{、濃度休憩 K⁺に貢献する様々な分子および細胞部品の検出と定量、健康と病気にかかった状態で K⁺濃度の詳細な解析がさらに有効にします。} ¹⁸^,¹⁹。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

Khakh ラボは、NIH の MH104069 によって支えられました。モディのラボは、NIH の NS030549 によって支えられました。J.C.O. は、NIH T32 神経回路トレーニング Grant(NS058280) のおかげでください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW