Summary
Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.
Abstract
Les répétitions de palindromes régulièrement intercalées en cluster (CRISPR) - CRISPR - protéine 9 (Cas9) système de défense immunitaire adaptative procaryotes a été coopté comme un outil puissant pour l’ingénierie des génomes eucaryotes précise associée. Nous présentons ici une méthode rapide et simple à l’aide de guide unique chimérique RNAs (sgRNA) et CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines (RNP) pour la production efficace et précise de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Nous décrivons un pipeline pour sélection cible sgRNA, conception de modèle de réparation axés sur l’homologie (HDR), complexants CRISPR-Cas9-RNP et livraison et une stratégie de génotypage permettant l’identification rapide et fiable des animaux correctement édité. Notre approche non seulement permet la génération facile et l’identification du point désiré de génomique des animaux mutants, mais facilite également la détection d’autres allèles indel complexe en environ 4-5 jours avec un rendement élevé et une charge de travail réduite.
Introduction
Les progrès technologiques récents ont radicalement transformé et accéléré la capacité à précisément les génomes ingénieur. En particulier, le système CRISPR-Cas9, qui repose sur l’endonucléase guidée RNA Cas9 pour induire une rupture double brin (DSB) près de la séquence cible des intérêts, a été largement utilisé à l’ingénieur avec précision le génome de la plupart des organismes modèles utilisés en recherche biomédicale1,2,3,4. Significativement, l’utilisation de CRISPR-Cas9 a débloqué génome édition même en difficiles espèces comme c. elegans5. Peu importe l’espèce, générant des mutations ponctuelles avec le génome CRISPR-Cas9 basé système d’édition s’appuie sur trois éléments de base : 1) Cas9 endonucléase, 2) un seul guide d’ARN (sgRNA) qui dirige l’endonucléase Cas9 à une séquence cible et 3) un utilisateur conçu modèle de réparation axés sur l’homologie (HDR) contenant l’edit(s) désiré d’intérêt2.
Il existe plusieurs méthodes qui peuvent servir à introduire le ciblage sgRNA et Cas9 nucléase dans les cellules, y compris le plasmide, d’ARN et de méthodes de prestation virale6. Récemment, livraison directe de pre-complexé sgRNA-Cas9 ribonucléoprotéines (RNP) a émergé comme un outil puissant et efficace dans le génome CRISPR dotés de Cas9 édition7. La prestation directe de pre-complexé CRISPR-Cas9 RNP a plusieurs avantages distincts, à savoir : 1) RNP contourner la nécessité pour la transcription cellulaire et de traduction, RNP 2) sont rapidement éliminé, ce qui peut augmenter la spécificité en réduisant le temps disponible pour hors-cible clivage et 3) RNP ne contenir aucun élément d’ADN/ARN étranger qui contourne l’introduction des séquences non indigènes dans le génome hôte grâce à l’intégration au hasard. Ensemble, ces attributs susceptibles de fournissent une courte rafale de sur-cible CRISPR édition tout en minimisant les effets hors cible.
Les auteurs décrivent un protocole simple et efficace pour introduire des changements génomiques chez c. elegans. Ce protocole comprend ciblage sgRNA et unique oligonucléotide échoués (ssODN) HDR modèle conception, complexants RNP sgRNA-Cas9 et livraison et une stratégie de génotypage pour l’identification sans équivoque des animaux bien édité. En utilisant cette stratégie, non seulement les modifications spécifiques souhaitées peuvent être récupérées, mais autres mutations non-spécifiques indel peuvent aussi être récupérées. Ainsi, notre stratégie permet la génération d’une série allélique à l’aide d’une stratégie unique, où les deux allèles mono, bi-alléliques et indel mutants peuvent être générés dans la génération de1 F.
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Protocol
Tous les soins des animaux et des procédures expérimentales a suivi la ligne directrice de la National Institutes of Health et l’Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) à l’Université du Michigan. Utiliser des solutions sans RNase et Pipeter conseils tout au long du protocole. Nettoyer la zone de travail, pipettes, tubes et centrifugeuse avec solution de décontamination de RNase en suivant les directives du fabricant (voir Table des matières).
1. sgRNA sélection de la cible
- À l’aide d’un navigateur web, ouvrez la page Web : http://crispor.tefor.net8
- Entrée ~ 60 paires de bases (PB) de séquence flanquant la modification désirée d’intérêt (c.-à-d. 30 bp 5' et 3' de l’édition souhaitée).
- Dans le menu déroulant, sélectionnez le génome de Caenorhabditis elegans .
- Sélectionnez le Motif Adjacent de Protospacer (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) dans le menu déroulant.
- Cliquez sur soumettre. Dans la page de résultats, choisissez la séquence cible de rang supérieur le plus proche de l’édition d’intérêt. S’il n’y a aucun site cible approprié au sein de la séquence d’entrée bp 60 flanquement, développez la séquence requête jusqu'à 100 bp (edit de part et d’autre de la désiréec'est-à-dire 50 bp).
- Provenant d’une source disponible, par exemple synthego, obtenir un 20-mer cible sgRNA avec les caractéristiques suivantes : 3 nmol ; aucune modification.
- Dès réception, centrifuger sgRNA lyophilisé contenant un tube à > 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Ajouter 60 µL de TE exempte de nucléase dans le tube et doucement une nouvelle suspension de pipetage et descendre de 15 à 20 fois à l’aide d’une pipette de P200. La concentration finale est 50 µM.
2. conception de modèle de réparation homologie dirigée
- Concevoir un ssODN HDR modèle contenant : 1) la mutation d’intérêt, 2) un site unique dans le cadre l’endonucléase de restriction, 3) une mutation silencieuse d’un ou deux de la Gs au sein de la séquence NGG PAM et 4) 50 bp 5' et 3' homologie armes flanquant la première et la dernière mutation. (Figure 1) 9 , 10.
- Si la mutation de la séquence NGG PAM n’est pas possible, introduire 5-6 silence mutations au sein de la séquence cible de reconnaissance de sgRNA pour empêcher le clivage induite par le sgRNA du modèle HDR ssODN.
- Provenant d’une source disponible, par exemple idtdna, obtenir un « oligonucléotide ADN Ultramer » avec les paramètres suivants : échelle : 4 nmol ; Formulation : None ; Purification : Standard dessalage.
- Dès réception, centrifuger ssODN lyophilisé contenant un tube à > 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Doucement une nouvelle suspension ssODN à une concentration finale de 100 µM dans ddH exempte de nucléase2O en pipettant également, haut et bas de 15 à 20 fois à l’aide d’une pipette de P200.
3. conception des amorces génotypage
- Concevoir une amorce réglée flanquant la modification du génome pour déclencher un ~ 400-700 bp PCR amplicon11.
- Optimiser les conditions de cyclisme de PCR pour produire un amplicon unique et spécifique à11.
4. préparer le mélange de l’Injection
- Centrifuger 1 Table réactifs à vitesse maximale pendant 2 min à 4 ° C.
- Dans l’ordre indiqué, ajouter 1 Table réactifs dans un tube PCR exempte de nucléase.
- Bien mélanger par doucement pipetage haut en bas 10 fois avec une pipette P20.
- Incuber le mélange d’injection pendant 10 min à température ambiante.
5. protocole d’injection
- Charger la micropipette d’injection avec environ la moitié du mélange injection12. Sauver le restant de mélange d’injection dans le cas où l’aiguille d’injection obstrue ou se brise.
- Casser la pointe une micropipette afin qu’environ 20-30 lb/po2 produise une progressive de la solution fluide12.
NOTE : Conseils de diamètre plus grands négativement affectent la santé animale et diminuent le rendement des descendances F1 . - Injecter 10 à 15 jeunes adultes vers de terre dans les deux bras gonadiques si possible12. Si ce n’est pas le cas, l’injection dans un bras gonadique est suffisante.
- Qu’injecté animaux (P,0) puissent récupérer pendant 1-2 h à température ambiante sur une plaque de médias (NGM) croissance nématode graines OP50 35 mm. Par la suite, injecté P0 animaux aux plaques de NGM individuels graines OP50 35 mm à l’aide d’un ver fil de platine choisir12.
6. écran P0 plaques et unique mCherry(+) F1s
- Deux jours après injection, identifier les plaques de0 P contenant des descendants de1 F exprimant mCherry dans le pharynx à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent (Figure 1, jour 2 - 3). Choisissez des plaques de0 3 P qui contiennent les plupart des mCherry(+) F1 animaux.
- Dans chacune des trois sélectionnés P0 plaques, unique 8-12 mCherry(+) F1 animaux pour un total de 24-36 mCherry(+) F1s à l’aide d’un ver prélever (Figure 1, jour 2 - 3).
Remarque : mCherry(-) animaux peut également être distingué de ces plaques de0 P, mais la probabilité d’identifier correctement édité animaux est beaucoup inférieur (Figure 2 a). - Permettre aux individuels F1s pour auto-fécondent et pondent leurs œufs pendant 1 à 2 jours à température ambiante.
7. simple ver PCR et génotypage
- Après 1 à 2 jours de la ponte, transférer la F1s dans les couvercles sur le tube de barrette de la PCR individuels contenant 7 µL de tampon de lyse ver à l’aide d’une pique de ver (tableau 2, Figure 1, jour 4-5).
- Tubes à centrifuger PCR à vitesse maximum pendant 1 min à température ambiante pour apporter des animaux jusqu’au fond du tube et geler les tubes à-80 ° C pendant 1 h.
Remarque : Les vers peuvent être stockés indéfiniment à-80 ° C. - Lyse vers congelés dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 60 ° C pendant 60 minutes, 95 ° C pendant 15 min, 4 ° C tenir.
- Set-up PCR mastermix comme indiqué dans le tableau 3.
- Ajouter 21 µL de mastermix PCR dans des tubes PCR clean et puis ajoutez 4 µL de la lyse de la vis sans fin de l’étape 3. Mélangez bien à l’aide d’une pipette et exécuter le programme PCR en suivant les directives du fabricant (voir Table des matières).
- Purifier les réactions de PCR à l’aide d’un kit ADN pur et concentré, suivant les instructions du fabricant (voir Table des matières). Éluer ADN en ajoutant 10 µL d’eau à la colonne.
- Mastermix d’enzyme de restriction mise en place comme indiqué dans le tableau 4.
- Ajouter 10 µL de l’enzyme de restriction mastermix dans chaque réaction de PCR nettoyée et incuber pendant 1-2 h à 37 ° C13.
- Separate digérés produits PCR sur un gel d’agarose de 1,5 % à 120 V à l’aide de 1 x du tampon Tris-acétate-EDTA (TAE)14.
8. identification et vérification de la séquence des animaux édité
- Examiner des échantillons d’enzyme de digestion pour la présence de bandes qui indiquent le potentiel édité animaux14 (Figure 1, jour 4-5).
Remarque : Placez un contrôle N2 pour identifier les mutations indel potentiels qui peuvent être observées comme des changements dans la taille de bande et/ou inattendue et complexe enzyme de restriction digestion, profils de bandes. - Après avoir identifié les éventuels animaux édité, utiliser le reste 3 µL de lyse ver et répétez la réaction PCR. Ne pas nettoyer ou restriction enzyme digérer la réaction PCR, une fois le programme terminé. Charger la réaction PCR sur un gel d’agarose à 1 %, séparé et extraire la bande en utilisant un gel extraction kit15 (voir Table des matières).
- Gel de Sanger séquence16 extrait l’ADN à l’aide de l’apprêt de F1 pour identifier les animaux correctement modifié (Figure 1 a)
NOTE : Hétérozygote lectures contiendra recouvert de pics en raison de la présence de la souche sauvage et machiné allèle. - Pour obtenir animaux homozygotes vérifiées animaux hétérozygotes édité, unique 8-122 animaux et effectuez les étapes 7 et 8.
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Representative Results
Mutations humaines superoxyde dismutase 1 (SOD1) représentent environ 10 à 20 % de genetique latérale amyotrophique, une maladie neurodégénérative dévastateur qui mène invariablement à la paralysie et la mort de17. SOD-1 humain est une protéine évolutivement conservée partage 55 % d’identité et 70 % de similarité avec la protéine de SOD-1 c. elegans (Figure 1 b). Afin de démontrer la simplicité, la faisabilité et l’efficacité de la gestion axée sur les CRISPR-Cas9 RNP, nous avons ciblé le gène de la sod-1 de c. elegans afin d’introduire la variante des G93A humaine associés à la maladie dans le génome du ver (Figure 1 a).
Pour concevoir la mutation G93A dans le génome de c. elegans , un sgRNA a été choisi dont site de reconnaissance du PAM trouve 3 PB en amont du codon G93 (Figure 1). Nous avons conçu un modèle réparation HDR de ssODN contenant : modifications de nucléotides 1) pour convertir le codon G93 A93 (GGA GCA), 2) un changement silencieux à la PAM NGG séquence (CGG CAG) afin d’éviter sgRNA-Cas9-mediated clivage du modèle HDR, 3) une mutation silencieuse (CT) qui lance un site d’enzyme de restriction HindIII unique pour le génotypage et 4) 50 bp 5' et 3' homologie des bras (Figure 1). Une série d’amorces PCR (F1-R1) a été conçue pour produire un seul produit PCR bp 592 dans les contrôles de N2 (Figure 1 a). Un mélange d’injection contenant le sgRNA, Cas9, ssODN et un plasmide de marqueur fluorescent (pCFJ90) ont été mélangés, incubées pendant 10 min à température ambiante et chargés dans une pipette de micro-injection.
Figure 1 illustre le flux de travail après que le mélange d’injection est chargé dans une micropipette d’injection. Jour 0, animaux0 10-15P ont été injectés dans un ou deux bras de gonades en utilisant la microinjection standard technique18,19. Injecté animaux récupérés pendant 1-2 h et ont été ensuite individuellement plaqué sur des plaques de graines OP50 NGM. Après 2 ou 3 jours, des injections de0 P réussies ont été identifiées par des descendants de1 mCherry(+) F. Les plaques de0 P trois albums (c'est-à-dire ceux qui ont le plus grand nombre de mCherry(+) F1s) ont été choisis pour une analyse ultérieure. Chacun de ces trois plaques (P0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) F1s ont été choisis pour plaques NGM individuels graines OP50 35 mm pour un total de 24 mCherry(+) F1s. Après 2-3 jours de la ponte (jour 4 - 5), la F1s individuelle ont été transférés dans des tubes PCR contenant un tampon de lyse ver et congelés pendant 1 h à-80 ° C. Par la suite, la F1s ont été lysées pour libérer l’ADN génomique et soumis à la PCR. Les produits PCR ont été ensuite purifiés et digérés avec HindIII pendant 1 h et courir sur un gel d’agarose de 1,5 % pour identifier le potentiel édité animaux. Chez les animaux correctement éditées, digestion HindIII Coupe du produit PCR pleine longueur (592 bp) en deux bandes de 370 bp et 222 bp. Cette stratégie de génotypage différencie clairement de sauvage (592 bp), hétérozygote (592, 370, 222 bp) et homozygote (370, 222 bp) animaux. Figure 2 illustre les résultats de génotypage des animaux mCherry(+) 24.
Afin de démontrer que le marqueur fluorescent mCherry enrichit de modification du génome, nous avons choisi également 8 mCherry(-) animaux de chacune des plaques0 3 P. Du 24 mCherry(+) F1s projeté (barre rouge), 10 figure allélique-mono ou bi-alléliques modification (42 %), 10 ont été de type sauvage (42 %), 3 étaient indels potentiels (13 %), et il y avait 1 défaut PCR (Figure 2 a). En revanche, le 24 mCherry(-) F1s projeté, 1 seul animal était correctement mis à jour le (4 %) ; tandis que, 23 étaient de type sauvage (96 %) (Figure 2 a). Figure 2 b montre le chromatogramme de la pleine longueur gel extrait produit de PCR (F18-6), démontrant que les modifications de nucléotides précis conçu dans le modèle HDR de ssODN ont été fidèlement incorporé dans le génome de cette F homozygote 1 animal. Notamment, les animaux de1 F 10-7, 10-8 et 12-3 exposé inattendus tailles de produit PCR et baguage des profils de restriction digest, suggérant que ces animaux peut-être porter des mutations complexes indel (Figure 2 a). Ainsi, notre méthode est non seulement capable de générer des modifications du génome souhaité avec simplicité, efficacité et fidélité, mais permet aussi l’identification et la récupération des allèles indel uniques qui peuvent excréter important et imprévu aperçu de la fonction des gènes.
Figure 1 . CRISPR-Cas9 génie de la de c. eleganssod-1 locus. (A) Illustration schématique illustrant la structure exon-intron du locus sod-1 chez c. elegans. La barre rouge indique l’emplacement du G93 dans l’exon 3. La paire d’amorces est indiqué par les flèches rouges (F1-R1). (B) l’alignement de l’homme et c. elegans (ver) SOD-1 protéines de séquence. Le résidu G93 ciblé est surligné en rouge. (C) haut, une section d’ADN génomique entourant le codon G93 apparaît comme une référence, et le PAM (verte) et des sites de cibles (bleu) sgRNA sont mises en évidence. Bas, l’homologie d’oligonucléotide brin unique (ssODN) réalisé modèle de réparation (HDR) est montré contenant : l’edit de codon changeant G93 à A93, changer le silencieux pour le motif de PAM pour éviter un clivage par le complexe sgRNA-Cas9, un silencieux changer à mettre en place un site d’enzyme de restriction HindIII unique (boîte jaune), et accompagnement 5' et 3' 50 bp homologie d’armes (barres noires). Toutes les modifications de nucléotides conçues dans la ssODN sont en surbrillance rouge. (D) illustration schématique de la canalisation pour produire et identifier des mutants de point basé sur CRISPR-Cas9 RNP. Jour 0, injecter animaux0 10-15P avec mélange d’injection. Jour 2-3, identifier animaux de0 P injectée avec succès par ceux qui contiennent des descendants de1 F fluorescent et sélectionnez plaques0 3 P avec la descendance plus fluorescente. De chacune des plaques0 3 P, single 8 fluorescent F1 la progéniture. Jour 4-5, (a) étape 1, individuel F1s sont cueillies et placés dans des tubes PCR contenant un tampon de lyse ; b étape 2, après congélation à-80 ° C, tubes PCR contenant F1 vers sont lysées pour libérer l’ADN génomique, qui est utilisé comme un modèle PCR. Les produits PCR sont ensuite nettoyés et digérés par les enzymes de restriction unique ; (c) l’étape 3, enzyme digéré produits sont réglées sur gel d’agarose cas sauvage type (+ / +), hétérozygotes (m / +), et les animaux homozygotes (m/m) peuvent être identifiés par Sommaire de restriction des patrons de bandes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Données de génotypage pour sod-1 des mutants (G93A). (A) Image de gel de F 1 les animaux qui ont été individuellement lysées, PCRed et digéré avec HindIII. Pour chaque plaque de0 P (P,0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) et 8 mCherry(-) F1 animaux ont été analysés. Les mono-alléliques (numéros de bleus) et les animaux édité bi-alléliques (chiffres rouges) ont été récupérés. Taille décalée des produits PCR ou imprévue HindIII digérées bandes ont été également récupérés qui sont indicatifs d’indel mutants (valeurs en jaune). Contrôles de N2 sont affichés comme référence pour PCR produit enzymatique de calibrage et de spécificité. (B) haut, espacement des codons et acides aminés traductions sont indiquées ci-dessus pour le type sauvage (WT) et ci-dessous pour G93A modification brins. La modification désirée est mis en évidence par un cadre rouge, et les changements silencieux qui créent un site de restriction HindIII dans leur cadre sont indiqués par une boîte jaune. Toutes les modifications de nucléotides conçus sont indiquées en caractères gras. Bas, chromatogramme représentatif de homozygote F1 animaux 8-6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Réactif | Volume | Concentration finale |
| ddH2O | 6.3 ΜL | ---- |
| KCl (4M) | 0.94 ΜL | 300 mM |
| PH 7.4 de la HEPES (0. 5 m) | 0,5 ΜL | 20 mM |
| pCFJ90 (25 ng/μL) | ΜL 1.25 | 2,5 ng/μL |
| ssODN (500 ng/μL) | ΜL 1.25 | 50 ng/μL |
| sgRNA (50 μM) | ΜL 1.25 | 5 ΜM |
| Cas9 (61 μM) | 1.03 ΜL | 5 ΜM |
| Volume final | 12,5 ΜL | ---- |
Tableau 1. CRISPR-Cas9 RNP Injection Mix. Tous les réactifs doivent être remises en suspension dans le ddH exempte de nucléase2O. RNase libres techniques devraient être utilisées lors de la manipulation des réactifs et lors de la combinaison de l’injection.
| Réactif | [Final] |
| KCl | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8,3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| NP-40 | 0,45 % |
| Tween-20 | 0,45 % |
| Protéinase K | 1 mg/mL |
Le tableau 2. Recette de tampon de lyse ver. Protéinase K devrait être ajouté frais avant chaque utilisation.
| Réactif | 1 x | 24 x |
| 2 x Q5 Mastermix | 12,5 ΜL | 300 ΜL |
| Apprêt F1 (10 μM) | ΜL 1.25 | 30 ΜL |
| Apprêt R1 (10 μM) | ΜL 1.25 | 30 ΜL |
| Lyse de ver | 4 ΜL | ---- |
| ddH2O | 6 ΜL | ΜL 144 |
| Volume final | 25 ΜL | 504 ΜL |
Tableau 3. Mastermix PCR. Le PCR mastermix doit être mélangé bien en pipettant également, jusqu'à ce que la solution soit homogène. 21 µL de la PCR mastermix doivent être ajoutés à des tubes PCR clean et puis 4 µL de lysat individuel ver doit être ajoutée à tubes correctement étiquetées.
| Réactif | 1 x | 24 x |
| 10 x tampon enzymatique | 2 ΜL | 48 ΜL |
| Réaction de PCR nettoyé | 10 ΜL | ---- |
| ddH2O | 7 ΜL | ΜL 168 |
| Enzyme de restriction (10 U/μl) | 1 ΜL | 24 ΜL |
| Volume final | 20 ΜL | ΜL 240 |
Tableau 4. Mastermix Enzyme de restriction. L’enzyme de restriction mastermix doit être mélangé bien en pipettant également, jusqu'à ce que la solution soit homogène. 10 µL de l’enzyme de restriction mastermix devrait être ajouté à 10 µL de produit de PCR nettoyé
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Discussion
Le système CRISPR-Cas9 est un outil puissant et efficace pour justement modifier le génome d’organismes modèles. Ici, nous démontrons que chimérique sgRNAs20 couplé avec ssODN HDR modèles permettent la génération très efficace de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Ce qui est important, nous démontrons que livraison RNP produit haute efficacité édition lorsque la fluorescence est utilisé comme marqueur de sélection Co, mettant en évidence la facilité et la fiabilité de la technique.
La majorité des méthodes CRISPR-Cas9 pour le génie du génome de c. elegans s’appuient sur les antécédents génétiques spécifiques ou co-CRISPR stratégies1. La méthode co-CRISPR s’est avéré pour être un outil extrêmement utile qui augmente la probabilité d’obtenir une modification du génome réussie. Toutefois, co-CRISPR méthodes nécessitent présentant un phénotype-sélectionnable edit à un locus de marqueur qui enrichit pour la modification du génome d’intérêt. Tout puissant, présentant des mutations de phénotype-roulement sélectionnables peut être indésirable si la souche d’éditer ou de la mutation de point désirée d’intérêt elle-même donne des phénotypes qui pourraient être exacerbées ou supprimées par le phénotype du marqueur. En outre, des stratégies de co-CRISPR nécessitent créant une pause supplémentaire double brin à un locus de marqueur qui peut contribuer à effets hors cible. Nous présentons ici une méthode qui utilise un marqueur fluorescent transitoire qui non seulement sert à identifier correctement injecté P0 animaux, mais enrichit également des modifications du génome appropriée. Nos résultats démontrent cette méthode considérablement enrichit pour animaux avec succès édité par rapport aux animaux non fluorescent et présente plusieurs avantages distincts : 1) seulement un ciblage spécifique au site sgRNA est requis, 2) une réduction 5 fois en Cas9 et concentration de sgRNA, 3) l’indépendance de la souche et phénotype-sélection et 4) une charge de travail nominal (~ 24 F1s). Robuste CRISPR-Cas9 génome édition dans la génération de1 F a été observée à l’aide de cette méthode. Notamment, la stratégie de détection à base d’enzymes de PCR-restriction décrite permet la détection sans équivoque des mono - et bi-alléliques animaux édité dans la génération de1 F. Enfin, la stratégie de génotypage facilite l’identification des mutations indel potentiels qui peuvent être observés comme bande PCR déplace lorsque comparés aux contrôles de N2, qui soit ne sont pas susceptibles d’être Sommaire de restriction ou de rendement complexes bandes Lorsque digérés.
L’avènement de prochaine génération séquençage couplé aux efforts de génomique à grande échelle a accéléré l’identification des variantes génomiques que de séparer avec maladie21. Cependant, les tests fonctionnels de pathogénicité n’ont pas été démontrés pour la plupart des variantes dans des systèmes modèles cellulaires et organismique. Dans cette étude, nous avons ciblé le gène de la sod-1 chez c. elegans d’introduire la largement étudiée associée à ALS SOD-1G93A mutation. A ce jour, cette mutation a été modélisée et étudiée chez c. elegans et la souris en utilisant principalement la surexpression transgénique. Bien que la surexpression des variantes dans les modèles animaux peut-être récapituler clé cellulaire, aspects moléculaires et comportements de la maladie, il est plus en plus évident que la « dose » est un facteur atténuante dans la détermination des phénotypes22. Par exemple, copie élevée nombre SOD-1G93A souris transportant ~ 24 copies du gène mutant SOD-1 humain montrent évolution de la maladie grandement accélérée par rapport à des souris de SOD-1G93Adl , qui transportent seulement environ 8-10 copies23,24. Ici, nous démontrons que notre CRISPR Cas9 RNP-méthode peut être utilisée pour générer rapidement des humaines variante associée à des mutations dans le gène de ver orthologues sans nécessiter de surexpression transgénique, dans le but de reproduire plus précisément la génétique contexte de la maladie. Notre méthode fournit une plate-forme possible pour produire et tester des variantes génomiques d’importance inconnue dans le cadre d’un contrôle réglementaire endogène et d’expression qui s’oppose à l’enceinte de la surexpression. Enfin, nous avons aussi utilisé cette méthode pour marquer les gènes endogènes avec des protéines fluorescentes (c.-à-d. GFP), qui fourniront un outil supplémentaire pour visualiser l’incidence des variantes chiffre d’affaires, agrégation et localisation des protéines.
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Disclosures
Nous remercions les membres du laboratoire Beg pour une lecture critique de ce manuscrit. Les souches ont été fournis par le centre de génétique de Caenorhabditis , qui est financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Recherche dans le laboratoire de Beg est pris en charge par des subventions du NIH (R01 NS094678) et Muscular Dystrophy Association (MDA382300) à A.A.B.
Acknowledgments
Il n’y a aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
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- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
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